动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 5: 3190 - 3200

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.297

研究论文

纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分、发酵品质、瘤胃体外降解率及微生物多样性的影响

  • 何家俊 ,
  • 赵国强 ,
  • 李莉 ,
  • 杨昕涧 ,
  • 胡志超 ,
  • 李阳源 ,
  • 解祥学 , *
展开
  • 广东溢多利生物科技股份有限公司,珠海 519060
*解祥学,高级工程师,E-mail:

何家俊(1993—),男,湖北襄阳人,硕士研究生,从事反刍动物营养研究。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2022-09-22

  网络出版日期: 2023-05-11

基金资助

农业部公益性行业(农业)专项(201503134)

国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-37)

收起

Effects of Cellulase on Nutrients, Fermentation Quality, Rumen Degradation Rate in Vitro and Microbial Diversity of Mixed Silage of Corn Straw and Distiller’s Grains

  • HE Jiajun ,
  • ZHAO Guoqiang ,
  • LI Li ,
  • YANG Xinjian ,
  • HU Zhichao ,
  • LI Yangyuan ,
  • XIE Xiangxue , *
Expand
  • Guangdong VTR Bio-Tech Co., Ltd., Zhuhai 519060, China
*senior engineer, E-mail:

Received date: 2022-09-22

  Online published: 2023-05-11

Fold

摘要

本试验旨在研究纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分、发酵品质、瘤胃体外瘤胃降解率及微生物多样性的影响。试验以玉米秸秆与酒糟混合为青贮原料,设置3个组,分别为对照组(CK组)、纤维素酶组(CE组,纤维素酶制剂添加量为50 U/g)和纤维素酶与淀粉组(CES组,纤维素酶制剂添加量为50 U/g,淀粉添加量为2%),青贮发酵30 d。结果表明:1)与CK组相比,CE组和CES组干物质和粗蛋白质含量显著提高(P<0.05),CES组可溶性碳水化合物含量有提高趋势(P=0.053)。2)与CK组相比,CE组和CES组pH极显著降低(P<0.01),且CES组pH较CE组也极显著降低(P<0.01)。与CK组相比,CES组乳酸含量和乳酸/乙酸值均极显著提高(P<0.01),氨态氮/总氮值显著降低(P<0.05),乳酸菌数量极显著增加(P<0.01),且CES组乳酸菌数量较CE组也极显著增加(P<0.01);CE组乳酸含量显著提高(P<0.05),乳酸/乙酸值有提高的趋势(P=0.064),氨态氮/总氮值有降低的趋势(P=0.089),乳酸菌数量显著增加(P<0.05)。3)与CK组相比,CE组和CES组干物质体外降解率显著提高(P<0.05),CES组中性洗涤纤维体外降解率显著提高(P<0.05),CE组中性洗涤纤维体外降解率有提高的趋势(P=0.071)。4)与CK组相比,CES组Observed_species极显著提高(P<0.01),Shannon指数有提高的趋势(P=0.088),Chao1指数和Ace指数极显著提高(P<0.01),且CES组Chao1指数和Ace指数显著高于CE组(P<0.05);CE组Observed_species有提高的趋势(P=0.079)。与CK组相比,在门水平上,CE组和CES组厚壁菌门的相对丰度显著提高(P<0.05),变形菌门的相对丰度显著降低(P<0.05);在属水平上,CE组和CES组植物乳杆菌属和柠檬乳杆菌属的相对丰度显著提高(P<0.05),布氏乳杆菌属的相对丰度显著降低(P<0.05)。综上所述,玉米秸秆与酒槽混合后添加纤维素酶和淀粉可降低青贮过程的营养损失,改善发酵品质和瘤胃体外降解率,并提高青贮饲料微生物群落的多样性及改善菌群结构,且同时添加纤维素酶与淀粉效果更优。

关键词： 玉米秸秆; 酒糟; 纤维素酶; 淀粉; 青贮发酵品质; 微生物多样性

本文引用格式

何家俊 , 赵国强 , 李莉 , 杨昕涧 , 胡志超 , 李阳源 , 解祥学 . 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分、发酵品质、瘤胃体外降解率及微生物多样性的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(5) : 3190 -3200 . DOI: 10.12418/CJAN2023.297

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of cellulase on the nutrients, fermentation quality, rumen degradation rate in vitro and microbial diversity of mixed silage of corn straw and distiller’s grains. Three groups were set, namely control group (CK group), cellulase group (CE group, supplemented with 50 U/g cellulase preparation) and cellulase and starch group (CES group, supplemented with 50 U/g cellulase preparation and 2% starch), respectively, and the silage was fermented for 30 days. The results showed as follows: 1) compared with CK group, the contents of dry matter and crude protein in CE and CES groups were significantly increased (P<0.05), and the water-soluble carbohydrate content in CES group had a trend to be increased (P=0.053). 2) Compared with CK group, the pH in CE and CES groups was extremely significantly decreased (P<0.01), and the pH in CES group was also extremely significantly decreased compared with CE group (P<0.01). Compared with CK group, the lactic acid content and lactic acid to acetic acid ratio in CES group were extremely significantly increased (P<0.01), the ammonia nitrogen to total nitrogen ratio was significantly decreased (P<0.05), the lactic acid bacteria number was extremely significantly increased (P<0.01), and the lactic acid bacteria number in CES group was also extremely significantly increased compared with CE group (P<0.01); the lactic acid content in CE group was significantly increased (P<0.05), the lactic acid to acetic acid ratio tended to be increased (P=0.064), the ammonia nitrogen to total nitrogen ratio tended to be decreased (P=0.089), and the lactic acid bacteria number was significantly increased (P<0.05). 3) Compared with CK group, the dry matter degradation rate in vitro in CE and CES groups was significantly increased (P<0.05), the neutral detergent fiber degradation rate in vitro in CES group was significantly increased (P<0.05), and the neutral detergent fiber degradation rate in vitro in CE group had a trend to be increased (P=0.071). 4) Compared with CK group, Observed_species in CES group were extremely significantly increased (P<0.01), Shannon index had a trend to be increased (P=0.088), Chao1 index and Ace index were extremely significantly increased (P<0.01), and Chao1 index and Ace index in CES group were significantly higher than those in CE group (P<0.05); Observed_species in CE group had a trend to be increased (P=0.079). Compared with CK group, at the phylum level, the Firmicutes relative abundance in CE and CES groups was significantly increased (P<0.05), while the Proteobacteria relative abundance was significantly decreased (P<0.05); at the genus level, the relative abundances of Lactiplantibacillus and Limosilactobacillus in CE and CES groups were significantly increased (P<0.05), while the Lentilactobacillus relative abundance was significantly decreased (P<0.05). In conclusion, adding cellulase and starch after mixing corn straw with distiller’s grains can reduce nutrient loss during silage, improve fermentation quality and rumen degradation rate in vitro, improve microbial community diversity and microbial structure of silage, and the effect of adding cellulase and starch at the same time is better.

Key words： corn straw; distiller’s grains; cellulase; starch; silage fermentation quality; microbial diversity

农作物秸秆主要包括小麦、稻谷、玉米、油菜籽、棉花和豆类等的秸秆,其中用于动物饲料的秸秆资源占秸秆总量的25%左右[1]。我国秸秆资源丰富,2021年主要的农作物秸秆总产量约为7.3万t,其中玉米秸秆年产量1.97万t[2],可作为反刍动物广泛的粗饲料来源。但秸秆中纤维和粗灰分含量高,蛋白质含量低,适口性差,消化率低。而槽渣类饲料主要包括白酒糟、啤酒糟、马铃薯渣、苹果渣和甜菜渣等,常用作反刍动物饲料直接饲喂,但由于其含水量高,易腐败变质,不利于长期保存。因此,将秸秆与糟渣类饲料混合青贮后饲喂反刍动物,可提高秸秆的消化率,减少资源浪费。康坤[3]研究表明,将稻草秸秆、甘薯蔓与酒糟按不同比例混合,压实密封后室温贮藏60 d,通过感官评定、营养成分及发酵品质分析得出,以鲜甘薯蔓、酒糟和稻草比例为40∶40∶20贮藏发酵青贮品质最优。农作物秸秆中含有大量的纤维素和半纤维素,且木质化程度较高,因而动物通常无法直接利用秸秆类饲料,其在反刍动物瘤胃中的降解率也非常低。秸秆与槽渣类饲料联合进行青贮发酵,能提高青贮后饲料粗蛋白质(CP)等营养物质水平,提高发酵品质。Zhao等[4]研究发现,将玉米秸秆与大豆残渣按质量比22∶78混合,装入真空袋中室温发酵8周,通过发酵指标分析,表明青贮效果良好;同时,该研究还发现,添加100 U/g的纤维素酶组乳酸菌的种类和相对丰度较对照组更高,且能够降低蛋白质等营养损失,提高饲料在瘤胃中的原位降解率,青贮效果更优。
纤维素酶能破坏植物细胞壁,将纤维降解为可利用的还原糖,并释放出蛋白质等其他营养物质,在反刍动物全混合日粮(TMR)中添加能够促进动物的生产性能[5],也是一种常见的青贮饲料添加剂。青贮过程中添加纤维素酶,可增加乳酸菌的数量和提高干物质(DM)瘤胃降解率[4];而淀粉可为微生物的生长提供发酵底物[6],可以用来提高青贮饲料品质。目前,国内外研究人员对秸秆与槽渣类饲料混合青贮做了一些研究,但具体到玉米秸秆与酒糟混合的研究还相对较少。我国玉米秸秆资源丰富,同时酒消费量巨大,产生了大量的副产物酒糟,将玉米秸秆与酒糟混合青贮发酵后作为反刍动物饲料,可有效减少资源浪费。因此,本试验旨在研究玉米秸秆与酒糟混合后添加纤维素酶和淀粉对青贮饲料营养成分、发酵品质和瘤胃体外降解率的影响,同时从微生物角度分析原因,为其在反刍动物养殖生产上的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用纤维素酶由广东某生物科技有限公司提供,酶活性≥50 000 U/g。玉米秸秆和酒糟均为普通的商业原料,其营养成分见表1。
表1 玉米秸秆与酒糟混合青贮前的营养成分

Table 1 Nutrients in corn straw and distiller’s grains before ensiling

项目
Items		 玉米秸秆
Corn straw		 酒糟
Distiller’s grains		 混合
Mixture
干物质DM/(g/kg FM) 883.70 190.62 465.83
可溶性碳水化合物WSC/(g/kg DM) 42.53 65.06 48.55
粗蛋白质CP/(g/kg DM) 51.35 270.52 100.58
中性洗涤纤维NDF/(g/kg DM) 659.94 438.09 606.78
酸性洗涤纤维ADF/(g/kg DM) 397.92 201.18 348.92

1.2 试验设计

试验设置3个组,分别为对照组(CK组)、纤维素酶组(CE组,纤维素酶制剂添加量为50 U/g)和纤维素酶与淀粉组(CES组,纤维素酶制剂添加量为50 U/g,淀粉添加量为2%)。纤维素酶和淀粉添加量以混合后的原料鲜重为基础。将玉米秸秆与酒糟混合后,各组样品分别装入3个聚乙烯袋中(混贮3个重复),分别喷洒添加剂溶液或无菌水,发酵30 d取样,每个袋取3份样品,进行指标测定。

1.3 试验方法

将玉米秸秆切成2~3 cm长小段,然后与酒槽按质量比4∶6混合均匀,按照试验设计分别将添加剂用无菌水溶解后喷洒在原料上,对照组喷洒同体积的无菌水。称取200 g左右样品,装入聚乙烯袋中,处理后用真空机抽真空密封发酵,将样品袋置于室温下避光保存30 d。

1.4 样品处理

发酵30 d后,分别称取20 g样品用于测定微生物的数量。另称取25 g样品,加入225 mL的蒸馏水,搅拌均匀及密封后于4 ℃冰箱静置24 h,然后经4层纱布和定性滤纸过滤得到浸提液,立即测定pH[7],然后于-20 ℃冷冻保存,测定乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸含量。称取5 g左右的发酵样品保存于无菌冻存管中,用于测定样品的微生物区系。将剩余的发酵饲料样品收集后,烘干、称重和粉碎,测定营养成分。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 常规营养成分分析

样品中DM含量按照GB/T 6435—2014方法测定,CP含量按照GB/T 6432—1994方法测定,中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用ANKOM纤维分析仪并结合ANKOM滤袋技术进行测定。

1.5.2 发酵品质指标测定

样品处理后的滤液pH采用pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)测定,氨态氮含量采用苯酚-次氯酸盐法测定,可溶性碳水化合物(WSC)含量采用硫酸-蒽酮比色法测定,挥发性脂肪酸含量采用高效气相色谱法测定。
将样品梯度稀释后,选择合适的稀释倍数涂布于对应的固体培养基平板上,观察菌落形态,进行微生物计数。发酵样品中乳酸菌数量的测定参考GB 4789.35—2016,酵母菌数量的测定参考GB 4789.15—2016。

1.5.3 瘤胃体外降解率测定

运用口腔取样器,采集3头西门塔尔牛瘤胃液,4层纱布过滤后置于保温瓶中,并立即带回实验室,通入二氧化碳维持厌氧条件。准确称取0.5 g烘干粉碎后的发酵样品装在中国农业大学特制的滤袋中,放入100 mL的玻璃培养管中,不加样品的过滤袋作为空白,用塑料封口机封口,每个样品6个重复,且需要3个空白袋。将过滤后的瘤胃液与缓冲液1∶1混合,取70 mL混合液加入玻璃管中,放入39 ℃恒温水浴箱中培养48 h。
体外培养后,取出滤袋,迅速用冷水冲洗,以终止反应,用水冲洗滤袋至水无色,然后置于105 ℃烘干12~24 h,称量和计算样品DM体外降解率,并用于NDF和ADF体外降解率的测定。体外降解率计算公式如下:
某营养物质体外降解率(%)=100×[样品中该营养物质含量-(未消化的该营养物质含量-空白的该营养物质含量)]/样品中该营养物质含量。

1.5.4 微生物多样性分析

将各组袋中取出的3份样品进行充分混合后,利用试剂盒进行发酵样品的微生物组DNA的提取,然后使用引物获得细菌16S rRNA基因V3~V4高变异区,经过产物纯化,根据所扩增的16S区域特点,构建小片段文库,然后利用Illumina NovaSeq测序平台进行双末端测序。测序及结果分析由北京诺禾致源生物科技有限公司完成。

1.6 数据统计与分析

试验数据均用Excel 2010进行初步处理,然后应用SPSS 22.0软件中的one-way ANOVA 过程进行单因素方差分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异显著,0.05≤P<0.10为差异有显著趋势。利用NovoMagic平台分析微生物的相对丰度,并进行操作分类单元(OTU)和alpha多样性分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分的影响

由表1和表2可知,与青贮前玉米秸秆与酒糟混合物营养成分相比,青贮后样品中DM和WSC含量均不同程度降低,但试验组较对照组损失更低。与CK组相比,CE组和CES组DM含量显著提高(P<0.05);与CK组相比,CES组WSC含量有提高趋势(P=0.053),同时CE组和CES组CP含量极显著提高(P<0.01)。添加纤维素与淀粉对玉米秸秆与酒糟混合青贮发酵后NDF和ADF含量无显著影响(P>0.05)。
表2 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分的影响

Table 2 Effects of cellulase on nutrients in mixed silage of corn straw and distiller’s grains

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CE CES
干物质DM/(g/kg FM) 436.01b 443.23a 446.31a 1.722 0.010
可溶性碳水化合物WSC/(g/kg DM) 4.92 6.38 7.51 0.475 0.053
粗蛋白质CP/(g/kg DM) 100.97Bb 106.27Aa 106.83Aa 0.952 <0.001
中性洗涤纤维NDF/(g/kg DM) 547.87 544.07 556.02 2.614 0.162
酸性洗涤纤维ADF/(g/kg DM) 351.07 350.00 361.53 2.937 0.224

同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 纤维素对玉米秸秆与酒糟混合青贮发酵品质的影响

由表3可知,玉米秸秆与酒糟混合青贮发酵30 d后各组pH均在4.2以下。与CK组相比,CE组和CES组青贮后pH极显著降低(P<0.01),且CES组pH较CE组也极显著降低(P<0.01)。与CK组相比,CES组青贮后饲料中乳酸含量和乳酸/乙酸值均极显著提高(P<0.01);CE组乳酸含量显著提高(P<0.05),乳酸/乙酸值有提高的趋势(P=0.064)。CK组、CE组和CES组青贮后样品中均未检测出丁酸。与CK组相比,CES组氨态氮/总氮值显著降低(P<0.05),CE组氨态氮/总氮值有降低的趋势(P=0.089)。与CK组相比,CES组乳酸菌数量极显著增加(P<0.01),CE组乳酸菌数量显著增加(P<0.05),同时CES组乳酸菌数量较CE组也极显著增加(P<0.01);CK组和CE组酵母菌数量都低于2.00 lg(CFU/g FM),而CES组未检测出酵母菌。
表3 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮发酵品质的影响

Table 3 Effects of cellulase on fermentation quality of mixed silage of corn straw and distiller’s grains

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CE CES
pH 3.89Aa 3.80Bb 3.76Cc 0.020 <0.001
乳酸LA/(g/kg DM) 17.54Bb 20.81ABa 23.19Aa 0.901 0.005
乙酸AA/(g/kg DM) 4.17 4.10 3.71 0.110 0.190
丁酸BA/(g/kg DM) ND ND ND
乳酸/乙酸LA/AA 4.22Bb 5.10ABb 6.26Aa 0.325 0.005
氨态氮/总氮NH3-N/TN/(g/kg) 81.06a 73.68ab 70.06b 1.903 0.021
微生物数量Microbial population/[lg(CFU/g FM)]
乳酸菌LAB 7.29Bc 7.53Bb 7.97Aa 0.103 <0.001
酵母菌Yeast <2.00 <2.00 ND

ND:未检出 not detected。

2.3 纤维素酶对玉米秸秆与啤酒糟混合青贮瘤胃体外降解率的影响

由表4可知,与CK组相比,CE组和CES组青贮饲料DM体外降解率显著提高(P<0.05);同时,与CK组相比,CES组NDF体外降解率显著提高(P<0.05),CE组NDF体外降解率有提高的趋势(P=0.071)。各组青贮饲料ADF体外降解率之间无显著差异(P>0.05)。
表4 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮瘤胃体外降解率的影响

Table 4 Effects of cellulase on rumen degradation rate of mixed silage of corn straw and distiller’s grains in vitro %

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CE CES
干物质体外降解率IVDMD 37.99b 41.11a 41.28a 0.581 0.019
中性洗涤纤维体外降解率IVNDFD 14.36b 16.15ab 16.84a 0.441 0.046
酸性洗涤纤维体外降解率IVADFD 11.41 9.25 8.33 0.636 0.123

2.4 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物多样性的影响

2.4.1 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物alpha多样性的影响

由表5可知,与CK组相比,CES组Observed_species(直观观测到的OTU数量)极显著提高(P<0.01),CE组Observed_species有提高的趋势(P=0.079);与CK组相比,CES组Shannon指数有提高的趋势(P=0.088),Chao1指数和Ace指数极显著提高(P<0.01),同时CES组Chao1指数和Ace指数显著高于CE组(P<0.05)。
表5 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物alpha多样性的影响

Table 5 Effects of cellulase on microbial alpha diversity in mixed silage of corn straw and distiller’s grains

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CE CES
Observed_species 216.33Bb 279.00Bb 497.67Aa 43.416 <0.001
Shannon指数Shannon index 1.99 2.01 3.08 0.232 0.064
Simpson指数Simpson index 0.61 0.60 0.74 0.034 0.180
Chao1指数Chao1 index 248.18Bb 330.95Bb 536.27Aa 45.596 0.002
Ace指数Ace index 268.08Bb 361.13ABb 581.43Aa 49.969 0.002

2.4.2 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物在门水平上的影响

图1显示了玉米秸秆与酒糟混合青贮后各组微生物在门水平上的菌群结构变化。由图可知,厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和脱硫菌门(Desulfobacterota)是相对丰度排前3的优势菌门。其中,与CK组相比,CE组和CES组厚壁菌门的相对丰度显著提高(P<0.05),变形菌门的相对丰度显著降低(P<0.05)。
图1 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物在门水平上的影响

Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Desulfobacterota:脱硫菌门;Cyanobacteria:蓝藻菌门;Actinobacteria:放线菌门;Unidentified bacteria:未区分的细菌;Bacteroidetes:拟杆菌门;Synergistota:互养菌门;Halanaerobiaeota:盐厌氧菌门;Chlamydiae:衣原体门;Others:其他。

CK1~CK3代表CK组,CE1~CE3代表CE组,CES1~CES3代表CES组。图2同。

Fig.1 Effects of cellulase on microflora in mixed silage of corn straw and distiller’s grains at phylum level

CK1 to CK3 represented CK group, CE1 to CE3 represented CE group, and CES1 to CES3 represented CES group. The same as Fig.2.

2.4.3 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物在属水平上的影响

图2显示了玉米秸秆与酒糟混合青贮后各组微生物在属水平上的菌群结构变化。由图可知,各组相对丰度排前3的菌属植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus)、布氏乳杆菌属(Lentilactobacillus)和柠檬乳杆菌属(Limosilactobacillus)都是乳酸发酵菌。CK组、CE组和CES组植物乳杆菌属、布氏乳杆菌属和柠檬乳杆菌属相对丰度占所有属的比例分别为54.83%、92.15%和90.62%,其中CE组和CES组植物乳杆菌属和柠檬乳杆菌属的相对丰度较CK组显著提高(P<0.05),布氏乳杆菌属的相对丰度较CK组显著降低(P<0.05)。
图2 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物在属水平上的影响

Lactiplantibacillus:植物乳杆菌属;Lentilactobacillus:布氏乳杆菌属;Limosilactobacillus:柠檬乳杆菌属;Pseudomonas:假单胞菌属;Enterobacter:肠杆菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Serratia:沙雷氏菌属;Desulfovibrio:脱硫弧菌属;Unidentified Chloroplast:未分类的叶绿体菌属;Latilactobacillus:广泛乳杆菌属;Others:其他。

Fig.2 Effects of cellulase on microflora in mixed silage of corn straw and distiller’s grains at genus level

3 讨论

3.1 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮营养成分的影响

青贮厌氧发酵过程中,微生物首先利用WSC进行增殖,同时将大分子营养物质如蛋白质、纤维和脂肪降解成小分子的氨基酸、可溶性糖和脂肪酸等,导致DM等营养物质含量的降低[2]。本试验得到相似的结果,青贮后主要营养成分DM、WSC、NDF和ADF含量均不同程度降低。前人从微观结构分析发现,玉米秸秆青贮发酵前聚合度比发酵后高13.18%,表明青贮前原料中分子链排列紧密,糖苷键数目更多,青贮后玉米秸秆内部分子链发生断裂,因此厌氧发酵过程中有营养物质的损失[8]。
玉米秸秆青贮中添加纤维素酶,能够改善青贮品质,同时降低营养物质的损失[9]。He等[10]研究发现,植物叶青贮中添加60~120 U/g的纤维素酶能提高青贮饲料蛋白质等营养物质的含量。本试验结果显示,CE组和CES组DM和CP含量较CK组显著提高。这可能是由于纤维素酶破坏了秸秆的分子结构,加快了厌氧发酵的进程,从而快速地降低pH,抑制有害微生物的生长,从而降低试验组青贮后的DM损失[11]。同时,CES组青贮WSC含量较CK组和CE组有提高趋势。Jones等[12]研究发现,黑麦草青贮中添加淀粉可以提高青贮后WSC含量,改善青贮质量。这是由于淀粉在青贮过程中水解,因此产生更多的WSC[7]。

3.2 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟青贮发酵品质的影响

优质的青贮饲料通常pH和氨态氮含量较低,乳酸含量高,几乎不产生丁酸[13]。青贮后饲料pH在3.8~4.2,pH越小说明产酸情况越好,发酵质量越好,有利于降低蛋白质等营养物质的损失。王玉荣[14]研究发现,水稻秸秆青贮添加纤维素酶后pH较对照组显著降低。李莉等[6]研究发现,象草青贮添加鲜样0.05%的纤维素酶和2%的淀粉后pH均显著降低。本试验得到类似的结果,CE组和CES组pH较CK组均极显著降低,且CES组pH较CE组也极显著降低,这表明纤维素酶能增加玉米秸秆与酒槽青贮过程中产酸,降低pH,同时添加淀粉后效果更好。
青贮过程中,乳酸菌主要利用WSC等底物产生乳酸成为优势菌群。依据发酵产物的不同,可将乳酸菌发酵划分为同型和异型发酵,同型发酵产物主要是乳酸,异型发酵产物主要是乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳等。产生的乳酸能够降低青贮pH,从而抑制其他不良菌如酵母菌、霉菌和梭菌等的生长。Zhao等[4]研究发现,玉米秸秆与大豆残渣混合添加100 U/g纤维素酶,青贮56 d后乳酸和乙酸含量均显著提高。毛建红[7]研究发现,玉米秸秆青贮中添加0.1%含纤维素酶的复合酶制剂可提高样品中乙酸含量,对乳酸含量无显著影响,但降低了乳酸/乙酸值。本试验中,与CK组相比,CES组乳酸含量和乳酸/乙酸值均显著提高;CE组乳酸含量显著提高,乳酸/乙酸值有提高的趋势,这说明纤维素能增加乳酸菌同型发酵,产生更多的乳酸,这与各组pH的结果相一致。CK组、CE组和CES组青贮样品中均未检测到丁酸,这可能因为本试验样品装入聚乙烯袋中并抽真空封口,相比于装入玻璃瓶中压实发酵,密封性更好,同时说明青贮效果更佳。
氨态氮/总氮值可以反映青贮饲料中蛋白质和氨基酸被微生物降解的情况,比值越小说明青贮过程氮的损失越小,青贮饲料质量更优[7]。青贮过程中添加纤维素酶能够提高青贮后饲料中的蛋白质含量[15],减少蛋白质被植物性蛋白酶和微生物水解成氨化物等物质[16]。He等[17]研究发现,桑叶青贮中添加50~100 U/g纤维素酶可显著降低青贮后样品中氨态氮含量。本试验中,与CK组相比,CES组饲料中氨态氮/总氮值显著降低,CE组有降低的趋势,表明添加纤维素和淀粉降低了发酵过程中蛋白质损失。其原因可能是纤维素酶和淀粉增加了乳酸菌发酵的底物,加快了乳酸的积累,降低了pH,从而抑制了有害微生物对蛋白质的水解[18]。
在青贮过程中,微生物之间相互之间竞争营养物质,乳酸菌的生长增殖对青贮发酵品质的影响至关重要。纤维素酶能够降解植物细胞壁中的纤维素,生成的葡萄糖或二糖为乳酸菌的增殖提供底物。研究表明,象草青贮中添加糖蜜可促进青贮中乳酸菌的生长[19]。本试验结果显示,与CK组相比,CE组和CES组青贮饲料中乳酸菌的数量显著增加,CES组乳酸菌的数量较CE组也显著增加。这说明纤维素酶降解植物细胞壁为乳酸菌的增殖增加了底物来源,同时淀粉可被微生物利用,进一步促进了乳酸菌的增殖。青贮饲料中的不良发酵菌主要是酵母菌、霉菌和梭菌,酵母菌属于兼性厌氧菌,厌氧时利用可溶性糖产生乙醇和二氧化碳,延缓pH下降;霉菌是饲料有氧腐败主要微生物;梭菌会利用蛋白质和可溶糖等养分发酵产丁酸、氨等难闻气体,降低青贮品质[2]。本试验中,CK和CE组酵母菌的数量低于2.00 lg(CFU/g FM),CES组未检测到酵母菌,说明试验过程密封性和青贮发酵良好。

3.3 纤维素酶对玉米秸秆与啤酒糟混合青贮瘤胃体外降解率的影响

反刍动物粗饲料的青贮发酵可看作饲料的预消化过程,通过体外发酵法测定营养物质瘤胃降解率,能反映玉米秸秆与酒槽混合青贮发酵添加纤维素酶和淀粉后的生产应用效果。吴永杰等[20]研究表明,水稻秸秆青贮添加0.3%的纤维素酶提高了青贮30 d饲料的DM体外降解率,对NDF和ADF体外降解率无显著影响。Zhao等[4]研究发现,大豆残渣与玉米秸秆混合青贮发酵添加100 U/g纤维素酶显著提高了DM和NDF体外降解率,对CP体外降解率无显著影响。本试验中,与CK组相比,CE组和CES组样品的DM和NDF体外降解率有所提高,但ADF体外降解率无显著差异。其原因可能是纤维素酶能够破坏植物细胞壁,释放出的纤维和蛋白质等营养物质更容易被瘤胃微生物利用,同时释放出植物性蛋白被青贮微生物降解并合成容易被消化的微生物蛋白,因此提高了青贮饲料在瘤胃中的DM和NDF的消化率[21]。此外,青贮饲料较高的DM含量也提高了其瘤胃DM的消化率[22]。淀粉和纤维素酶水解为青贮过程中乳酸菌的生长提供底物,促进乳酸菌等微生物的繁殖,有效破坏秸秆抗营养结构[7],释放出纤维素和半纤维素,提高NDF在瘤胃中的消化率[23]。

3.4 纤维素酶对玉米秸秆与酒糟混合青贮微生物多样性的影响

青贮发酵是植物原料利用附着的乳酸菌发酵底物产生乳酸,降低pH,且乳酸菌自身增殖成为优势菌群,同时抑制梭菌、霉菌和肠杆菌等有害菌生长的过程。因此,研究青贮饲料中微生物多样性和组成结构具有重要意义。alpha多样性可表示微生物群落多样性,反映样本内微生物群落的丰富度[24]。Observed_species表示直观观测到的OTU数量;Shannon指数表示样品中的分类总数及占比,其值越大说明多样性越高,物种分布越均匀;Ace和Chao1指数分别表示群落中OTU数量和样品所包含的物种数。Zhao等[4]研究表明,添加纤维素酶能够提高玉米秸秆与大豆残渣混合青贮样品Shannon指数和Simpson指数,表明微生物菌群多样性和丰富度增加。而Wang等[25]研究发现,添加纤维素酶降低了苜蓿青贮样品Chao1指数和Ace指数,降低了饲料微生物群落的多样性。其原因可能是纤维素酶为乳酸菌的发酵提供了更多的碳和氮来源,促进了乳酸菌的增殖和乳酸的积累,抑制了有害菌的增殖,因此降低了微生物的多样性[26]。本试验结果显示,与CK组相比,CES组Observed_species极显著提高,同时CES组Ace指数和Shannon指数提高,表明添加纤维素酶和淀粉可提高青贮微生物群落多样性。不过,纤维素酶对青贮样品alpha多样性的影响结果并不一致,这可能与青贮原料种类、含水量和添加量等有关。
青贮微生物的组成与青贮发酵品质密切相关[27-28]。厚壁菌门和变形菌门是大麦青贮饲料最重要的2个菌门,相对丰度占所有物种的99%[29]。Mu等[11]研究发现,高水分苋菜和稻谷秸秆混合青贮中最主要的菌门是厚壁菌门和变形菌门,添加纤维素酶能够提高厚壁菌门的相对丰度,并提高属水平上乳杆菌属的相对丰度。青贮中厚壁菌门最主要的菌属是乳杆菌属,直接影响青贮品质,而变形菌门所包括的大肠杆菌等革兰氏阴性菌,通常被认为是青贮有害发酵菌,包括梭菌利用可溶性糖、蛋白质和乳酸等发酵,产生丁酸。青贮早期变形菌门是占比最多的菌,发酵后期厚壁菌门代替变形菌门成为优势菌群[26]。本试验得到相似的结果,厚壁菌门和变形菌门是各组玉米秸秆与酒糟混合青贮中最主要的菌门,与CK组相比,CE组和CES组青贮中厚壁菌门的相对丰度显著提高,变形菌门的相对丰度显著降低,表明添加纤维素酶和淀粉能够促进青贮中厚壁菌门的生长,抑制不良发酵菌的增殖。与CK组相比,CE组和CES组植物乳杆菌属的相对丰度显著提高,布氏乳杆菌属的相对丰度显著降低。青贮乳酸菌可分为同型发酵和异型发酵乳酸菌,同型发酵乳酸菌如植物乳杆菌主要产乳酸,能快速积累乳酸,而异型发酵乳酸菌如布氏乳杆菌,产物复杂,主要包括乳酸、乙酸和乙醇等,产乳酸效率低[30-31]。本试验中,添加纤维素酶和淀粉可明显改善青贮发酵品质和营养损失,可能与微生物群落的变化有关,尤其是同型乳酸菌相对丰度的提高,可提高乳酸产生速率和快速降低pH,抑制有害菌对蛋白质等营养物质的降解。

4 结论

① 玉米秸秆与酒糟混合青贮添加纤维素酶和淀粉可降低营养损失,改善发酵品质和瘤胃体外降解率,同时添加纤维素酶与淀粉效果更优。
② 添加纤维素酶和淀粉能够提高青贮饲料微生物群落的多样性,提高同型乳酸发酵菌的相对丰度,并降低异型乳酸发酵菌的相对丰度。

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