新鲜度是评价食品新鲜、安全的关键指标,也是生鲜食品消费中的关键要素[1]。新鲜牛奶含有丰富的营养物质及活性成分,是人体摄入蛋白质、能量、维生素、氨基酸和矿物质的绝佳来源,且容易被吸收,尤其是面对老弱妇孺等人群[2⇓-4],在食物金字塔中扮演着重要角色[5]。牛乳中丰富的营养物质不仅能给人体提供全面的营养,也为微生物繁殖提供了底物。微生物发酵引起蛋白质变性、脂肪酸败以及碳水化合物分解等腐败反应[6⇓⇓-9],导致营养价值降低,风味消失[10],造成了巨大的食物浪费和经济损失。此外,微生物腐败过程中产生的有毒、有害物质还可能导致食物中毒,危害人们身体健康[11]。
新鲜度是衡量生乳品质的重要指标,直接影响牛奶品质和饮食健康。生乳新鲜度是指生乳因运输和贮存时间延长及环境变化所引起的表现,如果贮存时间过长,温度升高,微生物就会增殖、营养和风味变差、有害物质增多,就可判定为新鲜度欠佳。目前,奶制品行业主要依靠冷藏条件来维持生乳在贮存和运输中的新鲜度,然而,运输和贮存时间短则数个小时长则达数十个小时,期间一旦贮藏不当极易发生腐败变质。生乳新鲜度评价指标也一般来源于能表征生乳腐败、变质过程中的标志物。目前,常规评价指标主要有感官指标、菌落总数、酸度和流变学指标等[8],近年来随着检测技术的不断进步,氨基酸、脂肪酸和生物胺等新型评价指标也在快速发展。充分了解生乳新鲜度降低的过程,分析各新鲜度评价指标的影响因素,以及各项指标在评价过程中存在的问题,对于生乳贮存和保障品质具有重要的现实意义。
1 生乳新鲜度变化原理及一般过程
表1 生乳腐败、变质的一般过程Table 1 General process of raw milk spoilage and deterioration |
| 阶段 Phases | 变化规律 Change rule | 参考文献 References |
|---|---|---|
| 细菌减数 Bacteria reduction | 新鲜生乳中的天然抗菌物质,具有杀菌、抑菌作用,同时,乳中侵入的细菌 也需要适应环境才能开始生长,这一定程度上 保证了生乳的新鲜度 | [12] |
| 发酵产酸 Acid production by fermentation | 贮存时间延长,抑菌物质消耗殆尽,微生物开始快速繁殖, 乳糖分解,产生大量乳酸,pH下降 | [10] |
| 生乳发酵产酸的恶化可分为3个阶段:鲜牛奶pH 6.0~6.8; 变质牛奶pH 5.5~6.0;腐败牛奶pH 5.5以下 | [13] | |
| 随着微生物大量繁殖、积聚,生乳质量急剧下降 | [14] | |
| 蛋白质在酸性条件下发生变性,生乳凝结成网格状的凝胶状态, 出现乳凝块并伴有大量乳清析出 | [12] | |
| 中和 Neutralization | 生乳表面开始附着霉菌,最终产生浓厚的一层,生乳颜色开始 发生变化,由乳白色逐渐变为淡黄色 | [7] |
| 腐败分解 Spoilage and decomposition | 此阶段腐败严重,蛋白质和脂肪部分被完全分解为醇、醛和酮等 小分子物质,生乳分层,并具有臭味产生 | [15] |
生乳在腐败、变质过程中微生物数量、营养物质含量、感官性质和理化性质都产生了一系列变化。杜磊等[16]对不同贮存条件下的生鲜乳进行了菌落总数的测定,结果显示,4 ℃冷藏条件下,3 d后细菌开始生长;但是在常温条件下,仅1 d细菌便快速增长。营养物质含量主要变化趋势表现为逐渐降低,谷雪莲等[17]对不同贮存时间内的生乳进行了营养成分测定,结果显示,随着贮存时间的延长,生乳中的蛋白质、脂肪被不断分解,含量明显降低。营养物质含量是一个复杂的变化过程,一方面大分子营养物质含量降低,其分解产物含量增加;另一方面微生物代谢产物含量增加的同时也间接影响营养物质含量的变化,这是一个综合的连锁反应过程。乳糖在乳酸菌发酵下产生乳酸,进而降低pH导致生乳中的酪蛋白变性;微生物代谢产生的各种酶,促使蛋白质分解为氨基酸,进而被分解为有机酸、醛、醇和其他无极小分子物质[7],同时脂肪在脂肪酶和微生物的作用下被分解为脂肪酸,其含量明显降低[18]。新鲜生乳的感官特性为白色或微黄色、均一、无杂质以及是具有奶香味的不透明液体[19]。曾有报道牛乳在变质过程中随着贮存时间的延长,奶香味逐渐被酸味、哈喇味替代;有凝块或沉淀产生,乳清析出;生乳分层,且上层变为澄清液体,组织状态不均一[12,20]。生乳理化性质的改变主要有黏度、流变学特性、介电特性、酸度和pH等的变化。麦志杰等[15]研究发现,牛奶变质后黏度会大幅度上升。康霞霞[21]应用介电特性测量技术对生乳新鲜度的检测研究结果表明,随着贮存时间的增加,生乳阻抗值逐渐降低。李亮[22]利用近红外光谱技术对不同贮存时间的生乳进行了新鲜度监测,酸度在第3天迅速升高、pH迅速降低。生乳变质过程中诸多变化层出不穷,对其深入研究、解析机理和变化规律能够不断探索出新的生乳新鲜度评价指标。
2 生乳新鲜度评价指标及测定方法
目前,生乳新鲜度评价主要包括感官评价指标、微生物评价指标和理化评价指标。随着检测技术的不断发展,光谱、色谱、核磁共振以及生物传感器等新型检测方法不断与常规评价指标相结合进行评价,这极大地促进了生乳新鲜度评价的研究。新型检测技术在新鲜度领域的广泛应用,促使生乳中一些营养性评价指标也不断被发掘成为新的评价指标。
2.1 感官评价指标
表2 生乳感官评价指标要求Table 2 Raw milk sensory evaluation index requirements |
| 项目 Items | 评判标准 Evaluation criteria | 检测方法 Detection method |
|---|---|---|
| 色泽 Color | 乳白色或微黄色 | 取适量样品置于50 mL烧杯中,在自然光下 观察色泽和组织状态;闻其气味,用 温开水漱口,品尝滋味 |
| 滋味、气味 Taste and smell | 具有乳固有的香味,无异味 | |
| 组织状态 Tissue state | 均匀一致液体,无凝块、无沉淀、无正常视力可见物 |
2.2 微生物评价
生乳中丰富的营养物质是微生物生长繁殖的绝佳培养基,此外水分和高溶解氧的特性也为好氧微生物和兼性厌氧微生物提供了生存条件[24]。微生物评价是指通过检测生乳样品中的微生物数量说明生乳腐败程度,从而反映出新鲜度状况的一种评价方法。生乳在贮存过程中各类微生物都在生长繁殖,乳酸杆菌增殖产生乳酸,大肠杆菌在产酸、产气过程中发酵乳糖,降解蛋白质导致牛奶迅速腐败[11];嗜冷菌能在7 ℃及以下温度继续保持活性,分解营养物质产生代谢废物导致生乳腐败[25]。目前微生物评价在全球有着广泛的应用,所采用的微生物评价指标主要包括菌落总数、大肠杆菌数和致病菌数等。我国生鲜乳国家标准《食品安全国家标准 生乳》(GB 19301—2010)[19]指出,新鲜生牛乳菌落总数应不高于2×106 CFU/g(mL),表3 比较了不同国家生乳微生物指标[26]。
表3 不同国家生乳微生物指标比较Table 3 Comparison of microbial indices of raw milk in different countries |
| 国家 Nations | 指标 Indices | 限量 Limits |
|---|---|---|
| 中国 China | 菌落总数 | ≤2×106 CFU/mL |
| 美国 America | 菌落总数 | ≤1×105 CFU/mL |
| 加拿大 Canada | 菌落总数 | ≤1×105 CFU/mL |
新加坡 Singapore | 大肠杆菌数 | <50个/mL |
| 致病菌数 | 0 | |
| 菌落总数 | <5×104 CFU/mL | |
| 日本 Japan | 大肠杆菌数 | 0 |
| 致病菌数 | 0 | |
| 欧盟 European Union | 菌落总数 | ≤1×105 CFU/mL |
新西兰 New Zealand | 菌落总数 | ≤1×105 CFU/mL |
| 大肠杆菌数 | <100 CFU/mL | |
| 荷兰 Netherlands | 菌落总数 | ≤2.5×105 CFU/mL |
| 瑞士 Switzerland | 菌落总数 | ≤1×105 CFU/mL |
传统的微生物评价指标检测方法主要有标准平板计数法和美兰褪色实验等,这些检测方法存在操作繁琐、耗时长、不能批量操作以及对实验场地要求高等弊端,因此微生物作为生乳新鲜度评价指标已经难以应对现代化的检测需要。
2.3 理化评价指标
2.3.1 酸度
酸度是生乳新鲜度检测最直观的经典理化指标,通常采用吉尔涅尔度(°T)表示,即一定量的生乳样品中和标准氢氧化钠(NaOH)溶液的毫升数[27]。我国《食品安全国家标准 生乳》(GB 19301—2010)[19]中规定,生乳的酸度为12~18 °T。生乳在贮存、运输过程中受温度和时间的影响,酸度会升高,新鲜度下降。在正常酸度范围内,数值越低表明生乳越新鲜,反之越差。Lu等[10]研究发现,牛奶腐败后酸度会增加,说明可以通过酸度定量分析生乳新鲜程度。李亮[22]通过傅里叶近红外光谱结合人工神经网络建立了酸度、pH及乳糖的定量分析模型,研究发现,在4 ℃冷藏条件下,酸度在第3天开始急剧升高,在第7天时,腐败程度已经非常严重。Schmidt等[28]研究发现,生乳在5.5 ℃条件下贮藏5 d,滴定酸度从15 °T增加到了17 °T。O’Connell等[29]发现,生乳在低于5.5 ℃的条件下贮藏4 d以内一般不会发生严重酸败。Wang等[6]通过近红外光谱技术利用酸度快速分析了生乳的新鲜度,结果显示,前2 d生乳新鲜度保持较好,第3~6天生乳开始发生酸败,第7~8天开始腐败,平均酸度为19.1 °T,大于18 °T。
2.3.2 pH
常规pH的测定方法主要包括pH试纸法和酸度计法等,随着检测技术的升级,pH也同新型检测仪器相结合共同评价生乳新鲜度。李亮[22]通过近红外光谱技术对pH定量建模分析发现,pH随贮藏时间的增加持续降低,生乳新鲜度相应降低。Al-Qadiri等[32]对不同温度和贮存时间下牛奶样品的光谱、pH进行了检测,并建立了新鲜度评价分析的统计模型。刘梅红[31]基于低场核磁共振技术结合化学计量法建立了鲜牛奶的pH预测模型,结果显示,随着冷藏天数的增加,鲜牛奶的pH也在逐渐下降。Weston等[10]基于聚二乙炔开发比色传感器对牛奶乳酸浓度进行了检测,可以实时显示牛奶的新鲜度,通过颜色蓝、紫和红进行区分新鲜牛奶(pH 6.8~6.0)、变质牛奶(pH 6.0~4.5)和腐败牛奶(pH 4.5以下)。Choudhary等[14]利用开发的单一、双重荧光基团pH传感器,可以快速检测牛奶的pH,反映出牛奶的新鲜度程度。Ma等[13]开发了pH响应性的纳米粒子可以和花青素结合反应,变质牛奶呈现微红色,而新鲜牛奶颜色不发生变化。据报道,由黑胡萝卜提取出的花青素与淀粉结合制备的传感器标签与巴氏杀菌乳的pH呈现高度正相关,表明可通过标签的颜色变化判别牛乳的新鲜程度[33]。传感器与pH结合在生乳新鲜度评价领域具有快速的优势和广阔前景。
生乳的pH随泌乳阶段呈浮动变化,初乳pH为6左右,泌乳早期pH迅速上升,一段时间后达到正常约为6.7,此后变化幅度较小。泌乳后期由于乳腺细胞膜衰退,生乳pH上升至7.2左右接近血液pH。不过,pH和酸度相同都受到温度、季节等多种因素影响,作为生乳新鲜度评价指标也具有相似的弊端。
2.3.3 流变学特性
流变学是关于物质变形和流动的科学,应用在食品领域常定义产品的稠度,采用黏度(粗糙、缺乏润滑)表示。流体在剪切力的作用下,产生连续不断的变形以抵抗外力,即是黏度的具体表现。黏度的检测方法主要有黏度计法和公式计算法,公式法常采用泊肃叶公式计算[15]。公式如下:
qv= ( )。
式中:qv为单位时间内通过横截面为S的液体体积,简称流量;R为圆形管道的半径;p1-p2为管道2端的压强差;l为管道的长度。
2.3.4 介电特性
2.4 营养性评价指标
2.4.1 乳糖
乳糖是哺乳动物乳汁中特有的碳水化合物,是由葡萄糖和半乳糖组成的双糖。随着贮存时间的延长,乳糖被微生物分解为乳酸,其含量降低,所以可以用生乳中乳糖的含量来判断新鲜度[11]。奶中乳糖测定的方法主要有滴定法、分光光度计测定法、比色法和高效液相色谱法等[36-37],这些测定方法具有操作复杂、耗时长和操作要求高等弊端。李亮[22]通过近红外光谱技术建立了牛奶中乳糖含量定量分析模型,结果显示,乳糖含量随贮存时间的延长明显降低。Wang等[6]同样利用近红外光谱技术建立了牛奶中乳糖含量的定量分析模型,结果表明,乳糖含量随贮存时间的延长而减少。乳糖与近红外光谱等新型检测技术结合建立相应的分析模型可以更加准确、快速和高通量地评价生乳新鲜度。
2.4.2 脂肪酸
脂肪酸是乳脂的基本组成单位,生乳中约有98%的脂肪酸以结合态的形式存在[38-39]。随着贮存时间的延长,生乳中的脂肪酸在脂肪酶和微生物的作用下被分解产生游离脂肪酸,通过定量检测游离脂肪酸的含量也可以反映生乳的新鲜度[40]。Fromm等[41]对巴氏杀菌乳货架期新鲜度研究发现,随着贮存时间的延长,乳中的游离脂肪酸含量显著增加。Loffi等[42]通过高效液相色谱-质谱代谢组学对冷藏条件下的巴氏杀菌乳进行了新鲜度指标筛选,油酸等8种脂肪酸含量随贮存时间的延长显著增加,可以作为新鲜度评价的指标。Ukeda等[43]曾对牛乳样品中的游离短链脂肪酸进行了测定,结果表明游离短链脂肪酸可以用于牛乳样品新鲜度的判断。脂肪酸定量检测具有高通量、准确的优势,但是前处理复杂,步骤繁琐且耗时长的弊端也非常明显。
2.4.3 氨基酸
氨基酸是一类带有羧基(—COOH)和氨基(—NH2)的有机化合物的通称,是蛋白质的组成单位。生乳中蛋白质含量丰富,随着贮存时间的延长乳蛋白在蛋白水解酶的作用下分解为多肽,随后经过肽酶分解为短肽,最后降解为游离氨基酸[44]。赵瑞[44]基于高效液相色谱-质谱技术对生乳中的游离氨基酸进行了测定,结果显示,在20 ℃条件下,游离氨基酸含量随时间的延长呈现逐渐增加趋势,且在20 ℃条件下生乳中的游离脂肪酸含量远远大于在4 ℃冷藏条件下的游离脂肪酸含量。生乳中的游离氨基酸可以在内源酶和微生物酶的作用下脱羧降解为生物胺,研究发现,游离脂肪酸含量在4 ℃冷藏条件下呈不规律变化趋势,因此作为生乳新鲜度评价指标缺乏准确性。
2.4.4 生物胺
生物胺是食品新鲜度评价的重要指标,在鱼类、肉类新鲜度评价领域有着广泛的应用,它是游离氨基酸在微生物酶的作用下脱羧降解形成的[45-46]。据报道,乳中生物胺含量在冷藏条件下变化规律简单,其中腐胺与尸胺随温度变化最为明显,与感官指标、酸度呈现良好的正相关,且方法容易定量检测,具有成为评价生乳新鲜度的潜力[47]。赵瑞[44]对生乳中腐败标志物的筛选研究发现,无论是在4 ℃冷藏条件下还是在20 ℃常温条件下,生物胺含量均随贮存时间的延长而增加,温度越高增加速度越快,并且筛选出腐胺和尸胺可以作为生乳腐败的标志物。Meng等[48]通过一种双通道荧光纳米探针(由甲基红修饰的碳量子点构成)对生物胺进行了检测,试验结果表明,随着生物胺中的酪胺含量增加,检测样品在紫外灯照射下由原本的橙色变为蓝色,色胺和二甲胺也具有同样的显色变化。此检测方法快速、准确并伴有颜色变化,易于观察。
2.5 其他指标评价
此外,用于生乳新鲜度评价的指标还有滋味、气味等。生乳中的中级分解产物游离脂肪酸经过氧化可以继续降解为醇、酯、醛和酮等物质,这些挥发性物质可以产生不良气味,从而判断新鲜程度[42,49-50]。庞旭欣等[51]利用气体传感器阵列来检测牛奶新鲜度的变化,采用逐步判别法、最小二乘法和贝叶斯(Bayes)判别算法对数据进行分析,能够较好地分析纯牛奶的新鲜度。Sim等[52]基于模式识别原理通过测量味觉传感器中的脂质膜和待测物质相互作用产生的电势来区分新鲜牛奶和变质牛奶,可以有效检测牛奶新鲜度。施玉佳[18]基于近红外光谱技术对牛奶新鲜程度进行了预测,根据吸光度光谱结合偏最小二乘法(PLS)建立了蛋白质和脂肪定量预测模型,结果显示,可以清楚地判断出生乳的腐败程度。
3 小结与展望
生乳新鲜度是一个不确定的定义,很难准确地度量,这种不确定性增加了原料乳收购的风险。生乳在新鲜度降低过程中微生物数量、理化特性、感官特性和营养物质含量等都发生了一系列变化,生乳新鲜度评价指标就来源于能够表征这些变化的标志物。目前,生乳新鲜度评价还是以感官指标、酸度和菌落总数等经典指标为主,虽然这些评价指标发展较为成熟,但是同样具有一定的局限性,如主观性强、准确性低、操作繁琐、耗时长和难以批量操作等。经典评价指标已经难以适应现代化的检测需求,随着新型检测技术在新鲜度评价领域的广泛应用,诸如生物胺等小分子物质不断被发掘,生乳新鲜度评价指标也在快速发展。后疫情时代下,具有新鲜、营养增强体质的奶制品越发成为人们青睐的食物[53]。这对生乳新鲜度评价提出了挑战和要求,亟需探索出准确、快速、简便和直观的评价指标。
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