硒是家禽生长过程中不可或缺的微量矿物质元素之一,并且硒具有抗氧化、提高机体抗病力、增加家禽产蛋量以及提高家禽肉质中的蛋白质含量等多种功能[1]。同时我国家禽饲粮以玉米-豆粕型为主,难以满足家禽对硒的需要量[2]。富硒饲粮作为近年热门的畜禽饲粮有很高的生物学效价和抗氧化性能,本项目把运用富硒饲粮提升禽类体内硒含量及提升机体抗氧化应激能力作为相关研究的主要内容。
康乐黄鸡目前为赣西地区的主要养殖鸡种,因其耐粗饲、适应性广、抗病力强、易饲养[3]的特点,且家禽的氧化系统和抗氧化系统的平衡是保持健康的重要因素,因此康乐黄鸡是一种研究氧化应激的良好模型。而生产上这种平衡往往会因为各种应激源的存在而被打破[4],这会导致过量自由基的积累,它们具有极强的氧化能力,可导致DNA的复制异常,同时引起细胞膜通透性的改变[5]。一般机体在正常情况下,本身的抗氧化系统基本上可以清除体内产生的自由基以及由自由基引起的过氧化物[6]。但是在很多时候,很多外因会造成体内自由基的大量增加,长时间受过量自由基的危害会影响机体对自由基的清除能力进而导致细胞氧化应激[7],所以随时清除体内的自由基,保持机体内环境的相对平衡是非常重要的[8]。试验所用的氧化应激诱导剂Diquat(敌草快)是一种联吡啶类除草剂,在农业生产中非常常见,其可诱导机体发生氧化应激反应[9]。
氧化应激会对细胞造成损伤,为了维持稳定的状态和对各种刺激作出反应,相关基因会表达相关蛋白严格控制损伤细胞的死亡,这样的一个过程叫做细胞凋亡[10]。这个过程受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族、p53、核转录因子-κB(NF-κB)、泛素蛋白体系统和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径等蛋白质的调控,本研究将利用其中Caspase-3和NF-κB这2种蛋白探讨富硒饲粮改善细胞凋亡的情况。
由于Diquat的广泛应用,当今禽类养殖业广受氧化应激带来的影响,给养殖行业带来了巨大的经济损失。本研究拟探讨富硒饲粮对鸡心脏氧化应激和细胞凋亡率的改善作用,这对于减轻禽类氧化应激对心血管系统的损伤具有重要意义,也为研究富硒饲粮改善鸡氧化应激和细胞凋亡率相关研究的开展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
将购自江西省某鸡场同一批次(180日龄)、体重为(1.1±0.1) kg且健康的40只康乐黄鸡随机分成4组,每组5个重复,每个重复2只鸡,分别标记为A、B、C、D组。A组为对照组(基础饲粮+腹腔注射生理盐水),B组为Diquat诱导氧化应激组(基础饲粮+腹腔注射Diquat),C组为对硒拮抗Diquat诱导氧化应激组[添加亚硒酸钠饲粮(0.5 mg/kg硒)+腹腔注射Diquat],D组为硒组[添加亚硒酸钠饲粮(0.5 mg/kg硒)+腹腔注射生理盐水]。经适应性饲养1周后,A、B组饲喂基础饲粮,C、D组饲喂添加亚硒酸钠饲粮,饲喂14 d后腹腔注射15 mg/kg BW生理盐水或Diquat 4 d,试验结束时将4组鸡全部处死。正式试验期18 d。
1.2 主要试剂
TRIZOL、RNA酶抑制剂购自宝生物工程有限公司,水饱和酚、醋酸钠购自生工生物工程股份有限公司,反转录试剂盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自生物科技股份有限公司,牛血清白蛋白、Tris缓冲盐溶液(TBS)、含吐温-20的Tris缓冲盐溶液(TBST)、苏木精、伊红购自北京索莱宝科技有限公司,石蜡、中性树脂胶购自北京中杉金桥生物技术有限公司,总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白工作液购自北京普利莱基因技术有限公司,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒、Rabbit anti-StAR antibody、Mouse anti-β-Actin antibody、蛋白预染Marker、发光液购自武汉博士德生物工程有限公司,HRP-Goat anti-Rabbit IgG、HRP-Rabbit anti-Mouse IgG购自艾博抗贸易有限公司,过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3 样品采集
各组鸡经颈动脉放血致死后,利用经高压灭菌的解剖刀、解剖剪和解剖镊等无菌器械采集心脏组织,然后用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗干净后将心脏组织分成2部分,一部分修整成1 cm×1 cm左右大小的组织块,放入到事先配制好的4%多聚甲醛溶液中进行固定,用于后续的组织学试验;另一部分用刀片切成小块,分成2份,分别放入到2个无菌无RNA酶的冻存管中,迅速放入到液氮中速冻,然后再转移到-80 ℃冰箱中保存,分别用于提取组织总RNA和总蛋白。
1.4 组织切片及苏木精-伊红(HE)染色
将前期经4%多聚甲醛溶液固定好的心脏组织经缓水流冲洗24 h去除固定液,上行梯度乙醇脱水,在二甲苯和乙醇混合液中处理10 min,随后放入二甲苯进行透明,处理好后开始梯度浸蜡,浸蜡结束后用提前制好的混合蜡填充组织包埋框,将组织夹入其中制作成石蜡组织包埋块,包埋好的石蜡块用切片机切成厚度为5 μm切片,后将制好的切片进行HE染色并封片观察。
1.5 脱氧尿嘧啶(dUTP)缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡
将4%多聚甲醛溶液固定的心脏样本在石蜡包埋切片(5 μm)后,按照末端脱氧核苷酸转移酶介导的TUNEL测定试剂盒的说明操作,通过TUNEL检测细胞凋亡。将心脏组织切片脱蜡,再水化,用蛋白酶k溶液在37 ℃下孵育20 min。PBS洗涤3次(每次5 min),每张切片滴加25 μL TUNEL反应混合物(酶液与标记液1∶9混合)在37 ℃下孵育2 h。随后再次洗涤3次,37 ℃与Converter-POD[抗荧光素抗体,绵羊Fab片段,与辣根过氧化物酶(POD)偶联]孵育,30 min后,用PBS冲洗切片,并对每张切片滴加50 μL DAB底物,室温 (约25 ℃)下反应10 min。最后对切片进行苏木精复染,脱水透明后装片。阴性对照切片不与TUNEL反应混合,而是与标记液等量孵育。计数TUNEL阳性(细胞核染成棕色)心脏细胞的数量。每张切片随机选取10个视野(400×)计算凋亡率,计算公式如下:
凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100。
1.6 抗氧化指标测定
采用紫外分光光度计测定心脏中CAT活性和MDA含量,具体步骤按照试剂盒说明进行。
1.7 Western blot
将心脏组织从-80 ℃超低温冰箱取出,每只鸡取0.04 mg心脏样品于匀浆器中,用总蛋白提取试剂盒提取蛋白,上样前用蛋白定量试剂盒将各组的蛋白上样量统一调整为10 μg,然后按1∶4的比例加入5×上样缓冲液并95 ℃变性5 min。根据蛋白的分子质量大小提前配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶,电泳150 min后电转80 min,等蛋白全部转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,PVDF膜稍加漂洗后用5%的脱脂奶粉封闭2 h,Tris-HCl缓冲盐溶液漂洗3次,每次10 min后,放入配好的一抗,4 ℃孵育17 h,TBST漂洗3次后根据不同一抗来源放入不同抗小鼠的免疫球蛋白G(IgG)孵育2 h,TBST漂洗3次后,最后通过超敏化学发光检测试剂盒及多功能成像仪检测目的蛋白NF-κB和Caspase-3的表达情况,并以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参蛋白,采集的图片用Image J软件进行灰度值分析。
1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
使用TRIZOL试剂提取总RNA,然后用HiScript®Ⅱ QRT SuperMix for qP-CRR222-01反转录成cDNA。 反应总体系为10 μL,其中2 μL 5×PrimeScriptTM RT En-zyme Mix Ⅰ和8 μL RNA液(总量500 ng),反应条件为37 ℃反应15 min,85 ℃反应5 s,得到的cDNA液加入20 μL ddH2O,混匀,用于RT-qPCR。根据GenBank库中上传的所需基因的mRNA序列,利用Primer 6.0软件设计相对应的引物,设计出的引物在GenBank库中经比对之后,筛选出最佳的引物序列,将筛选出的引物序列发送至深圳华大基因股份有限公司进行合成的基因序列,试验所用的引物序列如表1 所示。采用ChamQTM SYBR® qPCR Master MixQ311-02试剂盒,反应体系为10 μL,包括5 μL 2×SYBR® primix Ex Taq TM Ⅱ、4 μmol/L上、下游引物各1 μL、2.8 μL cDNA溶液和0.2 μL 50×ROXReference Dye 1,在StepOnePlus荧光定量PCR仪进行反应。反应程序为:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s,68 ℃退火30 s,40个循环反应。试验结束后,将各样品的Ct值导出分析,采用2-ΔΔCt法计算。RT-qPCR相关基因引物序列见表1 。
表1 RT-qPCR相关基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences for RT-qPCR |
| 基因名称 Gene names | 引物序列 Primer sequences (5'—3') | GenBank登录号 GenBank accession No. |
|---|---|---|
| 核转录因子-κB NF-κB | F:TCAACGCAGGACCTAAAGACAT R:GCAGATAGCCAAGTTCAGGATG | NM_205134.1 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 Caspase-3 | F:AAGGCTCCTGGTTTATTC R:CTGCCACTCTGCGATTTA | NM_204725.1 |
| β-肌动蛋白 β-actin | F:CAGCCATCTTTCTTGGGTAT F:CTGTGATCTCCTTCTGCATCC | NM_205518.1 |
1.9 图像与数据统计分析
将采集到的图片用Image J软件分析取值,所有数据均用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析,最小显著性差异法(LSD)进行多重比较,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。利用GraphPad Prism 9.0绘制出柱状图。
2 结果与分析
2.1 富硒饲粮对康乐黄鸡心脏组织病理变化的影响
结果显示,与A组相比,B组中心肌纤维之间的小血管中出现大量红细胞,心脏组织界限不清、心肌纤维间隙增宽和心肌纤维断裂等病理情况;C组和B组相比,能明显发现心脏组织界限更加清楚,断裂的心肌纤维虽仍存在但明显更少;最后对比D组和A组能明显发现D组组织轮廓更加清晰。以上结果表明,饲喂富硒饲粮能改善氧化应激对康乐黄鸡心脏的组织学结构造成的损伤(图1 )。
图1 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏组织的影响(HE染色)A:A组(对照组)心脏的HE染色;B、C:B组心脏的HE染色;D、E:C组心脏的HE染色;F:D组心脏的HE染色。 Fig.1 Effects of selenium-enriched diets on heart tissues of Kangle yellow chickens under oxidative stress (HE staining) A: HE staining of heart in group A (control group); B, C: HE staining of heart in group B; D, E: HE staining of heart in group C; F: HE staining of heart in group D. |
2.2 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏细胞凋亡的影响
结果显示,与A组相比,B组心脏细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),C组比B组细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)(图2-E ),A组偶见TUNEL阳性细胞,图2-A ~图2-D 可见正常细胞核为蓝色,而TUNEL阳性细胞核呈棕色,且具有核染色质浓缩、边集或碎裂等形态特征。TUNEL阳性细胞数量的情况,可用凋亡率来表示,凋亡率越高,TUNEL阳性细胞的数量越多,饲喂富硒饲粮能降低氧化应激康乐黄鸡心脏的细胞凋亡率。
图2 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏细胞凋亡的影响A:A组(对照组)心脏的细胞凋亡情况;B:B组心脏的细胞凋亡情况;C:C组心脏的细胞凋亡情况;D:D组心脏的细胞凋亡情况;E:各组心脏细胞凋亡率。 *:P<0.05; **:P<0.01。下图同。 Fig.2 Effects of selenium-enriched diets on cell apoptosis in heart of Kangle yellow chickens under oxidative stress A: cell apoptosis of heart in group A; B: cell apoptosis of heart in group B; C: cell apoptosis of heart in group C; D: cell apoptosis of heart in group D; E: cell apoptosis rate of heart in each group. *: P<0.05;**:P<0.01. The same as below. |
2.3 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏抗氧化指标的影响
结果显示,与A组相比,B组心脏CAT的活性显著降低(P<0.05),C组比B组心脏CAT活性极显著升高(P<0.01),D组比A组心脏CAT活性显著升高(P<0.05);与A组相比,B组心脏MDA含量显著升高(P<0.05),C组比B组心脏MDA含量极显著降低(P<0.01),D组比A组心脏MDA含量显著降低(P<0.05)(图3 )。
2.4 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏相关凋亡蛋白相对表达量的影响
结果显示,康乐黄鸡心脏Caspase-3和NF-κB蛋白相对表达量在A组和B组、C组和D组间并无统计学上的差异(P>0.05)(图4 )。
图4 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏相关凋亡蛋白相对表达量的影响Caspase-3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3; NF-κB:核转录因子-κB nuclear transcription factor-κB; β-actin: β-肌动蛋白。下图同 the same as below。 Fig.4 Effects of selenium-enriched diets on relative expression levels of related apoptotic proteins in heart of Kangle yellow chickens under oxidative stress |
2.5 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏相关凋亡基因相对表达量的影响
结果显示,与A组相比,B组心脏NF-κB和Caspase-3的mRNA相对表达量显著上升(P<0.05);但与B组相比,C组心脏NF-κB和Caspase-3的mRNA相对表达量均显著下降(P<0.05);D组心脏NF-κB和Caspase-3的mRNA相对表达量比A组均显著下降(P<0.05)(图5 )。
3 讨论
硒是动物体内一种必需的微量元素,在动物成长过程中起着抗氧化和抗应激的重要作用。而随着现代养殖业的高速发展,人们对畜禽的要求和需求量也越来越高,但在畜禽生长繁殖过程中,会受到生活环境中多方面的因素影响,农药Diquat诱导的氧化应激就是其中一种,白丽花等[11]的研究表明,当机体遭受Diquat的刺激时,机体会产生过量活性氧,造成细胞膜的损伤和破坏信号通路,从而诱导细胞发生氧化应激。有研究表明,硒能够缓解Diquat引起的氧化应激[12]。硒能促进畜禽生长发育的一种机制就是清除体内氧自由基和过氧化物,保护细胞膜,促进蛋白质合成[13]。本试验结果表明,氧化应激对心脏的结构有一定的影响,而硒能提高机体抗氧化的能力,缓解其对心脏的损伤。
氧化应激是心脏损伤的主要病理因素。抗氧化指标在很大程度上反映了机体的健康状况,畜禽体内通常存在多种抗氧化酶来调节氧化应激带来的影响。多项研究表明,硒可通过激活抗氧化系统来提高抗氧化酶活性,缓解氧化应激,提高机体抗氧化能力[14]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、CAT是动物机体主要的抗氧化酶,它们的活性影响机体内的活性氧自由基水平以及脂质过氧化终末代谢产物MDA含量。硒是GSH-Px的组成成分,缺硒直接导致GSH-Px活性降低[15]。虽然硒不是CAT的组成成分,但畜禽在缺硒状态下组织合成各种抗氧化酶的机能会下降,导致机体产生的氧离子和过氧化氢不能及时清除,导致脂质过氧化增强,机体活性氧自由基水平和MDA含量显著升高[16]。本试验研究表明,氧化应激对心脏的结构有一定的影响,而饲粮加硒对心脏中CAT的活性有明显改善,并且使心脏MDA含量降低,提高了心脏的抗氧化能力。这说明通过富硒饲粮的喂饲,硒能提高机体抗氧化能力以保护其免受氧化应激的损伤。
细胞凋亡是机体为了维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的程序性死亡[17],它能帮机体清除老化和坏死的细胞,但在组织受到刺激损伤时凋亡的细胞会大大增加[18]。有研究表明,适量硒能促进细胞增殖,抑制其凋亡[19]。本试验通过TUNEL结果也证明了这一研究观点,结果表明氧化应激能导致心脏凋亡细胞比例增加,而饲粮加硒很大程度上抑制了心脏细胞凋亡的发生。相关凋亡蛋白Caspase-3通过启动外源性细胞凋亡传导通路及间接启动内源性细胞凋亡传导通路,在细胞凋亡的过程中发挥关键作用[20],RT-qPCR结果显示,心脏中的Caspase-3和NF-κB mRNA相对表达量在各组间都有明显差异,与A组相比,氧化应激使Caspase-3和NF-κB的mRNA相对表达量明显上升,而C组与B组相比,Caspase-3和NF-κB的mRNA相对表达量明显下降,但Western blot结果显示,心脏Caspase-3和NF-κB蛋白相对表达量在组间无显著差异,这其中原因将在未来进一步进行探究。该研究结果说明,富硒饲粮能改善Diquat诱导的心脏氧化应激以及抑制氧化应激引起的机体内细胞凋亡。
4 结论
饲喂富硒饲粮能提高心脏抗氧化能力以保护其免受氧化应激的损伤,并且富硒饲粮可以抑制氧化应激导致的细胞凋亡。
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