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2023 , Vol. 35 >Issue 6: 3978 - 3990

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.369

研究论文

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中4种林可胺类药物

  • 王凤芹 ,
  • 开丽霞 ,
  • 程远之 ,
  • 汪以真 , *
展开
  • 浙江大学动物科学学院,教育部动物分子营养学重点实验室,农业农村部华东动物营养与饲料重点实验室,浙江省饲料与动物营养重点实验室,杭州 310058
*汪以真,教授,博士生导师,E-mail:

王凤芹(1976—),女,湖北黄梅人,高级实验师,博士,主要从事动物营养与饲料分析方法建立研究。E-mail:

收稿日期: 2023-01-28

  网络出版日期: 2023-06-08

基金资助

现代农业生猪产业体系(CARS-36)

收起

Simultaneous Determination of 4 Lincosamides in Feed by Solid Phase Extraction-Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

  • WANG Fengqin ,
  • KAI Lixia ,
  • CHENG Yuanzhi ,
  • WANG Yizhen , *
Expand
  • Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science of Zhejiang Province, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in Eastern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition, Ministry of Education, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
*professor, E-mail:

Received date: 2023-01-28

  Online published: 2023-06-08

Fold

摘要

本研究旨在建立一种同时准确测定饲料中4种林可胺类药物(林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素)的方法。饲料中林可胺类药物用甲醇-0.1 mol/L磷酸氢二钾(8∶2,体积比)缓冲溶液提取,提取液经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化,采用C18色谱柱分离,流动相为0.1%甲酸溶液和乙腈,梯度洗脱,以电喷雾离子源(ESI)正离子扫描方式,在多反应监测(MRM)模式下进行测定,外标法定量。结果表明:本研究建立的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(SPE-UPLC-MS/MS)法对饲料中林可胺类药物检出限为10 μg/kg,定量限为40 μg/kg;4种林可胺类药物在1~200 μg/L浓度范围内,线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.99;在4个浓度水平(40 μg/kg、400 μg/kg、4 mg/kg和100 mg/kg)下进行添加试验,林可胺类药物的回收率为81.5%~107.6%,相对标准偏差(RSD)为1.4%~9.8%。由此可见,本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS法灵敏、可靠,可应用于饲料中4种林可胺类药物的准确测定。

关键词： 固相萃取; 超高效液相色谱-串联质谱法; 饲料; 林可胺类药物

本文引用格式

王凤芹 , 开丽霞 , 程远之 , 汪以真 . 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中4种林可胺类药物[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(6) : 3978 -3990 . DOI: 10.12418/CJAN2023.369

Abstract

The aim of this study was to establish a simultaneous and accurate method for the determination of 4 lincosamides (lincomycin, clindamycin, clindamycin phosphateand and pirlimycin) in feed. Lincosamides were extracted from feed by methanol-0.1 mol/L dipotassium hydrogen phosphate (8∶2, volume ratio) buffer solution, and the extracted solution was purified by mixed strong cation exchange solid phase extraction cartridge. Then the lincosamides were separated by a C18 column with gradient elution using 0.1% formic acid solution and acetonitrile as mobile phase and finally confirmed and quantified by external standard method in multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ion source (ESI) positive ion scanning mode. The results showed that the limits of detection and quantitation of lincosamides in feed were 10 and 40 μg/kg respectively by solid phase extraction-ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-UPLC-MS/MS) method built in this study; the linear relationship was good in the concentration range of 1 to 200 μg/L, and the correlation coefficient (R2) was greater than 0.99; at the four spiked levels (40 μg/kg, 400 μg/kg, 4 mg/kg and 100 mg/kg), the recovery rate of lincosamides was 81.5% to 107.6%, and the relative standard deviation (RSD) was 1.4% to 9.8%. As a result, the SPE-UPLC-MS/MS method built in this study was sensitive and reliable for the accurate determination of 4 lincosamides in feed.

Key words： solid phase extraction; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; feed; lincosamides

林可胺类药物(lincosamides)是一类抑菌性抗菌药物,主要包括林可霉素(lincomycin)、克林霉素(clindamycin)、克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)和吡利霉素(pirlimycin)[1⇓⇓⇓⇓-6]。林可胺类药物曾广泛用于治疗畜禽的呼吸道疾病和肠道细菌感染,也用于饲料添加剂,用来促进畜禽生长,提高饲料转化率[7-8]。然而,林可胺类药物等抗生素在饲料中的不合理及违法使用带来了抗生素在食物中残留、细菌耐药性以及环境污染等系列问题[9⇓-11]。我国农业农村部公告第194号规定,自2020年1月1日起,退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,因此饲用抗生素检测技术的建立在政府部门对行业的监管方面尤为重要。与此同时,从源头掌握动物食品安全状况也越来越需要灵敏、快速和可靠的分析方法作为饲料和食品检验的保障[12]。
林可胺类药物结构上(图1)由酰胺与糖配基组成,由于其没有特征的紫外吸收基团和荧光基团,因此不能采用常规的液相色谱法测定。我国现行国家标准《饲料中林可霉素的测定》(GB/T 8381.3—2005)[13]规定了对浓缩饲料和配合饲料中林可霉素的测定,其中采用薄层色谱法对林可霉素进行定性,并采用微生物标准曲线法进行定量,这与文献报道的一些抗生素分析方法[14]一致,即先筛选确认后,再进行定量分析。但该类方法前处理耗时且特异性和选择性差,还会导致假阳性结果。一些研究报道了基于液相色谱与质谱联用的方法测定饲料中的林可胺类药物[15⇓⇓⇓-19],部分研究也展示出灵敏度高、准确性和重复性好的结果。然而,饲料样品基质复杂,通常含有水、谷物、矿物质、维生素和脂肪等成分。一方面,有些目标物受基质影响不能得到有效提取;另一方面,提取液不加净化或净化不完全将会引起基质效应,从而影响定量结果。例如,Jang等[15]采用1%乙酸甲醇溶液提取饲料中林可霉素等30种药物,提取液再经C18填料的固相萃取小柱净化,最后用液质联用法进行定量分析,对林可霉素而言,提取效率约为76.8%,基质效应达到了40.47%。
图1 林可胺类药物化学结构

a:林可霉素 lincomycin;b:克林霉素 clindamycin;c:克林霉素磷酸酯 clindamycin phosphate;d:吡利霉素 pirlimycin。

Fig.1 Chemical structure of lincosamides

由此可见,选择合适的提取液,并采用固相萃取小柱对提取液进行有效的净化以降低基质效应,对于林可胺类物质的检测至关重要。另外,值得注意的是,所有上述研究只是检测饲料中的林可胺类药物中的1种或2种[15⇓⇓⇓-19]。例如,Abdulrasaq等[16]采用液质联用法对75份家禽饲料中的林可霉素进行了定量分析;Kellmann等[17]采用液质联用法分析了饲料中吡利霉素的含量。迄今为止,还没有此类方法用于饲料中的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素4种林可胺类药物同时检测的报道。
针对目前饲料中林可胺类药物前处理技术的不足以及同时检测方法的缺乏,本研究拟采用磷酸盐缓冲溶液对饲料中的林可胺类药物进行提取,并用混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化去除基质干扰,然后在液质联用仪上检测,同时定量分析饲料中4种林可胺类药物,旨在为饲料中林可胺类药物的检测提供快速、准确和灵敏的分析方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂

盐酸林可霉素(纯度≥98%)、盐酸克林霉素(纯度≥98%)、克林霉素磷酸酯(纯度≥98%)和盐酸吡利霉素(纯度≥98%)购自北京百灵威科技有限公司。色谱级甲醇、乙腈和甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。MCX混合型强阳离子交换反相吸附固相萃取小柱(60 mg,3 mL;150 mg,6 mL;500 mg,6 mL)、HLB亲水亲脂平衡反相吸附固相萃取小柱(60 mg,3 mL)、WCX混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱(60 mg,3 mL)购自美国Waters公司。PCX强阳离子固相萃取小柱(60 mg,3 mL)购自美国Agilent公司,SCX强阳离子固相萃取小柱(60 mg,3 mL)购自美国Gilson公司,DB WCX混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱(60 mg,3 mL)购自上海笛柏生物科技有限公司。分析纯三水磷酸氢二钾、氨水和盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器

超高效液相色谱-质谱联用仪(Waters ACQUITYTM UPLC TQ Mass detector,美国Waters公司),KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),超纯水仪(德国EMD Millipore公司),电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),ST 40R离心机(美国Thermo公司),N-EVAP 112氮吹仪(美国Organomation公司)。

1.2 超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18,50 mm×2.1 mm,粒径1.7 μm;进样量:8 μL;流速:0.4 mL/min;流动相A相:0.1%甲酸溶液;流动相B相:乙腈。色谱分离梯度洗脱条件见表1。
表1 色谱分离梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program for chromatographic separation

时间
Time/min		 流动相A
Mobile phase A/%		 流动相B
Mobile phase B/%		 曲线类型
Curve type
0 98 2 6
1.0 98 2 6
2.5 10 90 6
4.5 98 2 6
5.0 98 2 6

1.2.2 质谱条件

电离方式:电喷雾离子源(ESI)正离子模式;检测方式:多级反应监测(MRM);毛细管电压:3.0 kV;离子源温度:150 ℃;脱溶剂气温度:550 ℃;脱溶剂气流速:1 000 L/h。雾化气、干燥气为高纯氮气,碰撞气为高纯氩气。喷雾电压、碰撞能量等参数优化至最佳灵敏度。监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。
表2 质谱分析条件

Table 2 Conditions for MS analysis

林可胺类药物
Lincosamides		 母离子
Precursor ion/(m/z)		 子离子
Daughter ion/(m/z)		 锥孔电压
Cone voltage/V		 碰撞能量
Collision energy/V
林可霉素
Lincomycin		 407.4 126.2a
359.5		 10 26
18
克林霉素
Clindamycin		 425.4 126.2a
377.4		 14 28
20
克林霉素磷酸酯
Clindamycin phosphate		 505.2 126.2a
457.4		 30 34
24
吡利霉素
Pirlimycin		 411.2 112.2a
363.3		 28 28
18

a为定量离子对。

a was quantitative ion pair.

1.3 样品的前处理

1.3.1 提取

平行做2份试验。称取2.5 g(精确至0.01 g)饲料于50 mL离心管中,准确加入25 mL甲醇-磷酸盐缓冲溶液(甲醇∶0.1 mol/L磷酸氢二钾=8∶2,体积比);称取11.411 g 三水磷酸氢二钾,加入430 mL水溶解,用盐酸溶液调节pH至8.0±0.1,用水稀释至500 mL,混匀,涡旋混匀,超声提取15 min,于8 000 r/min离心5 min,取上清液于另一支50 mL离心管中。重复提取1次,合并上清液,混匀。准确移取2.5 mL于10 mL离心管中,加入2.5 mL的1%甲酸溶液,混匀,备用。

1.3.2 净化

依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL的1%甲酸溶液活化MCX固相萃取小柱,将备用液全部上样,分别用6 mL 1%的甲酸溶液、6 mL水和6 mL甲醇淋洗,抽干。用3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,于50 ℃氮气吹干,准确加入2.5 mL的50%甲醇,涡旋溶解,过0.22 μm有机滤膜,待UPLC-MS/MS检测。

1.4 标准曲线的制作

标准储备溶液(500 μg/mL):分别称取盐酸林可霉素、盐酸克林霉素、克林霉素磷酸酯和盐酸吡利霉素各适量(精确至0.01 mg),用甲醇溶解并稀释定容,混匀,制成浓度均为500 μg/mL的标准储备溶液,于-18 ℃以下保存,有效期3个月。
混合标准中间溶液(10 μg/mL):准确移取标准储备溶液各1 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容,混匀,于2~8 ℃保存,有效期7 d。
混合标准系列溶液:准确移取混合标准中间溶液适量,用50%甲醇配制成浓度分别为1、2、5、10、50、100和200 μg/L的混合标准系列溶液。上机测试,以浓度为横坐标,以定量离子的峰面积为纵坐标,绘制溶剂标准工作曲线。
基质匹配标准工作曲线:称取空白饲料2.5 g(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中,按照1.3样品前处理试验步骤进行处理。以获得的复溶液作为空白基质,稀释林可胺类药物混合标准中间溶液,得到1、2、5、10、50、100和200 μg/L的基质匹配标准工作溶液,上机测试,以浓度为横坐标,以定量离子的峰面积为纵坐标,绘制基质匹配标准工作曲线。

1.5 方法的准确度与精密度

分别移取0.5、5、25和500 μg/mL等4个浓度的林可胺类药物混合标准溶液,加入到空白饲料样品中,得到最终计算浓度为40 μg/kg、400 μg/kg、4 mg/kg和100 mg/kg的4个添加水平。每种饲料在每个浓度下设6个平行,方法的准确度以回收率来评价,精密度以相对标准偏差(RSD)表示。

1.6 数据处理与分析

数据处理采用Excel 2016统计分析软件进行处理和计算,结果以平均值来表示。

2 结果与分析

2.1 流动相的组成

本试验考察了甲醇-水(图2-a)、乙腈-水(图2-b)、甲醇-0.1%甲酸(图2-c)和乙腈-0.1%甲酸(图2-d)等不同的流动相体系经色谱柱对林可胺类药物的分离效果。结果表明,使用含有甲酸、乙腈和水的流动相体系可以获得最大的灵敏度和最佳的峰形。这可能归因于甲酸增加了林可胺类药物的电离,而乙腈会产生比甲醇更好的色谱峰。本研究采用0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)体系作为流动相。在优化的色谱条件下,林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的保留时间分别为1.78、1.98、2.06和1.95 min,分析时间为5 min。
图2 林可胺类药物标准溶液(5 μg/L)在不同流动相中MRM色谱图

a:甲醇-水 methanol-water;b:乙腈-水 acetonitrile-water;c:甲醇-0.1%甲酸 methanol-0.1% formic acid;d:乙腈-0.1%甲酸水 acetonitrile-0.1% formic acid。

Fig.2 MRM chromatogram of lincosamides standard solution (5 μg/L) in different mobile phases

2.2 质谱条件

如图1所示,林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素均具有叔胺或仲胺结构,具有弱碱性,其在质谱上有很强的正离子响应,故选择正离子模式扫描。本研究将200 μg/L的4种林可胺类药物标准溶液分别注入到质谱仪中,在质谱扫描模式下获得各种药物的一级和二级质谱图,选择响应值高、干扰小且具有代表性的离子对作为定量离子和定性离子。选择林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素4种林可胺类药物丰度较高的准分子离子峰质荷比(m/z)407.4、m/z 425.4、m/z 505.2和m/z 411.2作为母离子,对母离子进行轰击碎裂,产生相应的子离子质谱图(图3)。对4种药物质谱裂解途径解析如下:林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯产生子离子m/z 126,对应于3-丙基-N-甲基吡咯烷碎片离子(图3-a至图3-c)。吡利霉素产生子离子m/z 112,对应于4-乙基哌啶(图3-d)。林可霉素的子离子m/z 359、克林霉素的子离子m/z 377、克林霉素磷酸酯的子离子m/z 457和吡利霉素的子离子m/z 363的产生是由于各自准分子离子峰中硫代甲醇分子的丢失,另外克林霉素磷酸酯产生子离子m/z 425,对应于磷酸的丢失[20]。上述离子对的选择与现有报道[20⇓⇓-23]林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素离子对一致。
图3 林可胺类药物质谱图

a:林可霉素 lincomycin;b:克林霉素 clindamycin;c:克林霉素磷酸酯 clindamycin phosphate;d:吡利霉素 pirlimycin。

Fig.3 Mass spectrum of lincosamides

2.3 提取液的确定

本试验比较了5%甲醇、甲醇和甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液对林可胺类药物的提取效率。称取鸡配合饲料空白样品9份,每份试样2.5 g(精确到0.01 g),置于50 mL离心管中,均添加200 μL浓度为50 μg/mL的4种林可胺类药物混合标准溶液,室温放置过夜。每3份试样分别加入25 mL 5%甲醇、甲醇以及甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液,经1.3样品的前处理步骤进行提取与净化,后上机测定。
由图4可知,除了甲醇对克林霉素磷酸酯的回收率为99.5%,其他无论采取5%甲醇还是甲醇作为提取液,4种林可胺类药物回收率在59.5%~74.5%;而采用甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取,4种林可胺类药物回收率均在92.5%~107.1%,由此可见甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液对4种林可胺类药物的提取效率高于5%甲醇和甲醇。
图4 提取液对林可胺类药物回收率的影响(4 mg/kg)

Fig.4 Effects of extracting solution on recovery rate of lincosamides (4 mg/kg)

2.4 净化条件的优化

平行做18份试验(6个处理,3个重复)。称取猪配合空白饲料2.5 g(精确到0.01 g),置于50 mL离心管中,均添加200 μL浓度为50 μg/mL的4种林可胺类药物混合标准溶液,室温放置过夜。加入25 mL甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液,经1.3样品的前处理步骤进行提取与净化,上机测定。
由图5可知,经甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取和HLB固相萃取小柱净化,林可霉素和克林霉素磷酸酯有较好的保留,而克林霉素和吡利霉素2种药物的回收率小于80%,尤其是吡利霉素回收率只有50%~60%。此外,2款混合型弱阳离子交换反相吸附性质的DB WCX和WCX固相萃取小柱对4种林可胺类药物基本没有保留。选择甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取,经PCX、SCX和MCX 3款强阳离子型固相萃取小柱净化,4种林可胺类药物的回收率均在85%以上。因此,选用MCX固相萃取小柱对提取液进行净化。
图5 6款不同固相萃取小柱对林可胺类药物回收率的影响(4 mg/kg)

Fig.5 Effects of six different solid phase extraction cartridges on recovery rate of lincosamides (4 mg/kg)

在此基础上,采用60、150和500 mg 3种不同规格的MCX固相萃取小柱对猪配合饲料提取液进行净化,以考察其净化效果及承载量。
称取空白猪配合饲料2份,各2.5 g(精确到0.01 g),置于50 mL离心管中,其中一份添加250 μL浓度为1 000 μg/mL的4种林可胺类药物,室温放置过夜。经甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取,制得备用液。
3种不同规格MCX固相萃取小柱各5个依次用甲醇和水各6 mL活化,备用液全部过柱。再按1.3样品的前处理步骤进行提取与净化,上机测定。
由图6可知,应用3种不同规格MCX固相萃取小柱,克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素均能获得较好满意的回收率(88.5%~102.6%);但是对于最高添加浓度(100 mg/kg)的林可霉素,应用60和150 mg 2种规格的MCX固相萃取小柱净化,回收率小于80%;而应用500 mg的MCX固相萃取小柱,4种林可胺类药物均可以获得94.2%~102.6%的回收率。因此,选择500 mg的MCX固相萃取小柱用于提取液的净化。
图6 不同规格MCX固相萃取小柱对林可胺类药物回收率的影响(100 mg/kg)

Fig.6 Effects of MCX solid phase extraction cartridges with different specifications on recovery rate of lincosamides (100 mg/kg)

2.5 基质的影响

按照1.4所述,制备溶剂标准工作曲线和基质匹配标准工作曲线,标准工作曲线、相关系数(R2)和基质效应见于表3,其中基质效应在0.877~1.122。由此可知,空白基质未对林可胺类药物产生明显的增强或抑制效应。因此,采用溶剂标准工作曲线对测定结果进行计算。
表3 不同饲料基质中林可胺类药物的标准曲线与相关系数和基质效应

Table 3 Calibration curves, regression coefficient and matrix effects of lincosamides in different feed substrates

样品
Samples		 林可霉素标准曲线与相关系数
Calibration curve and regression
coefficient of lincomycin		 基质效应
Matrix effect		 克林霉素标准曲线与相关系数
Calibration curve and regression
coefficient of clindamycin		 基质效应
Matrix effect
溶剂标准工作溶液
Calibration solvent prepared using mobile phase		 y=778.3x+760.9,R2=0.999 9 y=2 244.4x+1 678.8,R2=0.999 9
鸡配合饲料
Compound feed for chicken		 y=759.3x+743.4,R2=0.999 6 0.976 y=2 102.8x+1 547.2,R2=0.999 6 0.937
鸡浓缩饲料
Concentrated feed for chicken		 y=776.9x+589.1,R2=0.999 9 0.998 y=2 212.6x+1 810.4,R2=0.999 9 0.986
鸡预混合饲料
Premixed feed for chicken		 y=750.1x+949.6,R2=0.999 2 0.964 y=2 013.0x+1 832.5,R2=0.999 4 0.897
猪配合饲料
Compound feed for pig		 y=772.4x+1 031.4,R2=0.999 9 0.992 y=2 270.6x+1 868.0,R2=0.999 8 1.012
猪预混合饲料
Premixed feed for pig		 y=779.2x+1 249.8,R2=0.999 2 1.001 y=2 012.2x+2 721.3,R2=0.999 4 0.897
奶牛精料补充料
Concentrated feed for cow		 y=748.5x+1 115.0,R2=0.999 9 0.962 y=2 227.0x+1 993.9,R2=0.999 7 0.992
溶剂标准工作溶液
Calibration solvent prepared using mobile phase		 y=272.9x+142.7,R2=0.999 6 y=1 873.6x+1 056.8,R2=0.999 9
鸡配合饲料
Compound feed for chicken		 y=270.6x+551.0,R2=0.999 0 0.992 y=1 924.0x+950.9,R2=0.999 9 1.027
鸡浓缩饲料
Concentrated feed for chicken		 y=274.2x+449.5,R2=0.998 5 1.005 y=1 789.9x+1 315.8,R2=0.999 9 0.955
鸡预混合饲料
Premixed feed for chicken		 y=254.0x+544.3,R2=0.997 8 0.931 y=1 666.7x+1 424.8,R2=0.999 9 0.889
猪配合饲料
Compound feed for pig		 y=255.7x+534.4,R2=0.998 9 0.937 y=1 904.3x+1 651.6,R2=0.999 8 1.016
猪预混合饲料
Premixed feed for pig		 y=267.4x+604.6,R2=0.997 2 0.980 y=1 643.3x+877.2,R2=0.999 9 0.877
奶牛精料补充料
Concentrated feed for cow		 y=266.6x+740.0,R2=0.998 0 0.977 y=1 711.4x+1 467.3,R2=0.999 8 0.913

2.6 线性关系和线性范围

4种林可胺类药物在1~200 μg/L浓度范围内,R2均大于0.99,可见4种林可胺类药物均具有良好的线性关系,符合定量要求。

2.7 检出限和定量限

向空白饲料中添加林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素使之添加浓度为40 μg/kg,其信噪比(S/N)均大于10,并且经前处理后其浓度在线性范围内,该方法的检出限则根据S/N=3,确定的检出限可达到10 μg/kg。所以,最终确定方法的检出限为10 μg/kg,定量限为40 μg/kg,满足分析方法的要求。

2.8 方法的准确度和精密度

选用畜禽配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料分别进行加标回收率试验,每种饲料采用不同的添加浓度,每个添加浓度制备6个平行样品,当样品的上机浓度超过线性范围时,需要根据测定浓度,用50%甲醇进行稀释后重新测定,直到上机液浓度在标准曲线的线性范围内,结果见表4。从回收率结果看出,在40 μg/kg~100 mg/kg添加浓度范围内,回收率为81.5%~107.6%,RSD为1.4%~9.8%。由此可见回收率较好,精密度较高,说明本方法能满足饲料中林可胺类药物含量测定需要。
表4 饲料样品中的林可胺类药物回收率

Table 4 Recovery rate of lincosamides in feed samples (n=6)%

林可胺类
药物
Lincosamides		 添加水平
Spiking
level		 鸡配合饲料
Compound feed
for chicken		 鸡预混合饲料
Premixed feed
for chicken		 鸡浓缩饲料
Concentrated feed
for chicken		 猪配合饲料
Compound
feed for pig		 猪预混合饲料
Premixed feed
for pig		 奶牛精料补充料
Concentrate
supplement for cow
回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD		 回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD		 回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD		 回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD		 回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD		 回收率
Recovery
rate		 相对标
准偏差
RSD
林可霉素
Lincomycin		 40 μg/kg 91.6 5.8 103.5 2.6 97.7 7.1 97.8 7.1 89.1 7.8 98.4 6.3
400 μg/kg 87.6 4.7 86.4 4.1 99.8 2.9 92.6 1.5 82.9 4.5 99.1 4.0
4 mg/kg 95.8 3.8 90.6 3.9 92.5 6.7 93.7 4.4 90.7 4.9 101.5 6.3
100 mg/kg 96.5 4.9 98.8 4.3 98.7 5.5 99.1 4.9 98.7 5.2 98.7 5.2
克林霉素
Clincomycin		 40 μg/kg 97.1 7.7 94.4 8.9 104.3 6.1 95.4 8.4 89.5 5.6 98.1 6.8
400 μg/kg 92.3 4.1 86.0 5.4 107.6 7.6 88.6 2.4 81.5 3.1 99.6 1.6
4 mg/kg 95.2 6.7 92.0 6.6 98.6 4.0 101.1 3.4 94.4 3.5 98.0 3.5
100 mg/kg 93.6 7.0 98.4 5.6 99.9 5.3 98.3 4.2 101.6 2.6 98.3 3.8
克林霉素磷酸酯
Clincomycin
phoshpate		 40 μg/kg 97.7 4.6 97.3 7.7 102.9 3.3 97.0 7.7 98.4 3.7 97.8 4.5
400 μg/kg 100.3 3.9 89.4 7.5 88.9 5.4 94.0 6.0 97.0 4.0 93.1 4.1
4 mg/kg 96.3 6.5 98.5 6.6 92.3 3.5 97.5 5.8 100.6 2.9 98.9 3.3
100 mg/kg 100.2 2.9 93.3 4.0 96.6 2.5 98.7 4.0 98.8 2.0 100.3 3.5
吡利霉素
Pirlimycin		 40 μg/kg 100.8 2.8 94.2 8.9 97.8 8.8 93.3 6.9 93.3 7.1 101.2 3.5
400 μg/kg 95.2 6.5 97.6 8.5 98.1 7.5 98.9 1.5 90.8 1.4 97.9 4.5
4 mg/kg 103.3 6.6 95.3 4.3 101.0 5.6 93.0 6.6 91.7 9.2 91.2 9.8
100 mg/kg 98.9 4.8 96.8 4.0 99.8 4.9 99.6 3.2 101.3 3.9 101.3 3.7

2.9 实际样品(非添加样)的测定

为进一步验证方法的适用性和科学性,应用所建立的测定方法对养殖场的30余份饲料样品进行检测,包括配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料,结果发现所检样品中林可胺类药物均低于检测限。

3 讨论

3.1 提取液的选择

林可胺类药物在酸性条件下易发生水解,在中性或弱碱性溶液中相对稳定,且易溶于极性有机溶剂。因此,4种林可胺类药物提取与净化条件的优化,主要依据其弱碱性、酸不稳定性和脂溶性[24]。已见文献报道对林可胺类药物其中1种或2种药物的提取,采用5%甲醇[25]、甲醇[18]、甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液[26]等。本研究比较了文献报道的5%甲醇、甲醇和甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液对饲料中的林可胺类药物进行提取,经MCX固相萃取小柱净化。采取5%甲醇和甲醇作为提取液,至少3种林可胺类药物回收率在59.5%~74.5%,而采用甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液作为提取液,4种林可胺类药物回收率均在92.5%~107.1%。因此,本研究采用甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液作为提取液。

3.2 固相萃取小柱的选择

如前所述,林可胺类药物呈现弱碱性,因此通常会选用阳离子型固相萃取小柱进行净化和富集,也有文献采用C18或HLB[16,18,25]固相萃取小柱对基质中林可霉素或克林霉素进行净化。本研究考察了HLB亲水亲脂平衡反相吸附固相萃取小柱、DB WCX和WCX 2款混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱以及PCX、SCX和MCX 3款强阳离子交换固相萃取小柱的净化效果。经甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取和HLB固相萃取小柱净化,克林霉素的回收率小于80%,吡利霉素回收率只有50%~60%,2款混合型弱阳离子交换反相吸附性质的DB WCX和WCX固相萃取小柱对4种林可胺类药物基本没有保留,而采用PCX、SCX和MCX 3款强阳离子型固相萃取小柱净化,4种林可胺类药物的回收率均在85%以上。因此,选用其中的一款MCX固相萃取小柱对提取液进行净化。

3.3 样品的基质效应

基质效应是指目标化合物在离子化时受到基质干扰物竞争引起分析信号变化从而导致增强或抑制的效应,基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值反映基质效应的强弱。采用公式基质效应=K1/K2(其中K1和K2分别为基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率)计算[27-28],当基质效应>1.15时,表明产生基质增强效应;当基质效应<0.85时,表明产生基质抑制效应;当基质效应为0.85~1.15时,说明基质效应不明显[29]。Jang等[15]报道,分析林可霉素时出现了明显的基质抑制效应,为减少基质效应对其干扰,而采取基质匹配标准工作曲线对其定量分析。本研究中,基质效应在0.877~1.122,因此,采用溶剂标准工作曲线对4种林可胺类药物进行定量分析。

4 结论

① 本研究采用甲醇-磷酸氢二钾缓冲溶液提取饲料中的4种林可胺类药物,并经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化,成功建立了提取和净化程序,该前处理方法基质干扰影响较小。
② 通过UPLC-MS/MS分析,建立了外标法同时定量测定饲料中4种林可胺类药物的方法。该方法中4种林可胺类药物的检出限和定量限分别为10和40 μg/kg。
③ 在4个浓度水平(40 μg/kg、400 μg/kg、4 mg/kg和100 mg/kg)下进行添加试验,林可胺类药物的回收率为81.5%~107.6%,RSD为1.4%~9.8%,准确度和精密度高。
④ 综上所述,本试验建立的固相萃取(SPE)-UPLC-MS/MS法操作简单,准确度高,可应用于饲料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素4种林可胺类药物的同时检测。

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