动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 6: 3991 - 4000

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.370

研究论文

无标记表面等离子共振免疫传感快速测定动物尿液中沙丁胺醇残留

  • 肖志明 , 1 ,
  • 孙铭雪 1, 2 ,
  • 姚婷 3 ,
  • 李彦伸 2 ,
  • 黄骅 3 ,
  • 王石 1 ,
  • 索德成 1 ,
  • 樊霞 , 1, *
展开
  • 1 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,国家饲料质量检验检测中心(北京),北京 100081
  • 2 烟台大学生命科学学院,烟台 264005
  • 3 北京市兽药饲料监测中心,北京 102200
*樊 霞,研究员,E-mail:

肖志明(1986—),男,江西宁都人,副研究员,博士,研究方向为农产品质量与食物安全。E-mail:

收稿日期: 2022-10-18

  网络出版日期: 2023-06-08

基金资助

“十三五”国家重点研发计划项目(2019YFE0103800)

收起

Label-Free Surface Plasmon Resonance Immunosensor for Rapid Determination of Salbutamol Residue in Animal Urine

  • XIAO Zhiming , 1 ,
  • SUN Mingxue 1, 2 ,
  • YAO Ting 3 ,
  • LI Yanshen 2 ,
  • HUANG Hua 3 ,
  • WANG Shi 1 ,
  • SUO Decheng 1 ,
  • FAN Xia , 1, *
Expand
  • 1 China National Feed Quality Inspection and Testing Center (Beijing), Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
  • 2 College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China
  • 3 Beijing Veterinary Medicine and Feed Control Center, Beijing 102200, China
*professor, E-mail:

Received date: 2022-10-18

  Online published: 2023-06-08

Fold

摘要

本研究旨在建立一种无需标记的直接竞争表面等离子共振(SPR)免疫传感器,以快速测定动物尿液中沙丁胺醇的残留。试验首先利用氨基偶联原理,将沙丁胺醇单克隆抗体固定到CM7传感器芯片表面,然后通过优化单抗固定浓度、pH和固定时间,以及芯片活化和封闭时间,进而得到最佳分析条件。结果表明:沙丁胺醇在0.1~6.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好[相关系数(R2)为0.999 8],最低检出限(LOD)可达0.01 ng/mL,在添加浓度为0.5、1.0和5.0 ng/mL时,方法的平均回收率为87.82%~97.67%,批内变异系数(相对标准偏差)为1.51%~2.67%,批间变异系数为2.86%~5.53%。将该SPR免疫传感器与超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)确证分析方法进行实际尿液样品测定比较,结果能够保持一致。本研究建立的直接竞争SPR免疫传感方法简便、快速、灵敏,且无需复杂的生物标记,适用于动物尿液中沙丁胺醇残留的日常检测分析。

关键词： 表面等离子共振; 免疫传感器; 动物尿液; 沙丁胺醇

本文引用格式

肖志明 , 孙铭雪 , 姚婷 , 李彦伸 , 黄骅 , 王石 , 索德成 , 樊霞 . 无标记表面等离子共振免疫传感快速测定动物尿液中沙丁胺醇残留[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(6) : 3991 -4000 . DOI: 10.12418/CJAN2023.370

Abstract

The aim of this study was to establish a direct competitive surface plasmon resonance (SPR) immunosensor without labeling to rapidly determine albuterol residues in animal urine. Firstly, the amino coupling principle was used to fix salbutamol monoclonal antibody to the surface of the CM7 sensor chip, and then the optimal analysis conditions were obtained by optimizing the fixed concentration, pH and time of the monoclonal antibody, as well as the activation and sealing time of the chip. The results show that the linear relationship of salbutamol was good in the concentration range of 0.1 to 6.0 ng/mL [correlation coefficient (R2) was 0.999 8], and the lowest detection limit (LOD) was up to 0.01 ng/mL. The average recovery of salbutamol was 87.82% to 97.67% when the concentrations were 0.5, 1.0 and 5.0 ng/mL. The coefficient of variation (relative standard deviation) with intra-day was 1.51% to 2.67%, and the coefficient of variation with inter-day was 2.86% to 5.53%. The results of the SPR immunosensor were consistent with those of the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) confirmations. The direct competition SPR immunosensing method established in this study is simple, rapid and sensitive without complex biomarkers, and is suitable for the daily detection and analysis of albuterol residues in animal urine.

Key words： surface plasmon resonance; immunosensor; animal urine; salbutamol

沙丁胺醇(salbutamol)是一种人工合成的苯乙醇胺类β-肾上腺素能受体激动剂,医学临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量,可治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病[1⇓-3]。沙丁胺醇与克伦特罗(clenbuterol)、莱克多巴胺(ractopamine)等物质具有类似的化学结构(图1),因其具有加速脂肪分解、促进蛋白质合成和提高饲料转化率等功效而被大量非法用于动物养殖,以提高瘦肉率[4],故常被俗称为“瘦肉精”。此外,沙丁胺醇对动物毛细血管具有显著扩张的作用,饲喂后动物在短时间内饮水量大增,以达到迅速“增重”的效果。由于此类违法饲喂往往是在养殖动物出栏时或屠宰前,药物不能经过充分代谢排出体外,导致动物组织中残留量高,因而比养殖环节饲喂更影响畜产品质量安全。美国和欧盟等多个国家和地区已严令禁止将沙丁胺醇作为饲料添加剂在畜禽养殖中使用[5-6],我国也从20年前开始将包括沙丁胺醇在内的多种“瘦肉精”违法使用作为饲料和畜产品质量安全监测的重点,而高效的检测技术支持是打击沙丁胺醇违法使用的关键[7-8]。
图1 克伦特罗(a)、莱克多巴胺(b)和沙丁胺醇(c)的化学结构式

Fig.1 Chemical structural formulas of clenbuterol (a), ractopamine (b) and salbutamol (c)

近年来,检测动物组织、尿液、血液和饲料等各类生物样本中沙丁胺醇的方法不断发展和完善,包括液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[9-10]、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[11-12]、酶联免疫吸附试验(ELISA)法[13-14]和电化学传感器分析法[15-16]等。其中,LC-MS/MS和GC-MS灵敏度高、检测结果准确可靠,但对样品前处理要求较高,使用的仪器设备昂贵,耗时也较长;ELISA法基于免疫学分析原理,因其具有监测时间短、操作简便等优点,是目前应用最为广泛的筛查方法,但ELISA法需要使用酶或其他纳米材料标记,稳定性相对较差,容易出现“假阳性”甚至“假阴性”。
表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)是一种光学耦合的物理现象,其通过探测生物分子间相互作用引起的微小折射率变化,实现对生物效应中分子间相互作用的实时监测[17]。使用SPR生物传感器进行直接法检测时,首先将一种高特异性的配体分子固定在传感器芯片上,再将含有能与配体结合的待测物溶液通入芯片表面,二者之间进行结合后使金属薄膜表面折射率发生变化,反映到仪器上即为响应值的改变,根据反应信号检测待测样品中所测物质的含量[18]。SPR生物传感器具有前处理简便、无需标记、样品用量少、灵敏度高以及实时检测等优点[19-20],已广泛应用于医学诊断[21-22]、食品安全[23-24]、环境监测[25-26]和生命科学[27-28]等领域。然而,目前SPR技术主要应用于蛋白、核酸等生物大分子,在小分子识别方面的应用较少。因此,本研究采用直接竞争SPR技术,将沙丁胺醇单克隆抗体直接固定在CM7传感器芯片表面,利用抗原-抗体特异性识别原理,以期建立动物尿液中沙丁胺醇残留的快速筛查新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

沙丁胺醇标准品和HBS-EP缓冲液购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;1-乙基3-(3-二甲氨基)-碳二亚盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和甘氨酸-盐酸(GLY-HCl)购自北京安众锐森科技有限公司;氢氧化钠(NaOH)、乙酸钠、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)和冰乙酸均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;沙丁胺醇单克隆抗体由北京维德维康生物技术有限公司提供;试验用水为经Milli-Q纯化制备的一级水(电阻率>18.2 MΩ·cm)。

1.2 试验仪器与设备

试验用Biacore X100 SPR仪购自美国GE公司;Lab-855型pH计购自德国Xylem Analytics公司;BS-210S分析天平购自德国Sartorius公司;MS2-Minishaker旋涡振荡器购自德国IKA公司;3K15高速冷冻离心机购自德国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抗体固定条件选择

分别使用3种不同pH(4.5、5.0和5.5)的10 mmol/L乙酸钠缓冲液,并配制不同浓度(50、60和70 μg/mL)的沙丁胺醇抗体溶液,依次以10 μL/min的速度通入SPR仪器中,并使用50 mmol/L NaOH溶液对CM7传感器芯片表面进行洗脱,根据响应值选择最适的乙酸钠缓冲液pH和抗体浓度。

1.3.2 抗体固定过程

首先,将0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS按1∶1(体积比)的比例混合,以10 μL/min的流速激活CM7传感器芯片表面,再用1.3.1中确定好的乙酸钠缓冲液稀释沙丁胺醇单克隆抗体至适宜浓度,以10 μL/min的流速固定在新激活的芯片表面上,最后选用1 mol/L乙醇胺溶液灭活芯片未反应位点,封闭芯片表面。

1.3.3 再生条件确定

分别考察0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L GLY-HCl(pH分别为2.0、2.5和3.0)作为再生液时的响应值,判定再生效果,每个再生液单次注射时间设定为120 s,重复注射5次。

1.3.4 标准曲线建立

SPR传感器灵敏度高,因而无需对动物尿液样品进行复杂的前处理,只需进行简单的离心处理即可(在8 000 r/min条件下离心5 min)。选择经超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)确证的空白尿液样品,添加沙丁胺醇标准溶液,使得沙丁胺醇的浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 ng/mL,配制基质添加标准曲线,上SPR仪进行测定。SPR测定时的进样流速为30 μL/min,抗原抗体结合时间为180 s,解离时间为60 s,每次进样完成后,使用1.3.3中确定的再生液进行洗脱,再生时间为40 s。

1.3.5 特异性试验

将HBS-EP缓冲液(作为阴性对照)和相同质量浓度(4 ng/mL)的沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺标准溶液依次通入到CM7传感器芯片表面,每种溶液重复测定3次,以验证该方法对沙丁胺醇的特异性。

1.3.6 稳定性和重复性试验

将5 ng/mL沙丁胺醇标准溶液通入到SPR仪中,连续3 d,每天进行20次重复试验,用响应值的变化来评估芯片的稳定性和重复性。由于SPR仪对于温度变化较为敏感,此过程需保持SPR仪处于(25±3) ℃环境中运行。

1.3.7 加标回收试验

在优化试验条件下,在空白猪、牛和羊尿液中分别加入沙丁胺醇标准溶液,使添加浓度分别为0.5、1.0和5.0 ng/mL,每天每个添加浓度进行6次平行试验,连续试验3 d,测得响应值,通过标准曲线计算实际测得浓度。实测浓度与添加浓度的比值为回收率,每天平行试验结果的相对标准偏差(RSD)为批内变异系数(n=6),3 d重复试验结果的RSD为批间变异系数(n=18)。

1.3.8 实际样品测定

通过从全国范围内的不同养殖场采集一定数量的猪、牛和羊尿液实际样品,经UPLC-MS/MS确证分析后,对本研究中建立的无标记SPR方法进行验证,分析SPR直接检测方法的有效性和准确性。

2 结果与分析

2.1 抗体固定条件

2.1.1 乙酸钠缓冲液pH和抗体浓度选择

分别用pH为4.5、5.0和5.5的乙酸钠缓冲液将沙丁胺醇抗体稀释至3个不同浓度(50、60和70 μg/mL),再将溶液注射入CM7传感器芯片表面,比较响应值的变化,结果分别如图2、图3和图4所示。
图2 pH 4.5下50、60和70 μg/mL乙酸钠溶液预富集结果

Fig.2 Pre-enrichment results of 50, 60 and 70 μg/mL sodium acetate solution with pH 4.5

图3 pH 5.0下50、60和70 μg/mL乙酸钠溶液预富集结果

Fig.3 Pre-enrichment results of 50, 60 and 70 μg/mL sodium acetate solution with pH 5.0

图4 pH 5.5下50、60和70 μg/mL乙酸钠溶液预富集结果

Fig.4 Pre-enrichment results of 50, 60 and 70 μg/mL sodium acetate solution with pH 5.5

通过比较图2、图3和图4可以看出,当乙酸钠缓冲液pH为5.0、沙丁胺醇抗体稀释浓度为50 μg/mL时,响应值最高(>80 000 RU),抗体富集效果最好(图3),因此选择为最优偶联条件。

2.1.2 抗体固定条件优化结果

经2.1.1分析,选用10 mmol/L、pH为5.0的乙酸钠缓冲液将沙丁胺醇抗体稀释至50 μg/mL,作为抗体固定条件。首先将EDC和NHS混合液活化芯片和乙醇胺封闭芯片的时间分别设定为10、15和20 min,并设定抗体固定时间为30 min,获得响应值分别为(42 367±128) RU、(48 041±115) RU和(48 571±177) RU(n=3),抗体固定过程如图5所示。结果表明,随着时间的延长,EDC对芯片表面的活化程度有所增加,使得芯片对抗体的固定量增加,响应值相应提高;然而,15 min后响应值提升并不明显,表明抗体的固定量基本达到平衡饱和状态,因此将EDC和NHS混合液的时间设定为15 min。
图5 抗体固定过程

a:通入EDC和NHS混合液激活芯片表面;b:第1次通入沙丁胺醇抗体与活化表面反应;c:第2次通入沙丁胺醇抗体与活化表面反应;d:通入乙醇胺封闭未结合的激活位点。

Fig.5 Process of antibody immobilization

a: injecting EDC and NHS mixed liquor to activate the chip surface; b: the first passage of adding salbutamol antibody to react with the activated surface; c: the second passage of adding salbutamol antibody to react with activated surface; d: inactivating unbound activation sites with ethanolamine.

2.2 不同再生条件对响应值的选择

在通入待测液后,固定在芯片上的抗体与待测液中的抗原发生特异性结合,这种抗原-抗体结合较为稳固,且能够产生累积效应,进而影响下一次的反应。因此,在每一次抗原抗体结合分析后,均需通入再生液以除去结合在抗体上的抗原。再生条件对SPR芯片的稳定性、重现性和检测结果的准确性均有重要影响,合适的再生条件既可将结合在抗体上的抗原完全去除,又不损害芯片和结合在芯片表面的抗体,以保证抗体的全部活性,并延长芯片的使用寿命[29-30]。
图6分别是4种再生液——0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L GLY-HCl(pH分别为2.0、2.5和3.0)的洗脱结果。当使用NaOH作为再生液时,由于NaOH的洗脱作用过强,基线水平下降明显,说明NaOH会对抗体和芯片产生损伤,不宜使用NaOH作为再生液。当使用pH为2.0和2.5的GLY-HCl时,基线水平增加,说明这2种溶液不能将抗原与抗体彻底分离,抗体结合位点上仍残留有结合的抗原,当抗原累积量越来越多,就会影响检测结果。当使用pH为3.0的GLY-HCl对芯片洗脱时,样品的响应值和基线水平变化幅度较小,说明此再生液具有很好的洗脱效果,既可以将抗原从芯片表面去除,又不损害固定的抗体和芯片表面,因此采用pH为3.0的GLY-HCl作为再生液进行洗脱。
图6 4种再生液的基线水平和样品响应值

NaOH:氢氧化钠 sodium hydroxide;GLY-HCl:甘氨酸-盐酸 glycine-hydrochloric acid。

Fig.6 Baseline levels and sample response values shift with four regeneration buffers

2.3 线性范围和检出限

在空白牛尿液样品中添加沙丁胺醇标准溶液,使其中沙丁胺醇的浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 ng/mL,以沙丁胺醇浓度为横坐标,测得的实际响应值为纵坐标,使用Origin软件线性拟合,标准曲线的相关系数(R2)为0.999 8,方法的线性关系良好(图7)。在此基础上,利用空白牛尿液进行检出限研究,得到本方法沙丁胺醇的最低检出限为0.01 ng/mL[信噪比(S/N)=3]。
图7 尿液中沙丁胺醇标准曲线(0.1~6.0 ng/mL)

Fig.7 Calibration curve of salbutamol in urine (0.1 to 6.0 ng/mL)

2.4 方法的特异性

将相同浓度(4 ng/mL)的沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺标准溶液依次采用本研究建立的方法进行分析后,结果见图8。将HBS-EP缓冲液作为阴性对照,当待测液为莱克多巴胺溶液时,SPR产生的响应值小于0.2 RU,而当通入沙丁胺醇和克伦特罗溶液时,都会产生较为明显的响应信号。这可能是由于克伦特罗和沙丁胺醇的分子结构相似,本研究采用的沙丁胺醇单克隆抗体与克伦特罗存在一定的交叉反应,因此对于采用该SPR筛查方法测得的阳性尿液样品仍需进一步使用UPLC-MS/MS进行确证分析。
图8 SPR免疫传感器对莱克多巴胺的特异性

相对响应值=100×(沙丁胺醇、克伦特罗或莱克多巴胺溶液响应值-HBS-EP缓冲液响应值)/HBS-EP缓冲液响应值。

Fig.8 Specificity of SPR immune-sensor for detection of ractopamine

Relative response value=100×(response values of salbutamol, clenbuterol or ractopamine solutions-HBS-EP buffer response value)/HBS-EP buffer response value.

2.5 方法的稳定性

在(25±3) ℃环境下,重复多次进样5 ng/mL沙丁胺醇标准溶液进行测试,在215个再生周期(进样次数)中响应值均较为稳定;当超过215个周期时,响应值下降约10%,可能由于此时抗体的结合位点被破坏,不能再准确地结合抗原,因此可知此方法在215个周期内较为稳定(图9)。
图9 SPR免疫传感器的稳定性

Fig.9 Stability of SPR immune-sensor

2.6 方法的准确度和精密度

本研究在空白猪、牛和羊尿液基质中设置3个添加浓度(0.5、1.0和5.0 ng/mL),分别进行6次平行试验,连续试验3 d,计算回收率和批内/批间变异系数(RSD),结果见表1。方法的回收率为87.82%~97.67%,批内变异系数为1.51%~2.67%,批间变异系数为2.86%~5.53%,满足残留检测方法学的相关要求。
表1 方法的准确度和精密度

Table 1 Accuracy and precision of the method

项目
Items		 添加浓度
Spiked
concentration/
(μg/L)		 检测浓度
Detected
concentration/
(μg/L)		 批内 Intra-day (n=6) 批间 Inter-day (n=18)
回收率
Recovery/%		 相对标准偏差
RSD/%		 回收率
Recovery/%		 相对标准偏差
RSD/%
猪尿液
Swine urine		 0.5 0.441 88.16 2.13 90.49 3.07
1.0 0.897 89.67 2.05 89.03 2.86
5.0 4.753 95.06 1.51 97.67 4.15
牛尿液
Bovine urine		 0.5 0.459 91.88 1.78 88.59 4.06
1.0 0.894 89.41 1.69 92.43 4.78
5.0 4.391 87.82 1.89 95.36 5.04
羊尿液
Sheep urine		 0.5 0.479 95.73 2.67 90.67 5.53
1.0 0.948 94.82 2.26 93.38 4.41
5.0 4.603 92.06 2.33 97.11 3.79

2.7 与UPLC-MS/MS的实际样品对比分析

分别采用农业行业标准《动物尿液中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法》(NY/T 3146—2017)规定的UPLC-MS/MS和本研究建立的SPR方法对从不同养殖场中采集的54份未知尿液样品(猪、牛和羊尿液各18份)进行测定。结果表明,猪尿液样品检测结果均为阴性,检测出3份阳性(2份牛尿和1份羊尿),UPLC-MS/MS确证结果分别为(2.41±0.27) μg/L、(1.66±0.15) μg/L和(2.39±0.19) μg/L,本研究建立的SPR方法测定结果分别为(2.39±0.33) μg/L、(1.69±0.22) μg/L和(2.47±0.25) μg/L,二者吻合度良好。

3 讨论

3.1 SPR检测方法的确定

目前,基于传统ELISA或胶体金试纸卡快速检测技术对沙丁胺醇等“瘦肉精”的检测主要采用间接检测法,需制备抗原-抗体偶联物,并需要采用酶标或者金标,试验过程较为复杂,标记物的稳定性较差[2,14]。本方法利用氨基偶联的原理直接将沙丁胺醇抗体固定到CM7传感器芯片上,通入待测液,抗原抗体结合引起CM7传感器芯片表面的质量增加,进而引起折射率变化,反映到SPR仪上表现为响应值的变化,从而可以实时检测芯片表面固定的抗体与沙丁胺醇之间的相互作用过程,无需使用酶或其他纳米材料进行复杂的生物标记。本研究建立的SPR免疫传感器灵敏度高,检出限达0.01 ng/mL,远低于传统ELISA法的0.2~1.0 ng/mL[31⇓-33]和胶体金试纸卡的1.0~3.0 ng/mL[34-35]。此外,相比于ELISA法、胶体金等传统生化分析方法,本研究建立的SPR免疫传感器具有无需标记、非破坏性、快速定量和能够在线连续检测等显著优势,可满足现场快速检测的需求,因此本方法有望用于畜产品质量安全监测和现场实时检测。

3.2 抗体固定条件的确定

不同浓度的乙酸钠具有不同的离子强度,对于沙丁胺醇抗体来说,离子强度越低,越能减小抗体分子和芯片表面的羧甲基葡聚糖的静电作用,使二者更好的结合[19,22]。因此,本方法在参考已有研究[18]的基础上,选择10 mmol/L的乙酸钠缓冲液,以尽可能降低离子强度对SPR芯片的影响。此外,由于不同浓度的沙丁胺醇抗体和乙酸钠溶液pH对抗体与芯片的结合也有一定的影响,本研究确定乙酸钠溶液pH为5.0,抗体稀释浓度为50 μg/mL。

3.3 再生条件的确定

当待测液中的抗原与芯片上的抗体发生特异性结合后,会出现累积效应,对下一个循环产生一定的影响,因此需使用具有洗脱效果的溶液将抗原从芯片上去除[22,26]。再生条件对传感器芯片的稳定性、重复性和检测的准确性有较大的影响[28]。在选择再生条件时,要保证再生液既可以将与抗体结合的抗原从芯片表面完全去除,又不损害芯片表面抗体和传感器芯片,保证抗体的全部活性,延长芯片的使用寿命,因此本研究确定了pH为3.0的GLY-HCl溶液作为再生液。

4 结论

本研究建立了无需标记的SPR直接竞争检测法测定动物尿液中沙丁胺醇残留,该方法无需进行复杂的前处理、灵敏度高(检出限达0.01 ng/mL)、稳定性好(可重复进样215次)、准确度(回收率87.82%~97.67%)和精密度(批间变异系数≤5.53%)良好,且操作步骤简便、样本使用量小,适用于大批量动物尿液样品的日常监测,在“瘦肉精”残留检测方面具有良好的应用前景。

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