动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 6: 4057 - 4069

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.375

研究论文

益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草以及二者混合青贮营养品质、发酵品质的影响

  • 李珏 , 1 ,
  • 韩雪林 1, * ,
  • 冯启贤 1 ,
  • 李妍 1, 2 ,
  • 雷俊 3 ,
  • 阳伏林 , 1, ** ,
  • 周晶 , 2, **
展开
  • 1 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福州 350002
  • 2 福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福州 350002
  • 3 甘肃省定西市气象局,定西 743000
**阳伏林,教授,硕士生导师,E-mail: ;
周 晶,助理研究员,硕士生导师,E-mail:

*同等贡献作者

李 珏(1999—),女,四川中江人,硕士研究生,从事饲草加工与生产研究。E-mail:

收稿日期: 2022-11-09

  网络出版日期: 2023-06-08

基金资助

国家自然科学基金项目(42075116)

福建农林大学杰出青年科研人才计划项目(xjq201817)

福建省科技特派员后补助项目(2022S2071)

收起

Effects of Probiotic Additives on Nutritional Quality and Fermentation Quality of Alfalfa and Hybrid Pennisetum and Their Mixed Silage

  • LI Jue , 1 ,
  • HAN Xuelin 1 ,
  • FENG Qixian 1 ,
  • LI Yan 1, 2 ,
  • LEI Jun 3 ,
  • YANG Fulin , 1, ** ,
  • ZHOU Jing , 2, **
Expand
  • 1 College of Animal Sciences (College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
  • 2 China National Engineering Research Center of Juncao Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
  • 3 Meteorological Bureau of Dingxi in Gansu Province, Dingxi 743000, China
**YANG Fulin, professor, E-mail: ;
ZHOU Jing, assistant professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2022-11-09

  Online published: 2023-06-08

Fold

摘要

本试验旨在研究益生菌添加剂对青贮紫花苜蓿和杂交狼尾草以及二者混合青贮营养品质、发酵品质的影响。试验设置3种青贮:紫花苜蓿单独青贮(M青贮)、杂交狼尾草单独青贮(P青贮)和紫花苜蓿与杂交狼尾草重量比为7∶3的混合青贮(MP青贮);每种青贮处理再分别设4个组:对照组(无接种,CK组)、接种1.0×106 CFU/g枯草芽孢杆菌组(BS组)、接种1.0×106 CFU/g布氏乳杆菌组(LB组)和接种0.5×106 CFU/g枯草芽孢杆菌+0.5×106 CFU/g布氏乳杆菌组(BSLB组)。发酵60 d后,分析青贮营养品质、发酵品质,并使用V-score评分体系对发酵效果进行评价。结果表明:M青贮中粗蛋白质(CP)、乳酸(LA)含量显著高于MP和P青贮(P<0.05);P青贮中干物质(DM)含量显著高于M和MP青贮(P<0.05),且pH和丁酸(BA)含量显著低于M和MP青贮(P<0.05)。MP青贮中CP、乙酸(AA)和PA含量显著高于P青贮(P<0.05),中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量显著低于P青贮(P<0.05)。3种青贮中,与CK组相比,BS、LB和BSLB组的AA含量显著提高(P<0.05),pH和氨态氮/总氮(NH3-N/TN)显著降低(P<0.05)。接种益生菌添加剂可抑制青贮有氧暴露时的二次发酵,降低pH增速并抑制酵母菌和好氧细菌的繁殖。除MP青贮中CK、BS组,各组的V-score评分均在80分以上,属于优等级;其中,P青贮中BSLB组的V-score评分最高(98.27分)。综上所述,在杂交狼尾草青贮中同时接种布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌时青贮效果最佳,最具有推广意义。

关键词： 紫花苜蓿; 杂交狼尾草; 枯草芽孢杆菌; 布氏乳杆菌; 青贮; 发酵品质

本文引用格式

李珏 , 韩雪林 , 冯启贤 , 李妍 , 雷俊 , 阳伏林 , 周晶 . 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草以及二者混合青贮营养品质、发酵品质的影响[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(6) : 4057 -4069 . DOI: 10.12418/CJAN2023.375

Abstract

The purpose of this experiment was to investigate the effects of probiotic additives on the nutritional quality and fermentation quality of alfalfa and hybrid Pennisetum and their mixed silage. Three types of silages were set up: alfalfa single silage (M silage), hybrid Pennisetum single silage (P silage) and alfalfa and hybrid Pennisetum mixed silage with a 7∶3 weight ratio (MP silage); and 4 groups were set up for each silage: control group (no inoculation, CK), inoculated 1.0×106 CFU/g Bacillus subtilis group (BS group), inoculated 1.0×106 CFU/g Lactobacillus brucei group (LB group) and inoculated 0.5×106 CFU/g Bacillus subtilis+0.5×106 CFU/g Lactobacillus brucei group (BSLB group), respectively. After 60 d of fermentation, the nutritional quality and fermentation quality of the silage were analyzed, and the fermentation effect was evaluated using the V-score scoring system. The results showed that the crude protein (CP) and lactic acid (LA) contents in M silage were significantly higher than those in MP and P silages (P<0.05); the dry matter (DM) content in P silage was significantly higher than that in M and MP silages (P<0.05), and the pH and butyric acid (BA) content were significantly lower than those in M and MP silages (P<0.05). The CP, acetic acid (AA) and PA contents in MP silage were significantly higher than those in P silage (P<0.05), and the neutral detergent fiber (NDF) and acidic detergent fiber (ADF) contents were significantly lower than those in P silage (P<0.05). In 3 silages, compared with CK group, the AA content of BS, LB and BSLB was significantly increased (P<0.05), and the pH and ammonium nitrogen/total nitrogen (NH3-N/TN) were significantly decreased (P<0.05). The inoculation of probiotic additives could inhibit secondary fermentation during aerobic exposure of silage, reduced the pH increase rate and inhibited yeast and aerobic bacterial propagation. The V-score scores showed that all the groups were above 80 except CK and BS groups in MP silage, which belonged to good level; among them, the BSLB group in P silage had the highest V-score score (98.27). In conclusion, the best silage results were obtained when Lactobacillus brucei and Bacillus subtilis were inoculated simultaneously in hybrid Pennisetum silage, and it is the most meaningful for promotion.

Key words： alfalfa; hybrid Pennisetum; Bacillus subtilis; Lactobacillus buchneri; silage; fermentation quality

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科牧草,因其具有较高的粗蛋白质(CP)含量而广泛应用于反刍动物生产中[1]。然而,苜蓿收割的季节并不适合进行干草加工,因此青贮作为能保留较多营养和提高适口性的青绿饲料保存方法愈发受到人们关注[2]。但苜蓿的水分含量高、可溶性碳水化合物(WSC)含量低、缓冲能力高,较难生产发酵良好的苜蓿青贮[3]。杂交狼尾草(hybrid Pennisetum)是一种多产、可再生的禾本科植物,广泛种植于我国南方地区,可被用作生物能源草,也是这些地区大量使用的牧草[4]。杂交狼尾草具有耐盐、抗旱、生长快、适应性强和WSC含量高[5]等优点,通过青贮处理,能最大程度地保留其营养价值,并提高适口性。但杂交狼尾草粗纤维含量高,且干物质(DM)含量低,单独青贮效果可能不佳。使用混合青贮技术能够弥补单一青贮原料特性的不足,更大程度地保存饲料营养价值[6],从而最大化提高农副产品利用价值,避免浪费资源和造成环境污染等[7]。使用豆科牧草与禾本科牧草进行混合青贮可以综合二者CP和WSC含量高的优势,获得较好的青贮效果。Tao等[8]研究表明,将紫花苜蓿与玉米进行混合青贮能提高DM含量,降低pH、非蛋白氮和氨态氮(NH3-N)含量。Wang等[9]研究表明,将紫花苜蓿与燕麦秸秆和高羊矛进行混合青贮有利于提高发酵质量,并提高了营养价值和体外消化率。但鲜有关于紫花苜蓿与杂交狼尾草混合青贮的研究。青贮虽然能解决牧草贮存问题,有效保留营养价值和提高适口性,但紫花苜蓿的植物特性使得其在实际生产中需要使用青贮添加剂以确保青贮成功并提高发酵品质。不同的青贮添加剂作用效果侧重点不同,但总体而言可以抑制有害细菌增殖,使用适宜的青贮添加剂是促进青贮发酵的有效途径[10]。
益生菌是一种促进和维持动物肠道建康,对动物机体生理功能具有有利影响的活菌[11],其可作为动物饲料添加剂,也可直接饲喂动物。益生菌主要通过调节肠道菌群、促进动物的消化能力与饲料利用率来提高动物的生产性能。益生菌也常作为青贮添加剂应用于青贮生产中。乳酸菌作为最常见的益生菌之一,大量应用于青贮生产中。而布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)是最常使用的一种异型发酵乳酸菌,其发酵过程除了产生乳酸外,还能利用乳酸产生乙酸、1,2-丙二醇和乙醇等物质[12]。Nair等[13]研究表明,乙酸可以在有氧暴露期间抑制酵母菌和霉菌的生长,从而提高青贮有氧稳定性。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也是青贮中常常使用的益生菌添加剂,其主要通过增强有氧稳定性来提高青贮品质。Bai等[14]研究表明,接种1×106 CFU/g枯草芽孢杆菌可以提高玉米青贮的WSC含量,并降低粗纤维含量。也有研究表明接种产抗菌肽枯草芽孢杆菌可以提高紫花苜蓿青贮的发酵品质,并抑制蛋白质水解[15]。
本研究以紫花苜蓿和杂交狼尾草为青贮原料,探究益生菌单独或复合接种对青贮营养品质、发酵品质的影响,比较紫花苜蓿和杂交狼尾草分别单独青贮、二者混合青贮以及接种不同益生菌添加剂的青贮效果,为紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮以及益生菌添加剂的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿取自甘肃省定西市农业试验站,第1茬现蕾期收获,留茬高度2~3 cm。杂交狼尾草取自福建农林大学国家菌草工程技术研究中心菌草培育基地,第1茬拔节期收获,留茬高度8~10 cm。将采得的试验材料运回实验室后立即进行营养品质分析,紫花苜蓿和杂交狼尾草的原料特性见表1。枯草芽孢杆菌和布氏乳杆菌购于北京某生物技术研究院。
表1 紫花苜蓿和杂交狼尾草的原料特性

Table 1 Characteristics of raw materials of alfalfa and hybrid Pennisetum

项目
Items		 紫花苜蓿
Alfalfa		 杂交狼尾草
Hybrid Pennisetum
pH 6.29±0.01 6.18±0.00
干物质 DM/(g/kg FW) 196.08±4.78 164.29±5.72
粗蛋白质 CP/(g/kg DM) 288.60±6.95 81.40±5.36
中性洗涤纤维 NDF/(g/kg DM) 396.00±4.00 652.90±10.03
酸性洗涤纤维 ADF/(g/kg DM) 287.30±17.89 353.00±4.03
可溶性碳水化合物 WSC/(g/kg DM) 47.80±0.83 61.30±1.54
乳酸菌 LAB/[lg(CFU/g FW)] 5.22±0.37 3.29±0.24
酵母菌 Yeast/[lg(CFU/g FW)] 4.53±0.22 4.11±0.26
好氧菌 AB/[lg(CFU/g FW)] 6.09±0.22 4.42±0.31
霉菌 Mould/[lg(CFU/g FW)] ND 2.26±0.35

ND表示未检测出。

ND means not detected.

1.2 试验设计

试验采用双因素设计。设置3种青贮处理:紫花苜蓿单独青贮(紫花苜蓿∶杂交狼尾草=10∶0,M青贮)、紫花苜蓿与杂交狼尾草混合青贮(紫花苜蓿∶杂交狼尾草=7∶3,MP青贮)和杂交狼尾草单独青贮(紫花苜蓿∶杂交狼尾草=0∶10,P青贮)。每种青贮处理再分别设4个组,分别为接种枯草芽孢杆菌的BS组(枯草芽孢杆菌添加量为1.0×106 CFU/g)、接种布氏乳杆菌的LB组(布氏乳杆菌添加量为1.0×106 CFU/g)、接种混合菌的BSLB组(枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌添加量分别为0.5×106和0.5×106 CFU/g)及用于对照的CK组(添加等量无菌水)。

1.3 试验方法

将采集的紫花苜蓿和杂交狼尾草室温萎蔫24 h后,再用铡刀分别切至1~2 cm备用。将紫花苜蓿和杂交狼尾草分别按照鲜重质量10∶0、7∶3和0∶10的比例混匀,按试验设计将菌液或无菌水喷施于各组样品上。混合均匀后迅速装入青贮袋中,每袋约400 g。将青贮袋抽真空密封后在室温下存放发酵。每组设3个重复。发酵60 d后开袋取样测定营养成分含量、发酵品质。有氧暴露的时间点分别为开袋后0、3、6、9 d,于以上时间点对各组分别进行取样,测定pH及微生物数量。

1.4 测定指标

1.4.1 青贮营养成分含量测定

青贮60 d后开封,每袋取200 g于65 ℃烘箱中烘至恒重后,称重计算DM含量。将烘干的样品进行粉碎,过40目筛后用于其余营养成分含量的测定。使用KDN-103F凯氏定氮仪(GB/T 6432—2018)测定CP含量,使用硫酸蒽酮法[16]测定WSC含量,采用范氏分析法[17]测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。

1.4.2 青贮发酵指标测定

各袋青贮分别取10 g混匀样品,加90 mL蒸馏水,置于4 ℃冰箱中密封浸提24 h,4层纱布过滤后即为浸提液,用于测定pH、NH3-N和有机酸含量。pH使用pH计测量。NH3-N含量使用苯酚-次氯酸钠比色法[18]测定,并计算氨态氮/总氮(NH3-N/TN)。乳酸(LA)含量使用对羟基联苯法测定,其余有机酸[乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)]含量使用高效液相色谱仪测定[19]。

1.4.3 青贮微生物数量测定

各组分别取5 g混匀样品,加入45 mL无菌水,振荡培养1 h后用于微生物计数。使用MRS培养基于37 ℃培养48 h计数乳酸菌(LAB)数量;使用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)于30 ℃培养24~48 h计数酵母菌(yeast)和霉菌(mold)数量;使用平板计数琼脂培养基(PCA)于30 ℃培养48 h计数好氧性细菌(aerobic bacteria,AB)数量[20]。

1.4.4 青贮V-score评分

青贮V-score评分是按照NH3-H/TN、AA+PA含量、BA含量来进行评价的青贮品质评分体系,使用该评分结果可将青贮品质分为优(>80分)、良(60~80分)和不良(<60分)[21]。V-score评分标准见表2。
表2 V-score评分标准

Table 2 V-score scoring standard

总评分
Total score		 氨态氮/总氮 NH3-H/TN 乙酸+丙酸 AA+PA 丁酸 BA
含量
Content/%		 得分
Score		 含量
Content/%		 得分
Score		 含量
Content/%		 得分
Score
>80 ≤5 50 ≤0.2 10 0~0.5 40-80XB
60~80 5~10 60-2XN 0.2~1.5 (150-100XA)/13 >0.5 0
<60 10~20 80-4XN >1.5 0

XN、XA和XB分别代表氨态氮/总氮、乙酸+丙酸和丁酸含量。

XN, XA and XB represented NH3-N/TN and contents of AA+PA and BA, respectively.

1.5 数据统计分析

使用Excel 2010进行基础数据统计整理,使用SPSS 25.0数据处理系统进行单因素、双因素方差分析,固定效应是原料比例、益生菌添加剂以及二者之间的相互作用。采用Duncan氏法进行多重比较,使用Origin进行绘图。试验结果用平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮营养成分的影响

由表3可见,原料比例对各营养成分含量均有极显著影响(P<0.01)。随着杂交狼尾草在青贮中所占比例的增加,CP含量显著减少(P<0.05),NDF、ADF含量显著增加(P<0.05)。益生菌添加剂对各营养成分含量均有极显著影响(P<0.01)。益生菌添加剂和原料比例的交互作用对DM、CP、NDF、ADF、WSC含量均有极显著影响(P<0.01)。3种青贮中,LB组的DM含量均最高,分别为215.95、208.81和249.78 g/kg。P青贮中,BS组的CP含量为65.94 g/kg,显著高于其他各组(P<0.05);MP青贮中,LB组的CP含量为171.10 g/kg,显著高于其他各组(P<0.05)。P青贮中,各益生菌添加组的NDF、ADF含量与CK组相比均有降低,但无显著差异(P<0.05);M青贮中,BSLB组的NDF、ADF含量最低,显著低于其他各组(P<0.05);MP青贮中,LB组的NDF、ADF含量最低,显著低于其他各组(P<0.05)。M青贮中,各益生菌添加组的WSC含量与CK组相比都略有增加,但无显著差异(P>0.05);MP青贮中,LB组的WSC含量最高,显著高于其他各组(P<0.05);P青贮中,CK组的WSC含量最高,显著高于BS和BSLB组(P<0.05)。
表3 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮营养成分的影响(干物质基础)

Table 3 Effects of probiotic additives on silage nutrient components of alfalfa and hybrid Pennisetum (DM basis)g/kg

处理
Treatments		 组别
Groups		 干物质
DM		 粗蛋白质
CP		 中性洗涤纤维
NDF		 酸性洗涤纤维
ADF		 可溶性碳水化合物
WSC
CK 199.14±4.71Bb 196.41±5.53A 386.14±9.58Ca 289.96±2.81Ca 28.48±1.24A
M青贮 BS 207.90±5.46Bab 200.75±3.25A 385.69±5.63Ca 293.54±4.37Ca 29.09±1.04B
M silage LB 215.95±3.84Ba 198.21±6.00A 375.36±5.95Ca 280.01±8.50Cb 30.61±1.24B
BSLB 212.14±4.87Ba 196.88±1.18A 352.99±1.75Cb 267.23±1.78Cc 30.28±2.07A
CK 202.53±5.21Bab 146.55±0.81Bd 484.85±8.49Ba 347.54±8.61Ba 27.45±2.84Ab
MP青贮 BS 196.22±2.10Cb 155.15±5.62Bc 464.57±3.55Bb 335.92±3.28Bb 27.23±1.52Ab
MP silage LB 208.81±4.57Ba 171.10±2.49Ba 449.99±3.09Bc 317.56±5.17Bc 33.23±0.48Aa
BSLB 201.68±3.94Cab 164.42±1.89Bb 484.46±3.79Ba 346.98±1.19Aa 26.04±1.09Bb
CK 222.23±3.52Ac 51.81±0.26Cc 592.68±8.40A 376.79±9.75A 26.65±0.95Aa
P青贮 BS 222.75±5.21Ac 65.94±2.46Ca 581.21±3.96A 368.75±15.76A 23.75±1.33Ab
P silage LB 249.78±9.65Aa 58.79±2.18Cb 589.44±5.18A 361.74±6.36A 25.21±0.77Cab
BSLB 238.18±3.80Ab 54.49±4.72Cbc 586.22±5.64A 358.45±13.33A 17.46±0.83Cc
P值 P-value
原料比例
Raw material proportion		 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
益生菌添加剂 Probiotic additive <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
原料比例×益生菌添加剂
Raw material proportion×
probiotic additive		 0.007 <0.001 <0.001 0.003 <0.001

同列数据肩标不同小写字母表示相同处理不同组别间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示相同组别不同处理间差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表4同。

Data in the same column with different small letter superscripts mean significant difference among different groups in the same treatment (P<0.05), with different capital letter superscripts mean significant difference among different treatments in the same group (P<0.05), and with the same of no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4.

2.2 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮发酵品质的影响

由表4可见,原料比例对各发酵品质指标均有极显著影响(P<0.01)。随着杂交狼尾草在青贮中所占比例的增加,pH和AA含量显著降低(P<0.05)。益生菌添加剂对各发酵品质指标均有极显著影响(P<0.01)。与CK组相比,各益生菌添加组的pH、NH3-N/TN显著降低(P<0.05),LA、AA含量显著提高(P<0.05)。益生菌添加剂和原料比例的交互作用对各发酵品质指标均有极显著影响(P<0.01)。M、P青贮中,LB组的pH最低。M、P青贮中,各益生菌添加组的LA含量均显著高于CK组(P<0.05),BSLB、BS组的LA含量最高,分别为26.12和21.26 g/kg;MP青贮中,LB和BSLB组的LA含量显著高于CK组(P<0.05),且以LB组最高,为25.43 g/kg。3种青贮中,各青贮益生菌添加组的AA含量均显著高于CK组(P<0.05)。3种青贮中,LB组的PA含量最高,显著高于CK组(P<0.05)。M青贮中,各益生菌添加组的BA含量均显著低于CK组(P<0.05);MP青贮中,各益生菌添加组的BA含量均显著高于CK组(P<0.05);P青贮中,BS和BSLB组的BA含量显著高于CK组(P<0.05)。3种青贮中,各益生菌添加组的NH3-H/TN均显著低于CK组(P<0.05);其中,M、P青贮中BS组的NH3-H/TN最低,MP青贮中LB组的NH3-H/TN最低,与CK组相比分别下降了1.75%、2.37%和4.67%。
表4 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮发酵品质的影响

Table 4 Effects of probiotic additives on silage fermentation quality of alfalfa and hybrid Pennisetum

处理
Treatments		 组别
Groups		 pH 乳酸
LA
(g/kg DM)		 乙酸
AA
(g/kg DM)		 丙酸
PA
(g/kg DM)		 丁酸
BA
(g/kg DM)		 氨态氮/总氮
NH3-H/
TN
CK 5.89±0.00Aa 21.15±0.42Ac 3.06±0.06Ad 5.76±0.13Bb 0.89±0.03Aa 8.78±0.06Ba
M青贮 BS 5.87±0.01Ab 24.10±0.25Ab 4.68±0.01Aa 4.15±0.01Bd 0.45±0.03Bc 7.03±0.11Bd
M silage LB 5.66±0.01Ad 24.92±0.66Ab 3.98±0.02Ab 6.24±0.01Ba 0.71±0.01Ab 8.24±0.17Ab
BSLB 5.80±0.00Ac 26.12±0.56Aa 3.75±0.00Ac 4.67±0.06Bc 0.70±0.09Ab 7.88±0.26Ac
CK 5.47±0.01Ba 19.77±0.15Bc 1.75±0.04Bd 6.28±0.03Ab 0.35±0.03Bd 11.76±0.48Aa
MP青贮 BS 5.43±0.01Bb 17.76±0.33Cd 2.07±0.01Bc 5.30±0.03Ac 0.64±0.04Ab 11.06±0.02Ab
MP silage LB 5.28±0.00Bc 25.43±0.28Aa 2.48±0.04Ba 6.50±0.08Aa 0.43±0.04Bc 7.09±0.04Bd
BSLB 5.25±0.00Bd 21.25±0.43Bb 2.14±0.02Bb 5.28±0.03Ac 0.71±0.03Aa 7.69±0.08Ac
CK 4.37±0.02Ca 16.41±0.67Cc 0.56±0.01Cd 4.18±0.02Cb 0.03±0.00Cc 5.06±0.03Ca
P青贮 BS 4.05±0.01Cc 21.26±0.71Ba 1.02±0.03Ca 2.34±0.01Cd 0.13±0.01Ca 2.69±0.06Cd
P silage LB 4.04±0.01Cc 15.84±0.18Bc 0.94±0.01Cb 5.57±0.02Ca 0.03±0.00Cc 3.35±0.10Cc
BSLB 4.20±0.01Cb 18.31±0.38Cb 0.76±0.02Cc 2.83±0.02Cc 0.06±0.00Bb 3.57±0.11Bb
原料比例
Raw material proportion		 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
益生菌添加剂
Probiotic additive		 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
原料比例×益生菌添加剂
Raw material proportion×
probiotic additive		 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.3 青贮V-score评分

由表5可见,除MP青贮中CK、BS组,各组的V-score评分均在80分以上,属于优等级。其中,P青贮中BSLB组的V-score评分最高,为98.27分;MP青贮中LB组的V-score评分最高,为87.03分;M青贮中BS组的V-score评分最高,为87.10分。仅从不同青贮原料进行评价时,P青贮的平均V-score评分最高;仅从不同益生菌添加剂进行评价时,BSLB组的平均V-score评分最高。
表5 青贮V-score评分

Table 5 V-score score of silage

处理
Treatments		 组别
Groups		 氨态氮/总氮
NH3-H/TN		 乙酸+丙酸
AA+PA		 丁酸
BA		 总评分
Total
score		 等级
Grade		 排名
Rank
含量
Content/%		 得分
Score		 含量
Content/%		 得分
Score		 含量
Content/%		 得分
Score
CK 8.78 42.44 0.88 4.75 0.09 32.88 80.08 优 10
M青贮 BS 7.03 45.95 0.88 4.75 0.05 36.40 87.10 优 5
M silage LB 8.24 43.52 1.02 3.67 0.07 34.32 81.51 优 9
BSLB 7.88 44.24 0.84 5.06 0.07 34.40 83.70 优 8
CK 11.76 32.96 0.80 5.36 0.04 37.20 75.52 良 12
MP青贮 BS 11.06 35.77 0.74 5.87 0.06 34.88 76.52 良 11
MP silage LB 7.09 45.81 0.89 4.66 0.04 36.56 87.03 优 6
BSLB 7.69 44.62 0.74 5.83 0.07 34.32 84.77 优 7
CK 5.06 49.88 0.47 7.89 0.00 39.70 97.47 优 3
P青贮 BS 2.69 50.00 0.34 8.95 0.01 38.95 97.91 优 2
P silage LB 3.35 50.00 0.65 6.53 0.00 39.77 96.30 优 4
BSLB 3.57 50.00 0.36 8.77 0.01 39.50 98.27 优 1

2.6 有氧暴露后青贮料pH和主要微生物数量的变化

由图1可知,有氧暴露后,3种青贮中,各组的pH均呈上升趋势,但在有氧暴露前3 d基本稳定。有氧暴露3 d时,M、P青贮中各组和MP青贮中CK组的pH增幅较大,有氧暴露6 d时,MP青贮中各益生菌添加组的pH增幅较大。有氧暴露9 d时,M、MP青贮中BS组的pH显著低于其他各组(P<0.05),P青贮中LB组的pH显著低于其他各组(P<0.05)。
图1 pH随有氧暴露天数的变化

数据柱标注不同小写字母表示相同天数不同组别间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示相同组别不同天数间差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。

Fig.1 Change of pH with aerobic exposure days

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference among different groups in the same day (P<0.05), with different capital letter superscripts mean significant difference among different days in the same group (P<0.05), with the same of no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

由图2和图3可知,3种青贮处理中,各组的酵母菌和AB数量均随着有氧暴露天数的增加而增加。有氧暴露3和9 d时,MP青贮中CK组的酵母菌数量显著高于其他组(P<0.05)。有氧暴露9 d时,M、MP、P青贮中LB组的酵母菌数量均为最低。有氧暴露前3 d,M青贮中BS、LB、BSLB组的AB数量较为稳定,有氧暴露6 d后开始显著增加(P<0.05);但在有氧暴露9 d时,各组之间AB数量无显著差异(P>0.05)。MP青贮中LB、BSLB组的AB数量在有氧暴露前6 d增幅较缓,在有氧暴露6 d后增幅较大,有氧暴露3 d后CK组的AB数量始终高于其他各组。有氧暴露9 d时,BS、LB、BSLB组的AB数量显著低于CK组(P<0.05)。有氧暴露0 d时,P青贮的AB数量低于其他2种青贮处理,但随着有氧暴露时间增加,AB数量增长的速率快于其他2种青贮处理。有氧暴露9 d时,P青贮中BSLB组的AB数量显著低于其他各组(P<0.05)。
图2 酵母菌数量随有氧暴露天数的变化

Fig.2 Change of yeast number with aerobic exposure days

图3 AB数量随有氧暴露天数的变化

Fig.3 Change of AB number with aerobic exposure days

3 讨论

3.1 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮营养成分的影响

本研究中使用的紫花苜蓿CP含量较高,是优质的蛋白质饲料来源,但WSC含量较低,不利于单独进行青贮发酵;杂交狼尾草的WSC含量较高,但自身DM含量较低,附着乳酸菌数量低于5.00 lg(CFU/g),因此需要外源添加以保证发酵。同时杂交狼尾草鲜样的NDF、ADF含量也非常高,会大大降低动物的消化性能。在杂交狼尾草鲜样中检出了霉菌,与Bonaldi等[22]的研究结果相似,这可能是因为原料采集过程中接触到土壤而附带上了少量霉菌。王永珍等[23]将紫花苜蓿与禾本科植物甜高粱按7∶3的比例进行混合青贮,与紫花苜蓿单贮相比提高了CP、DM含量,降低了pH,提高了发酵品质。佟明昊等[24]将紫花苜蓿与高丹草按7∶3的比例进行混合青贮,获得了较低pH和AA、PA含量及较高DM、WSC含量的青贮饲料。考虑到二者的原料特性,按7∶3的比例将紫花苜蓿和杂交狼尾草进行混合青贮,紫花苜蓿中的高CP含量与杂交狼尾草中较高的WSC含量相结合,更有利于获得高蛋白质与发酵良好的优质青贮。
青贮后的DM含量是评价青贮营养成分的主要指标之一,在青贮发酵过程中DM含量变化主要是由于植物本身呼吸作用与一些好氧微生物活动[25]。在本研究的M和P青贮中,与CK组相比,各益生菌添加组的DM含量均有增加,与Bai等[15]研究结果一致,这说明接种益生菌添加可以有效阻止青贮过程中微生物对DM的降解作用。在MP青贮中,各益生菌添加组的DM含量都低于M、MP青贮中对应益生菌添加组,可能是因为杂交狼尾草鲜料的低DM含量降低了混合青贮的DM含量,这可能与杂交狼尾草的刈割时期有关。
青贮期间,CP降解为非蛋白氮、NH3-N和胺类物质等,主要是由于植物蛋白酶作用和好氧微生物的活动[26],但在青贮过程中,随着pH下降植物蛋白酶活性和微生物活动都会被抑制,从而减少蛋白质水解。本研究中,3种青贮中各益生菌添加组的CP含量均高于CK组,且各益生菌添加组的NH3-N/TN也都显著低于CK组,说明BS、LB单独使用或二者联用都可以起到保留蛋白质、抑制蛋白质水解的作用。M青贮中BSLB组的CP含量无显著增加,MP青贮中BSLB组的CP含量介于BS、LB组之间,可能是因为枯草芽孢杆和布氏乳杆菌之间存在拮抗作用[27]。
WSC作为青贮发酵过程中的底物,其含量决定着青贮发酵的程度。在本试验中,P青贮中各益生菌添加组的WSC含量均低于CK组,这是因为接种枯草芽孢杆菌和布氏乳杆菌会加速利用葡萄糖等WSC。MP青贮中LB组的WSC含量高于其他各组,且提高了DM含量,这与Da Silva等[28]的研究结果一致,这可能是因为布氏乳杆菌能够促进结构性碳水化合物的降解,从而增加WSC含量[29]。M青贮中BS、LB和BSLB组的WSC含量相较于CK组均有增加但没有显著差异,但可以观察到纤维含量较低的组WSC含量较高,这可能是因为枯草芽孢杆和布氏乳杆菌通过促进结构性碳水化合物降解从而补充了布氏乳杆菌对糖源的消耗,增加了WSC含量[22]。
饲料中的纤维部分不易被动物利用,过多时还会影响饲料的口感,从而降低采食量。青贮能够对纤维起到一个预处理的作用,进而提高动物采食和饲料利用率。本研究表明,接种枯草芽孢杆和布氏乳杆菌可以有效降低ADF、NDF含量,这与Nsereko等[30]和Lara等[31]的研究结果一致,可能是因为经布氏乳杆菌处理后的青贮pH较低,对纤维具有更强的酸解能力,且枯草芽孢杆菌也能够分泌如阿魏酸酯酶、ɑ-淀粉酶等多种能够水解木质素与半纤维素之间酯键的酶及细菌素,从而促进对NDF、ADF的降解作用[32]。但在P青贮中,各益生菌添加组的NDF、ADF含量虽有下降但无显著差异,与Comino等[33]的研究结果类似,这可能是因为益生菌添加剂对不同原料青贮的作用效果有所差异。

3.2 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮发酵品质的影响

pH是青贮发酵质量最直观的指标,在本研究中,3种青贮中BS、LB和BSLB组与CK相比均显著降低了pH,与Bai等[15]的研究结果一致,可能是因为接种益生菌使青贮中LA、AA等有机酸含量增加。Guo等[34]研究发现,接种异源发酵乳酸菌可以在一定程度上促进植物乳杆菌等同型发酵乳酸菌的增长,导致pH下降。葛剑等[35]研究表明,在裸燕麦和紫花苜蓿混合青贮中随着裸燕麦添加比例的增加,青贮pH显著降低。而在本试验中,M、MP、P青贮中各益生菌添加组的pH依次显著降低,说明杂交狼尾草单独青贮具有较好的发酵品质,加入适量杂交狼尾草可以降低紫花苜蓿混合青贮的pH,从而提高青贮品质,这可能是因为杂交狼尾草鲜样中较高的WSC含量保证了乳酸菌发酵。
NH3-N含量反映了青贮发酵体系中蛋白质的降解程度,NH3-N/TN越小说明饲粮蛋白质保存得越好。在3种青贮中,各益生菌添加剂组的NH3-N/TN均显著低于CK组。Bai等[15]研究发现,枯草芽孢杆菌和布氏乳杆菌以及两者混用可以显著降低紫花苜蓿青贮中的NH3-N/TN,与本试验结果一致,这可能是因为接种布氏乳杆菌可以增加LA、AA含量以降低青贮pH来抑制植物蛋白酶和蛋白酶解梭状芽孢杆菌的活性[36]。枯草芽孢杆菌可能是通过分泌多种低分子质量抗菌肽及细菌素类的抗菌物质来抑制青贮初期梭状芽孢杆菌和霉菌等不良微生物对蛋白质的降解作用[37]。MP青贮中CK组的NH3-N/TN最高,可能是因为杂交狼尾草鲜样中检出了霉菌,这些有害菌参与了降解蛋白质生成NH3-N的过程。而在P青贮中各益生菌添加组NH3-N/TN均在3种青贮中最低,这可能是因为P青贮的pH较低,除CK组外都低于4.2,有效抑制了梭菌等有害菌造成的蛋白质损失,从而保证了青贮品质。
LA是青贮发酵的主要产物,也是保证青贮发酵环境的主要有机酸。本研究中,M青贮中BS、LB和BSLB组的LA含量均显著增加,且BSLB组最高,这可能是因为枯草芽孢杆菌和布氏乳杆菌均能够在一定程度上促进同型发酵乳酸菌生长[38],二者互作可能增强促进作用产生更多LA。P青贮中LB组的LA含量最低,可能是因为布氏乳杆菌会将部分乳酸厌氧转化为乙酸和1,2-丙二醇,然后将其代谢为丙酸[12,39],这可能也是LB组PA含量高于其他组的原因。本研究中,3种青贮中BS、LB和BSLB组的AA含量均高于CK组,这一结果与穆胜龙等[40]的研究结果一致,这是因为LB主要发酵产物是AA,且Lara等[31]研究表明,枯草芽孢杆菌可以通过抑制酵母菌和提高有机物消化率来提高玉米青贮的AA含量。梭状芽孢杆菌是青贮过程中的主要有害菌,其能够分解葡萄糖、乳酸和氨基酸,从而降低青贮品质,而梭状芽孢杆菌发酵的主要终产物丁酸具有恶臭,一般认为丁酸含量低于DM的百分之一,青贮发酵较好[41]。在本研究中,各组BA含量均小于DM含量的1%,说明青贮料的发酵品质较好。且M青贮中BS、LB和BSLB组的BA含量均显著低于CK组,这说明接种益生菌添加剂可以有效抑制梭菌发酵,从而生产出品质较好的青贮饲料。而随着杂交狼尾草在青贮原料里所占比例的增加,BA含量逐渐减少,可能是因为加入杂交狼尾草降低了青贮pH,抑制了梭状芽孢杆菌发酵。
V-score评价体系将AA、PA、BA含量和NH3-H/TN都视为负面指标,其数值越低,所占的评分就越高。NH3-N/TN小于5时,得分等于50分,即此项满分,P青贮中除CK组外其余组得分皆为50分,说明杂交狼尾草单独青贮时蛋白质降解效率不高,并且P青贮中AA+PA含量与BA含量得分也明显高于另外2种青贮处理,这可能是因为P青贮的较低pH抑制了除LA以外其他挥发性脂肪酸的生成。与紫花苜蓿和杂交狼尾草各自单独青贮相比,将紫花苜蓿与杂交狼尾草按7∶3的比例进行混合青贮并没有促进青贮的优质发酵。M、MP、P青贮中CK组的V-score评分最低,说明接种益生菌添加剂可以有效提高青贮发酵品质,并且接种布氏乳杆菌提高混合青贮发酵品质的效果最佳。

3.3 益生菌添加剂对紫花苜蓿和杂交狼尾草青贮有氧暴露期间主要微生物数量的影响

青贮中的好氧腐败菌数量与青贮抗氧化能力密切相关,并影响着青贮是否能够长期保存[42]。青贮开袋后,氧气进入会激活酵母菌等进行生命活动,分解饲料中的LA、WSC等营养物质,产生水和二氧化碳,使得pH升高,促进其他好氧腐败菌生长,分解青贮中的营养物质使青贮腐败变质,缩短青贮保存时间[43-44]。AA具有强抗真菌特性[45],接种布氏乳杆菌可以通过提高AA含量来抑制酵母菌生长,从而抑制好氧腐败菌生长,提高有氧稳定性[46]。本试验中,M和P青贮中,各组的pH在有氧暴露0~3 d变化较为平缓,MP青贮中BS、LB、BSLB组的pH在有氧暴露0~6 d变化较小,且有氧暴露9 d时3种青贮中CK组的pH显著高于各益生菌添加组,说明枯草芽孢杆菌和布氏乳杆菌单独或联合使用都能在一定程度上抑制青贮饲料在有氧暴露时的pH升高。在氧暴露3 d后,M、P青贮中各组pH迅速上升,在氧暴露9 d后,MP青贮中各组pH迅速上升,这可能是因为有氧暴露后随着空气进入,酵母菌繁殖活动加强,因而大量利用LA进行二次发酵产生乙醇和二氧化碳等[47]。与CK组相比,有氧暴露后各益生菌添加组的酵母菌和AB数量都显著降低,与Liu等[42]和Lara等[31]的研究结果一致,这可能是因为枯草芽孢杆菌具有很强的抗氧化性,其分泌具有抗菌活性的类细菌素代谢物,与布氏乳杆菌协同抑制酵母菌和AB等有害菌活动,从而抑制青贮有氧暴露时的好氧腐败,保留更多营养物质并延长青贮料保存时间。

4 结论

单独接种枯草芽孢杆菌、布氏乳杆菌及二者联用可以提高青贮紫花苜蓿和杂交狼尾草以及二者混合青贮的营养品质和发酵品质,并抑制了有氧暴露后青贮中有害菌生长。紫花苜蓿和杂交狼尾草以7∶3的比例进行混合青贮能够降低pH以提高发酵品质。V-score评分结果显示,杂交狼尾草青贮中同时接种布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵效果最好。

感谢生态草牧业实验室的张磊、张娟、周燚、刘一佳、凌文卿等同学在试验过程中提供的帮助!

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