消化道强有力的消化吸收功能、完整的物理屏障、特异的化学屏障、稳定的微生物结构和适度的黏膜免疫可有效维持动物健康和发挥生产潜力[1]。消化道是动物接受环境刺激(营养物质、毒素及微生物等)的主要场所,其能量消耗和底物代谢十分活跃。改变饲粮结构可影响消化道营养物质消化及代谢模式,继而影响外周组织有效营养物质的供应和机体代谢。消化道与饲粮养分和外源微生物直接接触,因而成为机体免疫系统的重要组成部分,可识别并耐受无害抗原,保护肠黏膜免受有害抗原的侵害。维持消化道免疫耐受与免疫反应的平衡需要消化道上皮细胞和免疫细胞的交互调节。免疫稳态的破坏会导致炎症的发生,影响机体养分的分配。本文综合分析了反刍动物消化道免疫构成及免疫激活状态下的养分重分配规律,旨在为系统性调控反刍动物消化道健康、改善动物福利和生产性能提供参考。
1 反刍动物消化道免疫系统的组成
消化道是反刍动物微生物定植、营养物质消化吸收和免疫防御的重要器官。结构和功能完善的物理屏障、化学屏障和微生物屏障,以及适度的黏膜免疫可有效保障反刍动物生长发育、机体健康和高生产潜力的发挥。
1.1 物理屏障
消化道上皮构成了消化道物理屏障。瘤胃是反刍动物特有的消化器官,可共生大量微生物(细菌、真菌、古菌和原虫等),其既有饲粮养分的降解也有新物质的合成。瘤胃上皮的乳头状突起为复层上皮,分为最外层的角质层、中部的颗粒层和棘突层以及内侧的基底层,可防止瘤胃内微生物、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等物质直接进入机体。瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)可通过瘤胃上皮吸收进入门静脉,其中丙酸在肝脏中进行糖异生为机体供能。健康的瘤胃上皮细胞可高效转运VFA,以维持瘤胃内环境的稳态。因此,健康的瘤胃上皮功能是反刍动物维持机体健康和高生产性能的基础。与瘤胃上皮结构不同,肠道上皮为单层柱状上皮。小肠上皮可形成绒毛和隐窝结构,大幅增加养分吸收面积;结肠、直肠主要以隐窝结构为主,且与肠黏膜黏蛋白的分泌有关。此外,上皮细胞间的紧密连接是调控消化道上皮通透性的主要结构。消化道内容物具有高度免疫原性,食糜中的微生物、LPS等大分子物质突破消化道物理屏障可导致局部炎症反应,而易位的大分子物质还可通过门静脉进入肝脏,激活炎症通路,引起全身性炎症反应。这些炎症和应激反应通过促进肌球蛋白轻链激酶的表达引起肌动蛋白-肌球蛋白丝的收缩,从而开放上皮紧密连接,提高上皮通透性。
1.2 化学屏障
消化道化学屏障主要包括消化道内pH、消化酶、VFA、微生物代谢产物、胆汁酸、溶菌酶、黏多糖及过氧化氢等。消化道内环境pH对消化道上皮功能的影响较大。高淀粉饲粮或者淀粉降解率高的饲粮在瘤胃内降解可产生大量VFA,降低瘤胃pH,引发急性瘤胃酸中毒或亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA)。瘤胃酸中毒不仅会导致瘤胃上皮通透性的增加,使大分子物质易位,还会抑制瘤胃上皮对VFA的吸收,破坏细胞间黏附,导致瘤胃乳头损伤和超微结构的破坏,引起上皮脱落。唾液是反刍动物瘤胃内重要的缓冲体系,生产中通常通过提高饲粮中物理有效中性洗涤纤维(physically effective neutral detergent fiber,peNDF)的含量以刺激反刍和唾液分泌。瘤胃上皮对VFA的吸收可耦合瘤胃上皮碳酸氢根离子($\text{HCO}_{3}^{-}$)的分泌和氢离子(H+)的吸收,高产奶牛瘤胃上皮分泌的$\text{HCO}_{3}^{-}$的量与唾液提供的$\text{HCO}_{3}^{-}$的量相近。因此,提高瘤胃pH有助于维持瘤胃健康和瘤胃上皮养分的吸收,保障生产性能的发挥。肠道上皮结构为单层柱状上皮,更易受肠腔内环境的影响。肠道中酸碱缓冲体系缺失导致肠道对低pH环境更加敏感。与瘤胃类似,淀粉在反刍动物后肠的发酵可产生VFA,降低食糜pH。淀粉的过度发酵也可导致微生态失调,引起后肠酸中毒和LPS、生物胺的积累,以及黏膜的损伤、通透性的增加和炎症的发生。粪便低pH不仅反映了前肠淀粉的不完全消化,还反映了中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)大肠补偿性发酵的减少。后肠pH过低可引起肠黏膜屏障功能障碍,提高黏膜的通透性,引起肠道上皮屏障功能障碍反复发生。因此,提高淀粉在反刍动物瘤胃和小肠的消化,避免淀粉在大肠中消化是在高淀粉饲粮条件下缓解后肠酸中毒的营养调控策略。
1.3 微生物屏障
消化道微生物在调控饲粮养分消化吸收、宿主能量利用效率和维持宿主正常生理功能等方面发挥着重要作用。瘤胃微生物可发酵饲粮中的淀粉、蛋白质和纤维素等,并合成新的物质,为机体的生命和生产活动提供所需的营养物质。由于肠道是养分消化吸收的重要场所,因此肠道微生物多数与肠道代谢、生理和免疫过程有关。肠道微生物与肠道上皮免疫存在相互作用,在抵抗致病微生物入侵、维持上皮免疫稳态和消化道健康等方面发挥重要功能。随着食糜在消化道中的流动,营养物质的流动、微生物的迁移和代谢物的流转可能会对消化道功能产生影响。
微生物屏障是指在消化道内定植的区系稳定、功能正常的微生物菌群。微生物是连接消化道内养分、代谢物与宿主功能的枢纽。微生物可根据动物饲粮组成的变化调整其生存状态,并占据消化道的不同生态位以实现与宿主共生。反刍动物消化道为微生物提供了营养物质和定植场所。消化道通过蠕动、胰酶的分泌、化学物质(胃酸、胆汁酸等)的分泌以及抗菌肽和免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)的分泌等方式调控微生物在消化道定植的内环境,因而构建起宿主调控微生物定植的生境过滤机制。
健康个体中,消化道有益微生物可通过定植抗性,即利用多种机制(细菌素和VFA的分泌、生态位竞争及上调宿主免疫反应等)抑制或限制内源、外源致病微生物定植以保护消化道健康。微生物可通过强有力的非特异性生态位竞争或产生细菌素以抑制彼此的生长。稳态条件下,消化道内不同位点的生态位被不同的共生微生物占据,并与宿主产生复杂的相互作用。一般认为,具有相同生态位的2个物种不能长期共存。消化道共生微生物通过消耗消化道内大部分的养分以限制致病微生物的定植和增殖。因此,营养调控可改变进入反刍动物消化道不同位点的营养素(淀粉、蛋白质和纤维素等)的流通量,从而影响消化道微生物对内源、外源致病微生物的抵抗。微生物还可通过促进黏液屏障功能、维持肠道缺氧、诱导消化道上皮抗菌肽分泌及上调宿主免疫反应以限制病原体定植和增殖[2]。
1.4 免疫屏障
1.4.1 瘤胃上皮免疫
SARA可降低瘤胃微生物多样性,提高瘤胃内有害代谢物的含量,促进瘤胃上皮炎症因子的表达[5]。VFA和pH还可通过瘤胃上皮肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及其受体信号通路调控瘤胃上皮细胞增殖和凋亡[6]。患有SARA的奶牛其瘤胃内较高浓度的LPS和组胺通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路,上调促炎性细胞因子TNF-α、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达[7]。SARA还会抑制瘤胃上皮VFA的转运。研究表明,补充硫胺素和酿酒酵母及其培养物,可缓解由高淀粉饲粮引起的SARA介导的瘤胃上皮炎症,促进β-防御素-1的表达[8⇓-10]。高浓度LPS可促进奶牛瘤胃上皮自噬,抑制溶质载体家族5成员8(solute carrier family 5 member 8,SLC5A8)和单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)的表达[11]。同时,瘤胃内过高的VFA也抑制了SLC5A8在奶牛瘤胃上皮的表达,降低了VFA的吸收[12],而VFA吸收的抑制进一步加剧了SARA。本实验室前期研究发现,高瘤胃降解淀粉饲粮可破坏瘤胃上皮屏障,促进炎症发生[13]。
1.4.2 肠道上皮免疫及耐受
1.4.2.1 肠道上皮免疫组成
肠道上皮细胞存在多种功能细胞类群:肠上皮细胞(构成物理屏障,养分吸收)、杯状细胞/哨兵状细胞(分泌黏蛋白)、肠内分泌细胞(营养感应,分泌激素)、潘氏细胞(提供宿主防御)、簇状细胞(化学感应器)、M细胞(摄取并抗原呈递)、驻留免疫细胞和肠道干细胞(分化为其他上皮细胞)[14]。其中,肠内分泌细胞可感应肠道营养状态(肠腔内容物营养物质的数量),通过分泌激素影响外周器官[15]。潘氏细胞不仅可分泌抗菌肽保护肠道干细胞,还可在机体能量摄入不足的情况下维持肠道干细胞自稳性[16-17]。杯状细胞主要分泌黏蛋白,形成黏液层。小肠与大肠黏液层的结构不同,小肠黏液层为单层多孔结构,这有利于营养物质的吸收,但也有利于微生物接触肠上皮[18-19]。大肠黏液层为双层结构:外层为松散黏液层,可为微生物提供生态位;内层为致密黏液层,微生物不易定植。驻留免疫细胞以淋巴细胞为主,是机体发育过程中驻留在特定器官中的免疫细胞,其中约90%的淋巴细胞可表达T细胞受体。驻留免疫细胞除具有免疫监视的功能外,还可提供上皮生长因子以维持组织稳态,促进损伤后上皮修复[20]。肠道干细胞的分化受先天性免疫和适应性免疫的调控,从而维持肠道免疫稳态,避免微生物的易位[21]。消化道淋巴组织主要包括引流淋巴结、肠道相关淋巴组织、小肠派伊尔淋巴结、盲肠淋巴结和结肠淋巴结,以适应性B细胞和T细胞为主。
肠上皮细胞表达多种Toll样受体(Toll-like receptor,TLR),TLR信号通路激活后可级联NF-κB通路,促进细胞因子和趋化因子的表达和分泌。TLR可参与调控细胞紧密连接的表达,影响上皮屏障通透性。TLR4可促进肌球蛋白轻链激酶的表达,从而促进肌动蛋白-肌球蛋白丝的收缩以打开上皮紧密连接[22]。TLR信号通路不仅可诱导潘氏细胞分泌抗菌肽,还可介导分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)以多聚免疫球蛋白受体(polyimmunoglobulin receptor,pIgR)依赖的方式进行胞吞转运。此外,TLR1、TLR2、TLR4和TLR5可诱导杯状细胞黏蛋白分泌,抑制微生物在隐窝的定植[23]。综上所述,肠上皮TLR信号通路可促进抗菌肽、sIgA和黏蛋白分泌,避免微生物与肠上皮的直接接触。
肠道上皮细胞代谢和免疫高度整合,通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路感知和整合环境信号调节上皮免疫功能[24]。在适应性免疫缺失的情况下,肠上皮细胞可上调自身免疫基因的表达,同时下调代谢相关基因的表达以产生对微生物和炎症信号的应答[25]。此外,由于上皮结构的差异,肠道比瘤胃更容易受到内容物的影响。肠道上皮细胞、肠道免疫组织和共生微生物之间的相互作用构成了复杂的生态系统,该生态系统在稳态下可抑制和平衡因高免疫原性肠道内容物引起的黏膜免疫反应,进而避免不受控制的炎性反应[26]。肠道共生微生物不仅可促进肠道免疫系统的发育,从宿主饮食中获取营养物质并保护宿主免受感染,还可激活宿主免疫反应导致炎症的发生[27-28]。当病原体突破上皮物理屏障时,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NADPH-oxidase,Nox)/Dual氧化酶(Dual oxidase,Duox)系统以Duox2为主要介导方式产生活性氧(reactive oxygen,ROS)以限制细菌易位并增强宿主防御,但可能会引起组织损伤[29]。此外,肠上皮细胞还可主动脱落,排出体外,同时不影响黏膜屏障功能[30]。
1.4.2.2 肠道上皮免疫耐受
消化道免疫系统具有免疫耐受(吸收营养物质,促进共生微生物定植)和维持黏膜免疫应答(排出病原体,限制毒素的毒害作用)的功能。免疫平衡的紊乱可导致食物过敏、肠道炎症和消化道感染。消化道健康取决于适应性免疫对外来抗原(营养物质、微生物等)的耐受性,其机制包括:反应性淋巴细胞的清除、抑制淋巴细胞的活化和旁观者抑制[31]。白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是2种主要的消化道免疫耐受的调控剂。IL-10是关键的抗炎细胞因子,具有广泛的免疫调节活性,可抑制免疫细胞的增殖、细胞因子分泌和共刺激分子表达,维持肠黏膜的免疫耐受。TGF-β可通过抑制自身反应性T细胞和先天免疫细胞之间的级联诱导免疫耐受,是适应性免疫耐受调节的必要途径,小鼠口服TGF-β可增强肠黏膜的免疫耐受[32]。
口服免疫耐受是通过口服途径向消化道免疫细胞呈递抗原,进而诱导耐受性的有效方式。全世界有6%~8%儿童发生食物过敏,其中90%以上是由牛奶、鸡蛋、大豆、小麦、花生、坚果、海鲜引起的口服免疫耐受失败所致[33]。Esterházy等[34]研究发现,肠道引流淋巴结是协调小肠免疫与耐受的关键部位,相同抗原在不同引流淋巴结内引起的免疫反应存在差异,且具有肠道特异性:近端小肠引流淋巴结可诱导免疫耐受,远端小肠引流淋巴结侧重于引起促炎性T细胞反应。肠道对营养物质的免疫耐受调节主要通过调节性T(Treg)细胞进行。树突状(DC)细胞对Treg细胞的诱导是肠道对食物抗原免疫耐受的关键[35]。小肠常规DC细胞分为CD103+ CD11b- DC细胞(cDC1s)和CD103+ CD11b+ DC细胞(cDC2s)2个亚群,分别促进Treg细胞和辅助性T细胞17的免疫应答[36]。断奶仔猪消化道发育的不完善,以及豆粕中存在的抗营养因子导致断奶仔猪对饲粮高水平蛋白质的不耐受,使用氨基酸平衡的低蛋白质饲粮可有效缓解断奶仔猪高饲粮蛋白质不耐受引起的营养性腹泻。SARA和后肠酸中毒可认为是反刍动物对高淀粉和高瘤胃降解淀粉饲粮的不耐受,适当降低瘤胃降解淀粉可改善动物健康。
2 反刍动物免疫激活下的养分重分配
2.1 免疫激活下的葡萄糖重分配
免疫系统的激活需要大量的能量和营养,低度、持续的免疫激活会降低动物生产性能。大量研究发现,炎症影响动物的生长发育和生产性能[41⇓⇓-44]。葡萄糖是动物新陈代谢的重要底物,免疫激活破坏机体葡萄糖稳态。细胞试验表明,先天性和适应性免疫细胞的激活可提高转录和翻译水平,促进细胞因子和效应分子的产生以及细胞增殖,进而对细胞代谢类型进行重编程,从氧化磷酸化转为Warburg代谢(有氧糖酵解),显著提高葡萄糖的利用[45-46]。奶牛热应激、乳腺炎、酮病、酸中毒、肠漏和围产期炎症均可提高血液循环LPS的浓度[47]。由于LPS引起的免疫反应特征较为明确,因此可对动物注射LPS,以模拟免疫系统的激活。Kvidera等[48-49]利用LPS-血糖钳技术确定了泌乳奶牛和育肥牛在急性免疫激活条件下的代谢葡萄糖需要量分别为0.66和1.0 g/(kg BW0.75·h)。泌乳牛静脉注射LPS 12 h后可消耗代谢葡萄糖1 606 g[50]。LPS可导致动物低血糖,其原因可能与免疫系统对葡萄糖的利用超出肝脏葡萄糖的净输出和外周组织的胰岛素抵抗有关[51-52]。此外,炎症伴随的采食量下降进一步加剧了体内葡萄糖稳态的紊乱。以上研究表明,免疫系统的激活可导致机体葡萄糖的重分配,使更多的能量转向免疫系统。
2.2 免疫激活下的氨基酸重分配
免疫系统具有特殊的氨基酸需求。急性期蛋白富含芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸),表明炎症期间酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的需要量可能有所增加[55]。苏氨酸可调节肠道免疫细胞趋化因子——C-C趋化因子受体9(C-C chemokine receptor 9,CCR9)的表达,同时参与IgA的合成与分泌[56-57]。研究表明,苏氨酸可促进上皮细胞β-防御素的表达,并可通过抑制促炎性细胞因子的产生改善肉鸡和猪肠道免疫功能[58-59]。精氨酸是一氧化氮(NO)合酶(nitric oxide synthase,NOS)、精氨酸酶、甘氨酸氨基转移酶和L-精氨酸脱羧酶的底物,可在酶的作用下转化为具有免疫调节作用的多胺和NO。精氨酸可缓解断奶仔猪LPS引起的肝脏损伤[60]。断奶仔猪饲粮中添加0.5%的精氨酸可显著抑制LPS引起的体重下降;而饲粮中添加1.0%的精氨酸可减少LPS刺激引起的肌肉蛋白质降解[61-62]。此外,精氨酸还可通过mTOR/p70核糖体蛋白S6激酶(p70 ribosome protein S6 kinase,p70S6K)促进肠道上皮的修复,逆转肠功能障碍[63⇓-65]。
色氨酸是含有吲哚结构的必需氨基酸。研究发现,色氨酸具有抗炎作用,是炎症反应的重要调节剂[66]。肠道组织中吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)可将色氨酸经犬尿氨酸代谢途径转化为犬尿氨酸、喹啉酸、烟酸和全尿酸等代谢产物[67]。犬尿酸及其代谢产物可参与调控炎症和免疫反应[68]。早期研究表明,断奶仔猪免疫激活期间血液犬尿氨酸浓度的提高与色氨酸需要量的增加有关[54]。饲粮中的色氨酸可被肠道微生物代谢为吲哚及其衍生物。其中,吲哚乙醛、吲哚乙酸和吲哚丙酸等吲哚衍生物为肠道芳香烃受体(aromatic hydrocarbon receptor,AhR)的配体[69]。AhR可参与肠道免疫稳态调节,通过IL-22转录调节抗菌肽的释放,调节上皮内淋巴细胞和先天淋巴细胞的发育[68,70]。肠道中吲哚和色氨酸代谢物的减少可破坏AhR介导的肠道稳态[71]。总之,氨基酸主要参与维持肠道屏障功能和黏膜免疫,改善肠道稳态,而免疫系统的激活可引起机体氨基酸的消耗与重分配。
2.3 免疫激活下的养分利用效率
适度的免疫激活可促进反刍动物免疫系统的发育,提高机体免疫机能;过度的免疫激活(如肺部感染、肠道感染等)则引起疾病,影响反刍动物的生长发育和生产性能。消化道是机体适应性免疫的重要组成部分,承担了营养物质的消化吸收、营养物质感应、屏障以及宿主-微生物互作等功能。这些功能的调节涉及多个层面,对维持消化系统机能、提高畜禽生产效率和产品品质至关重要。益生菌及其代谢产物可通过活化宿主免疫细胞的模式识别受体,或抗原与适应性免疫细胞的相互作用同宿主免疫系统发生直接或间接的相互关系;还可调节消化道微生物区系,维护微生态稳定。因此,在饲粮中添加益生菌会影响反刍动物的免疫机能和养分利用能力。大量研究发现,外源添加益生菌可提高反刍动物血液免疫球蛋白水平,还可提高生长和生产性能,降低料重比[72⇓⇓⇓-76]。此外,植物多糖作为可替代饲用抗生素的免疫增强剂已广泛应用于畜禽生产。其中,黄芪多糖是一种低毒、无耐受,且具有生物活性的水溶性杂多糖。黄芪多糖主要通过促进免疫器官发育,调节免疫细胞分化,提高细胞因子和免疫球蛋白水平,刺激免疫信号传导等方式调节动物免疫功能[77]。研究表明,黄芪多糖可降低犊牛腹泻率,提高血液免疫球蛋白水平和抗氧化能力,提高生长性能[78-79]。黄芪多糖还可提高山羊抗氧化能力,调节藏羊血液细胞因子水平,提高藏羊胴体品质[80-81]。枸杞多糖主要通过清除自由基、激活免疫细胞、提高抗炎性细胞因子分泌以及改善肠道微生态等方式调节动物免疫机能[82]。枸杞多糖可提高犊牛抗氧化能力和肠道有益菌丰度,降低料重比[82]。饲粮中添加枸杞渣可提高滩羊抗氧化能力,提高血清免疫球蛋白水平和氮的表观消化率[83-84]。以上结果表明,益生菌与植物多糖在改善消化道微生物区系的同时,还能适度提高宿主免疫机能,使能量和养分更多地用于生产性能的发挥。
总之,维持反刍动物机体健康,特别是维持消化道健康,是保证养分高效利用的关键。
3 小结
消化道是动物适应性免疫的第1道防线。消化道上皮作为物理屏障和黏膜免疫的枢纽,可协调多种细胞参与识别消化道内容物无害刺激和有害刺激以应对病原体入侵,对维持消化道免疫稳态十分重要。消化道健康不仅是机体健康的重要组成部分,而且是畜禽高效利用营养成分的重要保障。通过营养调控改善消化道免疫机能,维持消化道免疫稳态,促进养分高效利用,对提高反刍动物福利和发挥生产潜力具有重要意义。
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