绿色养殖是发展可持续畜牧业的关键,其中饲料添加剂作为饲粮的“调控子”在提高动物的生产性能、饲料报酬、机体抗病能力等方面发挥着重要作用。植物提取物作为饲料添加剂因具有安全、绿色、无残留等特点被广泛应用,主要以黄酮类化合物、植物精油、多糖、植物单宁等成分为主。芦丁(Sophora japonica L.)是一种黄酮类化合物,其生物学作用已在体内和体外模型中得到大量研究,其具有重要的抗氧化、抗炎和抗菌活性等作用[1]。目前在小鼠和单胃动物试验中的研究较广而在反刍动物中的应用研究较少,因此,本文就芦丁的理化特性、生物学功能以及其在反刍动物体内吸收和代谢和生产应用进行综述,为芦丁作为反刍动物饲料添加剂应用研究提供一定的理论基础。
1 芦丁的理化特性
芦丁是槲皮素和鼠李糖-葡萄糖二糖的糖基化形式[2],分子式为C27H30O16(图1),是一种来源很广的黄酮类化合物。从20世纪30年代国外学者Albert Szent-Gyrgyi分离出黄酮类混合物,到1942年德国药学家第1次制成芸香苷,人们才确立了芦丁的前身维生素P的概念。此后人们在进一步的研究中发现维生素P中含有一种重要的黄酮类物质——芦丁[3],其性状为黄色小针状晶体,带有苦味,暴露空气中颜色变深,相对分子质量为610.53,熔点为195 ℃,高温255 ℃时分解[4]。芦丁在植物界分布广泛,主要存在于芸香科植物(芸香、柠檬、柑橘)、蝶形花科植物(槐)、金丝桃科植物(红旱莲)、蓼科植物(荞麦)中,其中荞麦是唯一含芦丁的谷物[5-6]。芦丁在植物中的含量差异较大,含量低的仅为万分之几,而含量高的,例如槐米,可达20%以上[7]。芦丁药理作用和生理作用广泛,其多种药理作用的发挥依赖于多靶点的协同作用,参与疾病和细胞内外信号通路调控[8-9]。但是芦丁低的溶解性和渗透性导致其生物利用度较低,常常会导致其在生产应用中使用受限[10]。而将芦丁分子结构进行修饰生成芦丁衍生物(芦丁乙酸酯、芦丁6-氨基青霉酸衍生物、芦丁磺酰胺衍生物等[4]),可以提高其溶解性,改善生物利用度,为芦丁作为饲料添加剂的应用起到积极推动作用。
2 芦丁的提取方法与成本
随着工业科技的不断发展进步,芦丁的提取工业也越来越多元化,常见有煎煮法、乙醇回流提取法、碱提酸沉法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法[11]。芦丁在水中的溶解度低,因此通常会使用有机溶剂(甲醇和乙醇),但有机溶剂具有毒性并且易挥发,易对环境造成污染[12]。研究中发现,酸性低共熔溶剂(DES)是一种新型绿色高效的化学溶剂,可提高黄酮类化合物的溶解度并且在加热条件下可水解糖苷键制备相应的黄酮类苷元。DES包含2个组分——超分子氢键受体和氢键供体,不同的组分又分为4种类型,即季铵盐-金属氯化物、季铵盐-金属氯化物水合物、季铵盐-氢键供体和金属氯化物水合物-氢键供体,其中具有代谢物成分(胆碱衍生物、甜菜碱、有机酸、氨基酸和糖)的DES被称为天然低共熔溶剂(NADES)[13]。Peng等[12]利用DES提取苦参芽中的芦丁发现,芦丁在体外发挥清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的半数有效浓度分别为5.68 μg/mL、0.19和0.28 mg/mL,说明芦丁具有一定的抗氧化作用。Zang等[14]研究发现,利用NADES从槐花中提取芦丁可提高芦丁降解为槲皮素的速率,这也表明该溶剂可替代传统提取方法中的强酸碱和有机溶剂,也是一种绿色环保无污染的绿色溶解剂。随着提取工艺的深入研究,芦丁的提取方法正朝着简单、便捷以及绿色无污染的方向快速发展,这也导致芦丁的生产成本大幅下降,其饲料级芦丁价格从1 000~1 500 元/kg下降到500~800 元/kg,每吨饲料添加成本也降至50~80 元,并在不同动物生产中发挥生物功能。
3 芦丁的吸收和代谢
芦丁在动物胃肠道中无法以天然形式吸收,需要在回肠内经肠黏膜和肠道微生物分解成槲皮素后吸收,再进入血液循环,发挥其活性功能[9]。槲皮素也是芦丁降解后的唯一黄酮产物[15-16],苷类化合物进入机体后,酶参与脱糖基、脱甲基、脱羟基、水解、氧化还原等反应,使苷类化合物的化学结构发生改变,所以在肠道中可被特异菌群(双歧杆菌、芽孢杆菌属、拟杆菌属)降解为低分子质量的酚酸类化学物质,然后再被吸收利用[17]。由于单胃动物与反刍动物胃肠道的生长发育不同,所以对芦丁和槲皮素的生物利用度也存在差异。试验结果表明,反刍动物口服芦丁的生物利用度高于口服槲皮素的生物利用度,反刍动物口服芦丁后血浆中所含槲皮素浓度非常高;口服槲皮素则生物利用度极低,仅为1%,而单胃动物口服槲皮素后的生物利用度在大鼠中为4%,在猪中为17%,在狗中为59%,但是单胃动物口服芦丁的生物利用度低,这与其在反刍动物中利用效率形成了鲜明对比[18]。这主要是因为单胃动物的吸收部位主要是在结肠[19],而其小肠中缺乏水解芦丁中鼠李糖的酶,因此在进入结肠前无法将芦丁糖基化分解为槲皮素发挥生物学功能[17]。
与单胃动物不同的是,当反刍动物摄入芦丁或含芦丁的植物性饲料时,所含的黄酮类物质必然对其瘤胃微生物的丰度与群落结构产生影响。黄酮类物质能够调控瘤胃微生物的发酵作用,但不同植物来源或不同结构的黄酮类物质对瘤胃发酵的作用存在差异[20],而其生物利用度也会随瘤胃的发育产生变化,主要受肠道吸收能力、通透性、微生物定植和瘤胃发育等因素影响[21]。反刍动物摄入芦丁后,首先要经过瘤胃微生物发酵降解,然后再通过后肠道进行消化吸收。进入瘤胃的芦丁在微生物作用下使芦丁糖苷链断裂生成苷元和槲皮素,随后槲皮素在微生物作用下被降解形成3,4-二羟基苯乙酸和4-甲基儿茶酚2种代谢产物,两者通过瘤胃上皮细胞被动扩散转运进入血液[22],在血液中以异鼠李黄素(槲皮素-3'-O-甲基)和柽柳黄素(槲皮素-4'-O-甲基)2种物质存在[23]。同时瘤胃微生物裂解芦丁中聚合的糖苷成分,通过小肠上皮细胞膜的钠离子依赖葡萄糖转运载体的转运作用进入胞内[24],但随后被小肠绒毛边缘的乳糖酶和胞质β-葡萄糖苷酶水解,致使苷元以简单扩散的方式进入肠黏膜而被吸收利用[21]。部分经过胃和小肠选择性地吸收的黄酮类化合物和排回肠腔的结合代谢产物,以及未被小肠吸收的黄酮类物质会被转移到大肠中进行分解代谢。在结肠微生物的作用下,未被吸收的黄酮类物质水解产生苷元会被重新吸收进入血液,一部分产物通过肠上皮上的多药耐药蛋白转运后由尿液排出体外;另一部分通过肝门静脉到达肝脏,在细胞色素P450酶的参与下进行氧化代谢,部分芦丁会代谢为葡萄糖醛酸化芦丁,并生成代谢产物槲皮素-3'-O-甲基和槲皮素-4'-O-甲基随胆汁分泌到肠腔中,最终经粪便排出体外[23,25⇓⇓-28](图2)。
4 芦丁的生物学功能
4.1 芦丁的抗炎作用
在兽医临床上,多种动物疾病都伴随着炎症的发生,炎症是机体对外界多种致炎因素,创伤、感染及其引发的各种免疫应答的情况作出的生理免疫防御反应[30]。脂多糖(LPS)是一种内毒素,能够诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子参与炎症反应。利用LPS诱导小鼠肌肉细胞(C2C12)建立体外炎症模型研究发现,芦丁能够通过降低LPS诱导的C2C12中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量,并抑制IL-6、TNF-α和一氧化氮合酶(iNOS)基因的mRNA转录过程,减轻C2C12细胞产生的炎症反应[31]。类似地,利用LPS诱导小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7细胞)建立体外细胞炎症模型,研究结果发现,在LPS诱导下的细胞中利用芦丁能降低标志性促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的含量和炎症介质一氧化氮(NO)的含量;此外在基因表达上,芦丁可以通过介导Toll样受体4-募集髓样分化蛋白88-肿瘤坏死因子受体相关因子6-核因子-κB(TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB)炎症信号通路,上调IκB基因的mRNA和蛋白表达的水平,阻碍LPS诱导的炎症通路中相关基因(TLR4、MyD88、TRAF6、p65和iNOS)和蛋白(TLR4、MyD88、TRAF6、p65)的表达水平,并降低相关蛋白(p65、IκB)的磷酸化水平,作用阻断信号通路中的某一环节或者抑制通路中某一因子的产生或者活性,从而发挥抗炎的作用[32](图3)。炎症性肠道疾病是一种在动物幼龄阶段发生率和致死率极高的消化系统疾病,研究表明,芦丁在结肠炎小鼠模型中发挥着重要的肠道抗炎作用。岳朝驰等[33]研究发现,芦丁不仅抑制模型小鼠促炎细胞因子(IL-1β、IL-18)的成熟和释放,阻断其介导的炎症反应而降低溃疡性结肠炎的发生率,还能减少结肠病理组织中细胞浸润以及维持结肠结构的完整性。此外,芦丁还可抑制小鼠多种结肠炎模型,例如,转移CD4+、CD62L+T细胞诱导的结肠炎模型[34],葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎模型[35]。另外,芦丁在其他方面也具有一定的抗炎作用,如Teixeira等[36]首次证实芦丁通过抑制酵母多糖诱导的关节炎小鼠体内中性粒细胞的聚集与关节内TNF-α的合成来减轻关节炎症;刘欣[37]研究结果表示,芦丁能降低LPS诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺水肿程度,并通过抑制TLR4-NF-κB信号通路中TLR4、TRAF6、p-IκB蛋白表达水平发挥其抗炎作用。由此看出,芦丁可通过阻碍或降低炎症细胞因子、炎症介质以及炎症信号通路相关基因和蛋白表达,共同发挥作用来调控炎症的发生与发展进程,也为芦丁作为潜在调控动物肠道健康的添加剂提供了一定的理论支撑。
图3 芦丁对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信号通路的影响LPS:脂多糖 lipopolysaccharide;MD-2:髓样分化蛋白-2 myeloid differentiation protein-2;CD14:分化抗原14 cluster of differentiation antigen 14;TLR4:Toll样受体4 Toll like receptor 4;MyD88:募集髓样分化蛋白88 myeloid differentiation factor 88;Rutin:芦丁;IRAK-4:白细胞介素-1激酶-4 IL-1 receptor-associated kinase 4;TRAF6:肿瘤坏死因子受体相关因子6 tumor necrosis factor receptor-associated factors 6;TAK1:转化生长因子-β-活化激酶1 transforming growth factor-β-activated kinase 1;NF-κB:核转录因子-κB nuclear factor-kappa B;p50:p50蛋白 p50 protein;p65:p65蛋白 p65 protein;IKKS:κB激酶抑制剂 inhibitor of κB kinase;Ub:泛素 ubiquitin;TNF-α:肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-alpha;IL-1β:白细胞介素-1β interleukin-1β;IL-6:白细胞介素-6 interleukin-6;NO:一氧化氮 nitric oxide。 Fig.3 Effects of rutin on TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells induced by LPS[27] |
4.2 芦丁的抗氧化作用
自由基在动物体内广泛存在,并在体内保持相对平衡的状态,然而,饲粮的转变、运输、环境等外界应激造成的体内自由基聚集,会造成机体细胞损害并引起代谢疾病使畜禽的生产性能下降[38]。芦丁是清除自由基的强氧化剂,具有突出的抗氧化能力[39],可终止自由基的连锁反应,通过抑制生物膜上多不饱和脂肪酸的过氧化作用,清除脂质过氧化产物,保护生物膜及亚细胞结构的完整性,在机体内起着重要的抗氧化作用[40]。此外,相关研究表明,芦丁等其他黄酮类化合物可以提高机体超氧化物歧化酶、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性[41]。研究发现,在小鼠饲粮中随着芦丁添加量的增加(250、500、1 000 mg/kg),小鼠血清和空肠中的T-SOD活性呈线性增加,T-SOD作为机体内一种重要抗氧化金属酶,能有效清除机体内的超氧阴离子,保护细胞免受损伤[42]。生产应用中,在肉鸡饲粮中补充芦丁可以通过激活核因子相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路来增强抗氧化酶的表达,进而提高肉鸡的肠道抗氧化能力[43]。
4.3 芦丁的抗菌作用
芦丁等其他黄酮类化合物是多酚类物质,Ivanov等[46]利用多酚类物质作为抗生素耐药细菌的抑制剂进行研究,发现在这12种多酚类物质(橙皮素、橘皮苷、柚皮素、柚皮苷、紫杉叶素、芦丁、异槲皮苷、桑黄素、绿原酸、阿魏酸、香豆酸、没食子酸)中芦丁可显著影响细菌生物膜的形成,还能够减少铜绿假单胞菌毒力因子的产生,并下调该病原体的群体相关基因的表达,其抗菌机制是干扰病原菌膜通透性。其他相关研究同样证实了芦丁的抗菌作用,主要机制是通过抑制细菌DNA的合成和破坏细菌细胞壁的完整性,来抑制病原菌的生长而发挥抑菌作用[47-48]。此外,槲皮素(芦丁苷元)还可以通过减少肉类储存期间的细菌数量来改善肉类的变色,提高肉品质[49]。在体外试验中,赵强等[50]利用紫花苜蓿中的芦丁提取液进行抑菌试验,结果表明芦丁对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.4 mg/mL,对金葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.7 mg/mL。Murugesan等[51]将芦丁(200 μg/mL)与庆大霉素(2.5 μg/mL)配伍使用,发挥较强的协同作用治疗铜绿假单胞菌的感染,因此芦丁可潜在地用作治疗铜绿假单胞菌感染的抑制剂。牟登科等[52]体外抑菌试验表明,高浓度芦丁对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用更强。综上所述,芦丁对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有一定的抗菌作用,其抗菌机制以干扰膜通透性、抑制病原菌DNA的合成和破坏细菌细胞壁的完整性为主,因此其可能具有替代抗生素的潜力在动物生产中应用发挥生物学功能。
5 芦丁在反刍动物生产中的应用研究
5.1 在牛上的应用研究
鉴于芦丁对禽类和单胃动物的有益作用的研究结果越来越多,随之人们也开始关注芦丁的生物学功能对反刍动物的影响。哺乳期犊牛是奶牛生命周期的开始,也是奶牛整个生命周期中最为脆弱的阶段,犊牛出生后摄入初乳不及时或是不足会导致免疫力低下和营养素缺乏,从而损害新生犊牛的胃肠道健康和发育。Gruse等[53]研究发现,在犊牛的液体饲料(牛奶)中添加槲皮素有利于改善由于初乳摄入不足导致的犊牛胃肠发育迟缓,同时增强对营养物质的吸收能力。同样地,对于泌乳奶牛饲粮中添加芦丁可以调控瘤胃内环境改善瘤胃发酵功能,促进纤维降解率,提高营养物质的消化和吸收,并且还能在不影响乳成分的同时提高奶牛产奶性能[15,54]。另外,Cui等[55]研究发现,奶牛饲粮中添加3.0 mg/kg芦丁,其泌乳性能提高了10.06%,同时不影响牛奶品质。在奶牛养殖中奶牛乳腺炎是一种常见疾病,我国部分牛场的奶牛乳腺炎发病率为20%~70%,给养殖业带来的巨大经济损失[56]。罗永光[57]通过体外试验研究发现,在培养基中添加100 μg/mL的芦丁能够提高细胞的抗氧化能力和抑制细胞凋亡,从而提高奶牛乳腺上皮细胞的活性。类似地,槲皮素可以通过抑制TLR4-NF-κB信号通路来减少LPS诱导的牛乳腺上皮细胞的炎症反应,保护牛乳腺上皮细胞的正常生理功能[58]。
畜牧业不断发展的同时,对环境也造成了一定的影响,反刍动物温室气体的排放量占牲畜温室气体总排放量的80%,甲烷(CH4)作为瘤胃微生物代谢的副产物,不仅对环境造成影响还降低了反刍动物的饲料能量利用率。Oskoueian等[59]通过体外试验,研究黄酮类植物提取物(黄酮、杨梅素、柚皮苷、儿茶素、芦丁、槲皮素和山奈酚)对瘤胃微生物及CH4产生的影响,结果显示试验中的几种黄酮类化合物对CH4生成的抑制活性为杨梅素≥山奈酚≥黄酮>槲皮素≥柚皮苷>芦丁≥儿茶素,说明黄酮类化合物具有降低反刍动物CH4产生的潜力。然而,Stoldt等[16]研究发现,在泌乳奶牛饲粮中添加100 mg/kg BW的芦丁对其CH4的产生以及产奶量和奶品质均未造成显著影响,但是可提高奶牛血浆葡萄糖的浓度,增加能量的消化代谢。上述结果差异可能是由于奶牛品种、添加剂量、饲喂方式以及体内体外试验的不同而导致的。此外,环境也是保证动物健康的一大要素,夏季奶牛长期处于高温高湿的环境,会造成奶牛的热应激,导致奶牛生产性能与繁殖性能水平急剧下滑,严重影响经济效益,而饲粮中添加芦丁并饲喂超过30 d,能有效降低奶牛的直肠温度,进而有效提高奶牛生产水平[60]。
5.2 在羊上的应用研究
养殖中动物常会受到环境、饲料等方面的改变而产生应激反应,导致机体发生不可逆转的氧化损伤,对动物的生长性能造成影响。芦丁是清除自由基的强氧化剂,在羊的饲粮中添加芦丁虽然对湖羊背最长肌和腿肌中脂肪酸、氨基酸含量以及血清免疫球蛋白含量均无显著影响,但能够提高肝脏中CAT活性和血清中GSH-Px活性,增强机体抗氧化能力[41,61]。随着生活水平的提高,人们对畜产品品质的要求也越来越严苛,而肉类产品在储存过程中会发生脂质氧化影响肉品质。Andrés等[62]研究发现,在羔羊饲粮中添加槲皮素能改善羔羊肉品质,其主要通过降低冷藏鲜肉中的氧化型胆固醇含量和熟肉的感官品质的改善来实现。芦丁对羊的瘤胃细菌菌群多样性及组成有一定的调控作用。试验发现,在饲粮中添加100 mg/kg的芦丁能提高瘤胃液中拟杆菌门的相对丰度,同时与对照组相比,显著降低变形菌门的相对丰度,有利于维持菌群的平衡,同时抑制肠道变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等的生长,增强机体抵抗外源性病原体的入侵[63]。母羊在围产期阶段,血清中的游离脂肪酸(NEFA)和β-羟基丁酸(BHBA)含量是监测孕母羊的重要指标。血清NEFA含量升高表明脂肪动员增加,有助于反刍动物在过渡期适应能量负平衡,但过度的脂肪动员可能会适得其反,其中NEFA含量>400 μmol/L的为高脂质动员,BHBA含量为0.8~1.2 mmol/L表明机体存在能量负平衡。研究发现,芦丁能改善绵羊在哺乳期间的能量平衡,在绵羊泌乳前期添加芦丁可降低血清中NEFA的含量,哺乳后期在饲粮中添加芦丁100 mg/kg可增加体重,并且会降低血浆中的BHBA的含量。此外,该研究还发现绵羊泌乳期泌乳量的增加和对葡萄糖的需求量增加会导致血清中NEFA含量升高,同时也表明了芦丁对其能量代谢产生有利作用[64]。
6 小结
芦丁作为黄酮类植物提取物,大量研究已经证实其在单胃动物健康养殖中的作用,近年来其在反刍动物中的应用也相继报道,同时芦丁资源获取广泛、制取方法简单并随着提取加工的工艺不断发展进步,使得芦丁在反刍动物高效生产中展现出巨大潜力。研究证实,芦丁在提高牛、羊等反刍动物生产性能和机体抗氧化能力和抗应激等方面效果显著,然而由于芦丁特殊的分子结构(即黄酮醇配糖体,由苷元和2个配糖体葡萄糖和鼠李糖组成)及其多功能的生物特性(抗炎、抗氧化、抗菌等),使其在反刍动物体内的作用机制、代谢规律以及在不同生长阶段与宿主的相互作用关系有待深入研究,以期为芦丁在反刍动物生产中应用提供理论基础,推动植物提取物作为新型饲料添加剂在牛、羊生产中的应用。
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