瘤胃微生物包括细菌、古菌、厌氧真菌、原虫和噬菌体等,它们的存在使得反刍动物能够更好地利用植物性饲料来满足自身的能量需求[1]。稳定的瘤胃微生物区系和内环境对宿主健康和营养物质消化具有显著的积极作用[2],但由于瘤胃内环境组成的复杂性,微生物的稳定性易受环境、饲养管理和饲粮等因素影响而发生变化,从而影响宿主的生理健康和生产性能[3⇓-5]。因此,反刍动物瘤胃微生物调控逐渐成为人们研究的热点。
在先前的研究中,人们对微生物的调控主要集中在饲粮组成和饲料添加剂。在饲粮组成方面,适宜的精粗比对瘤胃微生物区系高效发挥作用有积极意义[6]。高精料条件下,瘤胃细菌香农指数和辛普森指数显著下降,进而影响瘤胃细菌数量和丰度[7];而添加适量的高质量粗饲料可加快瘤胃乳头发育,丰富瘤胃微生物区系[8]。在饲料添加剂方面,微生态制剂,也称活菌制剂或直接饲喂微生物(direct-feeding microbial,DFM),结合了微生物生态学原理,将不同来源的益生菌经特殊处理成制剂,参与饲料消化的肠道菌群的建立,促进肠道健康[9]。随着研究者对益生菌的不断开发与应用,微生态制剂的应用正逐步成为饲料添加剂的发展趋势,在生产应用中,饲粮中可添加的益生菌有乳酸菌、芽孢杆菌以及酵母等,其应用效果已由大量研究结果所证实,例如,酿酒酵母培养物中大量的活性物质提高了纤维分解菌和乳酸利用菌的数量,增强了奶牛对营养物质的利用率[10];在荷斯坦公犊饲粮中添加巨型芽孢杆菌BM1259可显著改善犊牛的生长性能,提高营养物质表观消化率,同时改善瘤胃发酵,减少排泄物中氨态氮和硫化氢的含量[11]。饲喂复合益生菌(酵母+乳酸菌)可调节新生犊牛的肠道微生物群落结构,并改善肠道健康[12]。
瘤胃微生物移植(rumen microbiota transplantation,RMT)作为微生态制剂的一种特殊应用方式,是将供体瘤胃中的微生物通过一定方式移植到受体中,对瘤胃菌群结构起到一定的改善和优化作用。RMT可用于揭示瘤胃微生物特性或功能[13],从而实现对特定菌株的分离培养和运用。但目前对于RMT的研究并不完善,微生物组的培养与饲喂仍处于起步阶段。本文阐述了RMT在反刍动物生产应用中的效果和可能作用机制,为日后RMT的应用提供参考。
1 RMT方式
早在18世纪中期,研究人员就已经利用健康反刍动物的反刍食团来治疗受体动物消化不良的症状[14]。随着对瘤胃微生物研究内容的不断展开,RMT作为瘤胃微生物调控方式之一,逐渐应用到动物菌群结构调节、疾病预防及治疗等领域。目前,RMT的移植单位可以是瘤胃内容物整体,也可以是具有特定功能的微生物组或单一菌株。
1.1 瘤胃内容物移植
目前存在的瘤胃内容物移植方式可以总结为瘤胃液胃管灌服[19]、冷冻瘤胃液口服[20]、冻干瘤胃液饲喂[21-22]和瘘管内容物转移[23]等,对于特定情景还可以利用瘤胃穿刺和鼻饲等方式[24]。在以瘤胃液胃管灌服为方式的研究性试验中,研究者利用注射器连接硅胶管,将新鲜瘤胃液注射到受体瘤胃中[16]或与乳汁混合后口服[20]。Santos等[25]通过胃管向羊瘤胃中注射1.5 L奶牛瘤胃液,对照组在相同条件下注射1.5 L温生理盐水,发现瘤胃内容物移植改变了瘤胃中主要微生物类群(厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门等)的相对比例,但未改变其整体组成。冷冻瘤胃液是将过滤后的瘤胃液放入用二氧化碳冲洗的预热温瓶中(39 ℃),随即冷冻[26]。相较于新鲜瘤胃液,冷冻瘤胃液会因保存时间长而效果欠佳,在使用过程中应避免反复解冻。冻干瘤胃液是将新鲜瘤胃液经离心处理,再将混合物在真空下冷冻干燥制成[21],具有易于保存且微生物存活率较高的优势,有利于菌株快速进入休眠状态[22,27]。Yu等[21]通过食管从5只10月龄健康雄性湖羊身上收集200 mL瘤胃液,4 ℃下24 000×g离心20 min,弃去上层清液,剩余物在1 000 mL 10%脱脂牛奶中重新悬浮,得到的混合物经真空冷冻干燥制成冻干瘤胃液,口服1 g/d冻干瘤胃液22 d后提高了断奶前羔羊的粗蛋白质和非结构性碳水化合物的消化率。由于其效果较好,操作方便,冻干瘤胃液在瘤胃内容物移植领域逐渐受到重视。
1.2 功能性瘤胃微生物组挖掘
RMT中起关键作用的微生物组是挖掘微生物资源的重要目标,可根据宏基因组等高通量测序的检测结果,不断调整人工培养条件,通过培养组学筛选出潜在的功能益生菌。目前,功能性瘤胃微生物组移植大多数研究尚停留在功能性微生物组的动物模型构建,即对供体预先设置条件,形成带有一定特征或者功能的微生物组后再移植,例如给奶山羊饲喂高纤维饲粮,最大限度地富集纤维降解菌后对小鼠进行RMT,结果提高了小鼠的纤维降解能力[28]。此外,微生物分离新技术如培养组学、微流控[29]和原位培养技术[30]等的不断发展,扩大了人类可培养菌种库,为微生物组的构建奠定了基础。因此,功能性瘤胃微生物组的挖掘还可以通过预先构建核心菌群实现,如科学家构建了复杂且定义明确的合成微生物组,并将其成功移植到小鼠体内发挥功能,使得基于工程微生物组的治疗方法成为可能[31];以小鼠为试验单元,将临床培养的4种乳酸菌制备成联合菌进行阴道菌群移植,显著减少了阴道组织损伤,恢复了小鼠的阴道菌群紊乱[32];研究人员基于猪的粪便微生物移植,以猪和小鼠的模型验证了4种核心菌群在调节猪和小鼠肌肉中的脂肪沉积方面的重要作用[33]。这些研究初步证明了微生物组体外构建的可行性,为功能性瘤胃微生物组的构建和移植提供应用参考。但微生物间的相互作用、胃肠道菌群变化和微生物代谢对宿主代谢的影响、潜在益生菌效应以及可能的作用机制,还需在未来的研究中不断挖掘。
2 RMT的应用
2.1 对幼龄反刍动物的应用效果
幼龄反刍动物瘤胃微生物的定植可直接影响宿主表型,且对幼龄动物瘤胃微生物群的建立有着长久影响[34-35],早期实施RMT可提高反刍动物早期的生长性能,缓解断奶应激导致的能量负平衡,促进幼龄反刍动物的健康发育[36]。RMT在幼龄反刍动物上的应用见表1。新生反刍动物灌服成年新鲜瘤胃液可提高营养物质表观消化率[21],改善瘤胃发酵,提高受体干物质采食量和平均日增重[1]。固体采食量的提高促进了断奶前瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)的产生(尤其是乙酸和丙酸)和吸收[18],刺激瘤胃运动,从而加快瘤胃肌肉发育和瘤胃上皮细胞及乳头形态发育[37]。此外,RMT使得细菌和纤毛虫等微生物迅速接种到受体动物上,改变瘤胃微生物区系,促进瘤胃菌群结构迅速建立[18,38],显著降低腹泻发生的频率[39]。因此,在今后的研究中,RMT有望作为促进瘤胃成熟、提高动物生长发育的策略之一,同时成为应对幼龄反刍动物由液体饲料过渡到固体饲料产生应激导致腹泻的手段之一。但应用前需充分注意受体的生理状态和供体瘤胃液成分,避免幼龄反刍动物因肠道微生物的快速变化对宿主造成不利影响[40],导致生长性能一定程度的下降或免疫性能的损害[17]。
表1 RMT在幼龄反刍动物的应用Table 1 Application of RMT in young ruminants |
| 项目 Items | 收集方法 Collection method | 受体 Recipient | 移植方式 Transplantation mode | 移植剂量 Transplantation dose | 应用效果 Application effect | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tellicherry山羊 Tellicherry goats | 屠宰后收集 | Tellicherry 山羊羔羊 | 新鲜和冷冻瘤 胃液随乳饲喂 | 每3 d 1次, 每次100 mL | 提高受体生长性能,饲喂新鲜 瘤胃液效果更佳 | Tamilinban 等[20] |
| 经产母牛 Multiparity cows | 瘤胃瘘管 | 6对双胞胎 犊牛 | 新鲜瘤胃液 胃管灌服 | 每周3次,第2、3周剂量为5 mL/d, 第4周剂量增加到10 mL/d | 加速细菌、古菌群落和纤毛虫原生 动物的建立,刺激断奶前体重增加, 提高固体采食量 | Huuki等[1] |
| 5只雄性湖羊 Five male Hu sheep | 胃管收集 | 48只湖羊 羔羊 | 冻干瘤胃液饲喂 | 口服1 g/d冻干 瘤胃液 | 提高断奶前羔羊的消化率,增加断 奶羔羊瘤胃中有益菌相对丰度, 提高丙酸产量,减轻断奶应激 | Yu等[21] |
| 4只乌珠穆沁羊 Four Wuzhumuqin sheep | 胃管收集 | 30只乌珠 穆沁羔羊 | 新鲜瘤胃液饲喂 冻干瘤胃液饲喂 | 饲喂100 mL新鲜瘤液(共7 d) 饲喂1.8 g冻干瘤胃液(共7 d) | 改善饲料转化率,提高平均日增重、 营养物质表观消化率 改善饲料转化率,提高粗脂肪表观消化率 | Zhong等[22] |
| 8只成年山羊 Eight adult goats | 瘤胃瘘管 | 80只Murciano- Granadina 山羊羔羊 | 新鲜和高压瘤 胃液胃管灌服 | 第1周2.5 mL/只, 之后5 mL/只 | 促进原虫早期定居,提高了瘤胃 挥发性脂肪酸的产生和吸收,有利于断奶 | Belanche 等[18] |
| 4头荷斯坦奶牛 Four Holstein cows | 瘤胃瘘管 | 20头新生 公犊牛 | 新鲜和高压瘤胃 液胃管灌服 | 出生后第3天、第7天、第21天、 第42天和第50天每头小牛灌服 100、200、300、400和500 mL | 不影响平均日采食量、平均 日增重、胸围或饲料转化率,但 显著降低了腹泻发生率 | Bu等[39] |
| 8只3月龄母羊、8只1岁成年母羊 Eight 3-month-old ewes and eight 1-year- old adult ewes | 胃管收集 | 38只断奶前 湖羊羔羊 | 新鲜瘤胃液胃 管灌服 | 分别接种3月龄、1岁母羊 瘤胃液25 mL | 加速瘤胃微生物的成熟,但胃肠道 完整性和免疫力受到一定损害,导致采食量 降低,饲料消化率降低,生长性能下降 | Yin等[17] |
2.2 对成年反刍动物的应用效果
由于成年反刍动物瘤胃发育较为完全,瘤胃微生物区系较稳定,外源微生物在宿主内的定植存在一定的局限性[35]。RMT在成年反刍动物的应用见表2。通过移植高产牛和高乳脂肪含量的奶牛瘤胃内容物可在一段时间内提高受体荷斯坦奶牛的牛奶生产效率[19]和乳脂率[41],但7~10 d逐渐恢复到移植前状态;将纤维消化率较高的野牛瘤胃液移植到肉牛瘤胃中,没有起到显著改变纤维消化率的作用[42];Santos等[25]使用3头健康奶牛作为供体,接种到6只健康绵羊,发现瘤胃微生物群落发生变化,但不改变优势原生动物,表明新引入的生物体在瘤胃定植方面是有一定限度的。然而外源微生物的植入造成微生物区系的变化,对奶牛反刍有一定的刺激作用,可增加动物食欲[23],提高奶牛干物质采食量[43],一定程度上有利于奶牛的生长发育。
表2 RMT在成年反刍动物的应用Table 2 Application of RMT in adult ruminants |
| 项目 Items | 收集方法 Collection method | 受体 Recipient | 移植方式 Transplantation mode | 移植剂量 Transplantation dose | 应用效果 Application effect | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 高产奶效率荷斯坦奶牛 High yield milk efficiency Holstein cows | 瘤胃瘘管 | 低产奶效率 瘘管荷斯坦奶牛 | 瘘管内容物转移 | 瘤胃内容物约 95%交换 | 7 d内受体牛产奶效率增加,但相关 群落在10 d内恢复到交换前 | Weimer等[19] |
| 5头瘘管荷斯坦奶牛 Five fistula Holstein cows | 瘤胃瘘管 | 10头肠道菌群 紊乱瘘管荷斯 坦奶牛 | 瘘管内容物转移 | 试验组转移10 L内容物,对照组 转移10 L蒸馏去离子水 | 促进前肠和后肠 微生物群紊乱的恢复 | Ji等[23] |
| 32头野牛 Thirty-two bison | 屠宰后收集 | 16头瘘管安格 斯×海福特 杂交肉牛 | 瘘管内容物转移 | 替代肉牛70% 瘤胃内容物 | 由于补充外源纤维降解酶,饲料 消化率的改善不依赖接种源 | Ribeiro等[42] |
| 2头奶牛 Two cows | 瘤胃瘘管 | 45只患病牛 (食欲下降等 不同潜在疾病) | 胃管灌服 | 1组灌服1 L,2组灌服5 L, 对照组灌服38 ℃温水5 L | 少量瘤胃液输注即可有效 改善瘤胃功能和采食量 | Steiner等[16] |
| 15头湖羊 Fifteen Hu sheep | 瘤胃瘘管 | 10只瘤胃酸 中毒湖羊 | 瘘管内容物 转移 | 试验组瘘管转入5 L瘤胃液; 对照组瘘管转入5 L生理盐水 | 降低脂多糖水平,使其更迅速的 从生态失调状态恢复 | Liu等[44] |
3 RMT的作用机制
RMT可以加快微生物群落的建立,促进瘤胃成熟,恢复紊乱的微生物群落,缓解动物消化不良等症状。其作用机制可从以下几个方面进行阐述:1)微生物迅速抢占瘤胃内可用生态位,与病原体及有害菌形成竞争关系[47]。早期操纵微生物群落有利于加速瘤胃微生物的定植,此过程使得有益菌及其产生的抑菌物质通过生物夺氧、抑菌效应等方式与有害菌竞争养分或者吸附点[48-49],尤其是幼龄反刍动物瘤胃功能尚未发育完全,RMT有利于瘤胃微生物区系的快速建立[50],促进瘤胃成熟。2)微生物代谢终产物改变瘤胃发酵途径,促进瘤胃稳态。组成状态良好的微生物区系可以增加宿主可利用的VFA含量或减少产生甲烷的可利用底物,VFA的吸收和利用可刺激幼龄反刍动物瘤胃上皮代谢,促进瘤胃上皮和乳头的发育;其差异还与成年反刍动物的饲料效率和甲烷排放量相关[51],进而提高生产性能。此外,RMT还可上调某些微生物代谢途径中关键基因的表达,增强瘤胃内碳水化合物和脂质物质的代谢作用,影响乳脂肪前体物合成情况,最终提高乳脂肪的产量[41]。3)外源微生物的加入改变了宿主的代谢通路。血清代谢组学显示RMT后肝脏代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和胆汁酸代谢等均发生变化[52]。代谢组学的蓬勃发展可供人们更深入地了解瘤胃微生物和宿主的代谢途径,微生物代谢物的变化可能会影响宿主的活动,而宿主的生理和生物学变动也可能导致微生物组及其代谢物的波动[53]。3条作用途径相关机制见图1。
图1 RMT作用机制RMT:瘤胃微生物移植。VFAs:挥发性脂肪酸。GH43:糖苷水解酶家族43。①微生物抢占瘤胃内可用生态位途径;②微生物代谢产物对瘤胃的影响途径;③RMT对宿主代谢影响途径。红色箭头代表上调。 Fig.1 Mechanism of RMT RMT: rumen microbial transplantation; VFAs: volatile fatty acid. GH43: glycoside hydrolase family 43. ① the way of microorganisms preempt the available niche in the rumen; ② the way of influence of microbial metabolites on rumen; ③ the way of influence of RMT on host metabolism. The red arrow means up. |
4 影响RMT的因素分析
5 小结与展望
反刍动物瘤胃微生物群的稳定及其结构和功能的变化均对宿主的健康和生产性能有重要影响。前人通过大量试验证明,瘤胃液移植改变或重塑受体瘤胃微生物群落或肠道菌群结构,对反刍动物的生产性能、消化疾病和幼龄动物生长发育等方面都有着积极的作用。随着多组学技术和高通量测序等生物技术手段的发展,以及对瘤胃液中具有特定功能的菌群进行选择及体外培养研究的逐渐深入,更多高效且特异性的单一或复合微生态制剂可被培养和开发,以对瘤胃微生物的定植发育起到更有效的特异性调控作用。RMT有望通过微生物间的相互作用及不同种属微生物瘤胃定植能力差异的研究,实现对微生物菌群的有效特异性移植,以减少现存RMT技术的不足之处,达到促进幼龄反刍动物生长发育、提高反刍动物生产性能的目的。
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