乳是哺乳幼畜及人类重要的养分来源。乳中丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、维生素及矿物质等对以乳为营养来源的机体生长发育至关重要。与牛乳常乳相比,马乳常乳的主要营养特点是乳糖和多不饱和脂肪酸含量高、维生素含量丰富以及胆固醇含量低[1]。此外,马乳特殊的营养功效还体现在抗病毒、抗炎和抗疲劳等方面,并对治疗糖尿病、高血脂等疾病具有较好的辅助作用[2]。乳腺上皮细胞是研究乳腺泌乳机制的重要材料[3],建立乳腺上皮细胞模型对乳腺生物学及泌乳功能的基础性研究尤为重要。目前已经建立了包括人、小鼠、奶牛、猪、绵羊、山羊和水牛等多种哺乳动物的乳腺上皮细胞系[4⇓⇓⇓⇓⇓⇓-11],应用于人和动物正常乳腺细胞泌乳、增殖、分化、细胞间信息传递和乳腺癌等研究上。马属动物泌乳相关的研究主要集中在品种改良、基因调控以及通过饲粮营养水平改善母马泌乳能力,其泌乳相关机制的问题仍不清楚。因此,建立马乳腺上皮细胞体外培养体系,增加乳腺上皮细胞系种类,丰富乳腺生物学内容,提供乳腺特异性表达载体的检测系统模型,对进一步深入研究母马泌乳机制、充分发挥母马泌乳潜力以及生产优质马乳具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 乳腺组织
手术法采集健康的泌乳期哈萨克母马(2胎)乳腺组织。将母马麻醉后,使用碘伏溶液对母马乳房进行清洗,随后用75%的酒精进行消毒处理;使用手术刀割开表层皮肤组织,沿筋膜表面分离乳腺组织,环切乳腺,环切半径为2 cm,环切深度为皮下3 cm;将所切割的乳腺组织放入含75%酒精的50 mL离心管中,5~10 s后取出,再用含有1%青-链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗;待洗去血渍和乳汁后,放入含2%青-链霉素的PBS的50 mL无菌样品管中,贴好封口膜,置于冰盒中迅速带回实验室。
1.1.2 主要试剂
DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶、PBS和青-链霉素(双抗)购自Gibco公司(美国),胎牛血清(FBS)、透明质酸酶和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司(美国),Ⅰ型胶原酶购自BioFroxx公司(德国),Trizol、二甲基亚砜(DMSO)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液购自上海碧云天生物技术有限公司,反转录试剂盒及PCR相关试剂购自TaKaRa公司(日本),鼠抗细胞角蛋白18(cytokeratin 18)购自ProSci公司(美国),FITC标记兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)购自Jackson公司(美国),CCK-8试剂、4%多聚甲醛和Triton-X 100购自兰杰柯科技有限公司。
1.1.3 主要仪器
超净工作台(SW-CJ-2FD,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、CO2培养箱(WCI-180N,WIGGENS公司,德国)、倒置显微镜(ICX41-T,宁波舜宇仪器有限公司)、激光共聚焦显微镜(C-2,Nikon公司,日本)、离心机(TDZ5-WS,湖南赫西仪器装备有限公司)、-20 ℃冰箱(BCD-196F,海尔智家股份有限公司)、-80 ℃冰箱(DW-HL218,中科美菱低温科技股份有限公司)、恒温水浴锅(SHHW21.420AⅡ,天津泰斯特仪器有限公司)、恒温振荡器(SHA-C,上海一恒科学仪器有限公司)、高压蒸汽灭菌锅(BL-75A,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、凝胶成像仪(WD-9403F,北京六一生物科技有限公司)、电子天平(AL-204,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、PCR仪(AG-6325,Eppendorf公司,德国)、酶标仪(Infinite-M200,TECEN公司,瑞士)等。
1.1.4 溶液的配制
完全培养基:每50 mL DMEM/F12培养基中含500 μL青-链霉素和5 mL胎牛血清。
含1%青-链霉素的PBS:每50 mL PBS中含500 μL青-链霉素。
含2%青-链霉素的PBS:每50 mL PBS中含1 mL青-链霉素。
细胞冻存液:DMEM/F12培养基∶FBS∶DMSO=7∶2∶1。
1.2 试验方法
1.2.1 马乳腺上皮细胞的体外分离培养
取上述制备的马乳腺组织置于含1%青-链霉素的PBS的培养皿中,用眼科剪和眼科镊剔除乳腺组织外部筋膜、脂肪组织和纤维束状结缔组织,剩余组织样用眼科剪剪成糊状;将糊状乳腺组织与同时含有0.1%Ⅰ型胶原酶和0.01%透明质酸酶的消化液按1∶3(乳腺组织∶消化液)的体积比置于50 mL离心管中;将该50 mL离心管置于恒温振荡器中,37 ℃下以100 r/min的速度振荡消化5 h,待大部分组织被消化后,加入等体积的完全培养基终止消化;再用100和200目细胞筛先后过滤,过滤物置于15 mL离心管中,1 000 r/min离心5 min,弃上清液;沉淀中加入4 mL完全培养基,接种在T25细胞培养瓶中,置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养,每2 d更换1次培养基。
1.2.2 马乳腺上皮细胞的传代和纯化
马乳腺上皮细胞培养过程中会有成纤维细胞混杂生长,根据细胞对胰蛋白酶敏感性的不同,可将两者分离。待细胞铺满瓶底85%左右时,吸去瓶中培养基,用含1%青-链霉素的PBS漂洗2次;加入1 mL的0.25%胰蛋白酶溶液,放入37 ℃、5%CO2培养箱中消化成纤维细胞;显微镜下观察,待成纤维细胞被消化后加入等体积的完全培养基终止消化,弃去瓶内消化液;再用含1%青-链霉素的PBS漂洗2次后,加入1 mL的0.25%胰蛋白酶溶液继续消化未脱壁细胞,待消化下大部分细胞时,加入等体积的完全培养基终止消化;吸取消化液于15 mL离心管中,1 500 r/min离心5 min;去上清,加入4 mL完全培养基重悬细胞,接种至新的T25细胞培养瓶中,于37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养,每2 d更换1次培养基。连续纯化多次,去除大部分成纤维细胞,最终得到较纯的马乳腺上皮细胞。
1.2.3 马乳腺上皮细胞的冻存和复苏
待细胞生长至85%~90%,吸掉原培养基,用含1%青-链霉素的PBS清洗,加入1 mL的0.25%胰蛋白酶消化;待细胞脱落后,加入等体积的完全培养基终止消化;吸取消化液于15 mL离心管中,1 000 r/min离心5 min,弃去上清后加入1 mL细胞冻存液,转移到2 mL冻存管中,做好标签,用封口膜封口,放入程序性降温冻存盒中于-80 ℃冰箱过夜,第2天转移到液氮中长期保存。
从液氮中将装有马乳腺上皮细胞的冻存管取出,将其迅速放入37 ℃水浴锅中摇动使其融化;融化后将冻存液吸至15 mL离心管中,再加入3倍体积的完全培养基,1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入4 mL完全培养基,吹打均匀后接种至T25细胞培养瓶中,于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养,每2 d更换1次培养基。
1.2.4 马乳腺上皮细胞生长曲线的绘制
采用CCK-8法进行细胞生长曲线的绘制。将马乳腺上皮细胞以2×104个/mL的浓度接种到24孔板中,共分7组,每组3个重复,每孔中加入1 mL完全培养基,于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养;分别于接种后1、2、3、4、5、6和7 d在每孔中加入100 μL CCK-8试剂,用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值,求每组的平均值,以培养时间为横坐标,平均OD值为纵坐标,绘制马乳腺上皮细胞生长曲线。
1.2.5 马乳腺上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳
采用Trizol法提取马乳腺上皮细胞总RNA,使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA,通过Primer 5.0设计引物,引物序列见表1,以磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参基因,进行琼脂糖凝胶电泳。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences |
| 基因名称 Gene names | 引物序列 Primer sequences (5'—3') | 产物长度 Product length/bp |
|---|---|---|
| 细胞角蛋白18 CK18 | F:ACCAACTCTGGGTTGACTGT R:CCTCCCTCAGGTTGTTCTC | 295 |
| 波形蛋白基因VIM | F:ACCGAGTTCAAGAACACCC R:CAAGGATTCCACTTTACGC | 402 |
| 磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH | F:TGTCATCAACGGAAAGGC R:GCATCAGCAGAAGGAGCA | 183 |
1.2.6 马乳腺上皮细胞的免疫荧光鉴定
将马乳腺上皮细胞接种于共聚焦培养皿中,待细胞密度达90%左右,通过免疫荧光染色鉴定马乳腺上皮细胞特异性蛋白cytokeratin 18。步骤如下:1)弃培养基,PBS清洗细胞3次,5 min/次;2)4%多聚甲醛常温下固定细胞40 min;3)弃4%多聚甲醛,PBS清洗细胞3次,5 min/次;4)用0.25%的Triton-X 100(Triton-X 100是一种非离子型表面活性剂,可溶解细胞膜,增加抗体对细胞的通透性)打孔15 min;5)弃0.25%的Triton-X 100,PBS清洗细胞3次,5 min/次;6)称取1.5 g的BSA,溶于50 mL的PBS中,配制成3%BSA,常温下封闭细胞1 h;7)弃去3%BSA,加入3%BSA稀释的一抗,稀释比例1∶100,4 ℃过夜;8)弃一抗,PBS清洗细胞3次,5 min/次;9)称取0.5 g的BSA,溶于50 mL的PBS中,配制成1%BSA,用1%BSA稀释二抗,稀释比例1∶200,加入1%BSA稀释的二抗,放置1 h,避光;10)弃二抗,PBS清洗细胞3次,5 min/次,避光;11)用DAPI染色液染细胞核,染色5 min,避光;12)弃DAPI染色液,PBS清洗细胞3次,5 min/次,避光;13)激光共聚焦显微镜拍照。
2 结果与分析
2.1 马乳腺上皮细胞的形态学观察
图1 马乳腺上皮细胞形态a:接种24 h后的“颗粒状”细胞;b:接种5 d后,成纤维细胞长出;c:接种8 d后,乳腺上皮细胞长出;d:接种10 d后,混杂生长的成纤维细胞和乳腺上皮细胞;e:细胞纯化后,成片生长的乳腺上皮细胞,呈长条状;f:冻存后复苏24 h的乳腺上皮细胞。 Fig.1 Morphology of equine mammary gland epithelial cells a: “granular” cells 24 h after inoculation; b: fibroblasts growing 5 d after inoculation; c: mammary epithelial cells growing 8 d after inoculation; d: mixed fibroblasts and mammary epithelial cells growing 10 d after inoculation; e: mammary epithelial cells growing in patches after cell purification; f: mammary epithelial cells resuscitated for 24 h after cryopreservation. |
2.2 马乳腺上皮细胞生长曲线
如图2所示,马乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”形。培养1~2 d时处于潜伏期,细胞生长较为缓慢;培养2~5 d时为对数生长期,细胞增殖速度明显加快;培养5~7 d后进入平台期,细胞增殖速度减缓。上述结果表明,本试验条件下分离培养的马乳腺上皮细胞生长状况良好。
2.3 马乳腺上皮细胞琼脂糖凝胶电泳
如图3所示,细胞角蛋白18基因(CK18)和波形蛋白基因(VIM)分别是上皮细胞和成纤维细胞的特异性基因。体外分离培养得到的细胞能表达乳腺上皮细胞特异性基因CK18,未表达成纤维细胞特异性基因VIM。
2.4 马乳腺上皮细胞免疫荧光染色鉴定
如图4所示,利用免疫荧光染色技术分析了马乳腺上皮细胞cytokeratin 18的表达情况,结果表明,cytokeratin 18表达呈阳性。
3 讨论
乳腺上皮细胞是乳腺组织中唯一具有分泌功能的细胞。从母畜妊娠期开始,乳腺上皮细胞开始进行增殖与分化,分娩后具有泌乳的功能,到干奶期,乳腺上皮细胞会因哺乳刺激的停止而大量凋亡,停止乳汁的分泌[12]。建立乳腺上皮细胞模型,对深入探究乳腺泌乳机制和改善乳品质等具有重要的作用。目前,乳腺上皮细胞的体外培养方法包括组织块法、酶消化法、机械破碎法以及乳汁分离法等[13-14],其中以酶消化法最为常见,技术也较为成熟。酶消化法是将乳腺组织剪碎成糜状,通过单一或多种酶消化后经细胞筛过滤、离心,使细胞与其他杂质分离,最后接种于培养瓶中,经胰蛋白酶多次纯化后获得较纯的乳腺上皮细胞。杨玉莹等[15]使用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化牦牛乳腺组织2~3 h,孙培皓等[16]使用Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶消化奶牛乳腺组织7~9 h,宫平等[17]使用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化奶牛乳腺组织1.5 h,这些研究均获得了较纯的乳腺上皮细胞。酶消化法分离乳腺上皮细胞的速度较快,纯度较高,但受消化酶的种类、酶的用量及消化时间的影响较大,酶的用量过大或消化时间过长,均会对乳腺上皮细胞造成较大的损伤,进而影响乳腺上皮细胞的活力。本研究参考Anand等[18]和孙培皓等[16]的方法,结合马乳腺上皮细胞的生理特点,通过改变酶的用量和消化时间,将马乳腺组织剪成糜状后使用Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶消化处理3 h,经细胞筛过滤,离心弃上清取沉淀,但只获得了少量细胞,推测可能是消化时间不足导致。因此,本研究在消化时间上加以改进,将消化时间延长至5 h后,分离的细胞数量有所增加,再经胰蛋白酶多次纯化,最终成功的获得了马乳腺上皮细胞,且生长活力较好,能够快速贴壁并分裂增殖。
对分离获得的乳腺上皮细胞进行鉴定的方法主要有形态学观察、生长曲线测定、特异性基因检测及免疫荧光鉴定。在本试验条件下,分离培养出的马乳腺上皮细胞形态主要呈长条状或岛屿状,并聚集生长;同时,该乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”形,具备正常的生理周期。这与张晓然等[19]和孙培皓等[16]培养的绵羊和奶牛乳腺上皮细胞的观察结果一致。形态学观察在一定程度上能够成为细胞鉴定的依据,操作便利,无需成本,但由于主观性较强,主要依靠研究人员的比对且不同物种细胞生长形态各异,结果可靠性较差。因此,本研究同时还对分离培养的马乳腺上皮细胞进行了细胞特异性基因的鉴定。细胞角蛋白(cytokeratin)是上皮细胞骨架的特异性蛋白,表达量强,且具有较为稳定的性质,可作为上皮细胞的标记物和鉴定指标。乳腺上皮细胞的鉴定主要以检测cytokeratin 7、8和18为主,其中以检测cytokeratin 18较为普遍[20]。宣超莹等[21]以绵羊为研究对象,提取绵羊乳腺细胞后鉴定出其cytokeratin 18表达呈阳性,确认了提取的细胞为乳腺上皮细胞。宫平等[17]通过检测cytokeratin 18,鉴定出其培养的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。段安琴等[22]发现,培养的水牛乳腺上皮细胞中cytokeratin 18大量表达。而波形蛋白(vimentin)主要存在于成纤维细胞中,其编码基因VIM可作为成纤维细胞的特异性基因[15]。在本试验条件下,通过琼脂糖凝胶电泳检测发现,培养的马乳腺上皮细胞可正常表达乳腺上皮细胞的特异性基因CK18,不表达成纤维细胞的特异性基因VIM。同时,对乳腺上皮细胞进行免疫荧光鉴定,结果显示cytokeratin 18表达呈阳性,说明本研究培养的细胞确为乳腺上皮细胞。根据免疫荧光鉴定结果还发现,马乳腺上皮细胞呈长条状,这与形态学观察结果相一致,进一步验证了本试验结果的可靠性。
4 结论
本研究利用酶消化法成功体外分离培养出了马乳腺上皮细胞,形态学观察、生长曲线、特异性基因表达和免疫荧光染色结果较为可靠,可为进一步研究马属动物泌乳机制、提高母马泌乳性能以及后期马乳腺上皮细胞水平上的相关研究提供一定的参考。
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