动物营养学报 >

2023 , Vol. 35 >Issue 12: 8053 - 8073

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2023.730

研究论文

基于网络药理学与分子对接技术探究辣木叶治疗肠炎的作用机制

  • 董雯雯 , 1 ,
  • 张玉霞 1 ,
  • 袁小远 1 ,
  • 李峰 1 ,
  • 张世栋 1 ,
  • 徐怀英 1 ,
  • 李福伟 1 ,
  • 刘玮 1 ,
  • 王云超 2, 3 ,
  • 刘庆彬 3 ,
  • 朱应波 3 ,
  • 李桂明 , 1, * ,
  • 孟凯 , 1, *
展开
  • 1 山东省农业科学院家禽研究所,济南 250100
  • 2 山东蓝海生态农业有限公司,东营 257100
  • 3 东营蓝海生态养殖有限公司,东营 257100
* 李桂明,研究员,E-mail: ;
孟 凯,副研究员,E-mail:

董雯雯(1990—),女,山东德州人,助理研究员,硕士,从事家禽疫病诊断与防控以及植物提取物活性成分研究。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2023-05-17

  网络出版日期: 2023-12-11

基金资助

山东省自然科学基金项目(ZR2021MC060)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2023A10)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2023A22)

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2023A34)

山东省重点研发计划项目(2022LZGC014)

泰山产业领军人才工程专项(tscx202306046)

山东省农业良种工程课题任务书(2022LZGC013)

收起

Mechanism of Moringa oleifera Leaves in Treating Enteritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

  • DONG Wenwen , 1 ,
  • ZHANG Yuxia 1 ,
  • YUAN Xiaoyuan 1 ,
  • LI Feng 1 ,
  • ZHANG Shidong 1 ,
  • XU Huaiying 1 ,
  • LI Fuwei 1 ,
  • LIU Wei 1 ,
  • WANG Yunchao 2, 3 ,
  • LIU Qingbin 3 ,
  • ZHU Yingbo 3 ,
  • LI Guiming , 1, * ,
  • MENG Kai , 1, *
Expand
  • 1 Poultry Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100, China
  • 2 Shandong Blue Sea Ecological Agriculture Co., Ltd., Dongying 257100, China
  • 3 Dongying Blue Sea Ecological Breeding Co., Ltd., Dongying 257100, China
* LI Guiming, professor, E-mail: ;
MENG Kai, associate professor, E-mail:

Received date: 2023-05-17

  Online published: 2023-12-11

Fold

摘要

本研究旨在采取网络药理学与分子对接技术探究辣木叶水溶性活性成分治疗肠炎的作用机制。通过文献检索搜集辣木叶水溶性活性成分,在PubChem数据库获取化学结构,通过Swiss Target Prediction数据库预测潜在靶点,同时检索GeneCards数据库获取辣木叶活性成分与肠炎重合靶点;随后将上述重合靶点导入STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络,通过Cytoscape软件CytoNCA插件筛选核心靶点,随后经DAVID数据库对筛选的核心靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析,并运用R语言clusterProfiler程序包分析关键通路富集靶点情况,最后经Autodock-Tools软件将核心靶点以及活性成分进行分子对接。结果表明:1)筛选出的辣木叶水溶性活性成分主要包括芥子酸、肉桂酸、山奈酚、槲皮素、柚皮素、辣木碱、niazimin A和原儿茶酸等31种,其对应的核心靶点有35个。2)PPI网络分析结果发现,SRC原癌基因非受体酪氨酸激酶(SRC)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP9)以及蛋白激酶B1(AKT1)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和热休克蛋白90 α家族A类成员1(HSP90AA1)等是辣木叶治疗肠炎的关键靶点。3)KEGG信号通路富集分析发现,筛选的核心靶点主要参与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)、Toll样受体(TLR)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NOD样受体等信号通路,并通过EGFR、MMP9、RELA原癌基因核因子-κB亚基(RELA)、SRC、AKT1、核因子-κB亚基1(NFKB1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、Toll样受体4(TLR4)、HSP90AA1、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和CREB结合蛋白(CREBBP)等起到治疗肠炎的作用。4)分子对接预测结果表明,芥子酸和niazimin A与关键靶点均能稳定结合。综上可知,辣木叶活性成分可通过相应的信号通路发挥抗炎、抗病毒作用,同时也可调节细胞分化、凋亡等生物过程,这为辣木叶在肠道性疾病中的进一步发展和应用提供了理论基础。

关键词： 辣木叶; 网络药理学; 分子对接; 活性成分; 肠炎

本文引用格式

董雯雯 , 张玉霞 , 袁小远 , 李峰 , 张世栋 , 徐怀英 , 李福伟 , 刘玮 , 王云超 , 刘庆彬 , 朱应波 , 李桂明 , 孟凯 . 基于网络药理学与分子对接技术探究辣木叶治疗肠炎的作用机制[J]. 动物营养学报, 2023 , 35(12) : 8053 -8073 . DOI: 10.12418/CJAN2023.730

Abstract

The aim of this study was to explore the mechanism of water-soluble active components of Moringa oleifera leaves in treating enteritis by using network pharmacology and molecular docking technology. The water-soluble active components of Moringa oleifera leaves were collected through literature search, the chemical structure was obtained in PubChem database, the potential targets were predicted by Swiss Target Prediction database, and the overlapping targets of the active components of Moringa oleifera leaves and enteritis were obtained by GeneCards database. Subsequently, the above overlapping targets were imported into STRING database to construct protein-protein interaction (PPI) network, and core targets were screened by Cytoscape software CytoNCA plug-in. Then DAVID database was used to conduct gene ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) signaling pathway enrichment analysis for the selected core targets, and the R clusterProfiler package was used to analyze the enrichment targets in key pathways. Finally, the core targets and the active components were docked by Autodock-Tools software. The results showed as follows: 1) a total of 31 water-soluble active components of Moringa oleifera leaves were selected, including sinapic acid, cinnamic acid, kaempferol, quercetin, naringin, moringa, niazimin A and protocatechuic acid, and there were 35 corresponding core targets. 2) PPI network analysis showed that SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase (SRC), epidermal growth factor receptor (EGFR), matrix metalloproteinase 9 (MMP9), protein kinase B1 (AKT1), prostaglandin endoperoxide synthase 2 (PTGS2) and heat shock protein 90 alpha family class A member 1 (HSP90AA1) were the key targets of Moringa oleifera leaves in treating enteritis. 3) Enrichment analysis of KEGG signaling pathway showed that the selected core targets were mainly involved in phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protein kinase B (AKT), Toll-like receptor (TLR), tumor necrosis factor (TNF), mitogen-activated protein kinase (MAPK), NOD-like receptor and other signaling pathways, and EGFR, MMP9, RELA proto-oncogene nuclear factor-κB subunit (RELA), SRC, AKT1, nuclear factor-κB subunit 1 (NFKB1), mitogen-activated protein kinase 8 (MAPK8), Toll-like receptor 4 (TLR4), HSP90AA1, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), vascular endothelial growth factor A (VEGFA) and CREB binding protein (CREBBP) had been used to treat enteritis. 4) Molecular docking prediction results showed that sinapic acid and niazimin A could stably bind to key targets. In conclusion, the active components of Moringa oleifera leaves can play anti-inflammatory and antiviral effects through corresponding signaling pathways, and can also regulate biological processes such as cell differentiation and apoptosis, which provides a theoretical basis for the further development and application of Moringa oleifera leaves in intestinal diseases.

Key words： Moringa oleifera leaves; network pharmacology; molecular docking; active components; enteritis

肠道在抗炎、抗感染和消化吸收等方面担任着至关重要的角色,是机体重要的免疫防线,肠道健康与机体生产水平与效率息息相关。当前,由多样应激、病原菌等导致的肠道炎症多发,肠道炎症损伤不仅可导致机体免疫能力下降和生长抑制,还可对机体远端器官功能造成影响[1];长期的炎症还会促进肿瘤的发生,严重的甚至导致死亡[2]。目前,针对肠道炎症性疾病多选用抗生素、甾体和非甾体类抗炎药等,但由于药物残留及毒副作用等弊端,此类药物不仅严重影响人类健康,还会造成严重的环境污染问题[3]。因此,亟需开发新型健康药物缓解肠道炎症,改善肠道健康。
辣木(Moringa oleifera Lam.)起源于印度北部,属被子门、辣木科、辣木属植物。辣木生长速度较快且具有较强的抗旱能力,其叶、果、根及皮均含有丰富的优质植物蛋白质、维生素等营养物质,并富含多种生物活性成分,如黄酮、多酚和维生素C素等,其提取物具有多种生物活性,如抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等,且无毒副作用,目前在热带、亚热带地区均广泛种植[4]。我国在2012年特批辣木为新资源食品,辣木提取物在高蛋白质饲料、功能食品等方面均表现出良好的应用前景。此外,辣木叶在印度传统医学中主要用于消炎止痛药物[5-6]。
网络药理学作为近年来中医药研究领域的前沿和热点新兴科学,已被广泛用于“多靶标与多种疾病”间复杂网络关系的研究,该技术可快速有效分析出药物、疾病及生物系统间的网络关系。网络药理学主要是依靠组学数据分析、数据库检索以及虚拟计算等手段,获取出与实际临床研究相符的研究结论,并从复杂的网络关系中系统研究出待测药物对相关疾病的干预机制[7]。该方法为中医药由经验医学转化至循证医学体系提供了一种新的研究思路,可改善现有药物发现策略。分子对接是一种基于受体结构特征与药物相互结合的方式来进行相关药物设计的技术,其主要是通过预测受体和配体相互结合的模式和亲和力,继而虚拟筛选药物靶点,预测活性成分[8]。Huang等[9]通过网络药理学分析确定了枸杞4个不同产地的18种挥发性活性成分,筛选出了27个潜在靶蛋白和65条信号通路,详细剖析了其抗炎分子机制。张子越等[10]利用网络药理学筛选出了马齿苋的10个活性成分及其对应的187个靶点,并发现马齿苋通过ATP结合盒亚家族C成员4(ABCC4)、ATP结合盒超家族G成员2(ABCG2)等发挥治疗结肠炎的作用。本研究通过构建网络药理学模型,系统分析了辣木叶主要水溶性活性成分治疗肠炎的作用机制,并建立了潜在核心靶点与活性成分之间的分子对接模型,以证实预测结果,以期为后续研究和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 辣木叶水溶性活性成分筛选及潜在作用靶点的获取

通过检索相关文献收集辣木叶水溶性活性成分,并在PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得化学结构。将上述各活性成分分别导入SwissADME平台(http://www.swissadme.ch)筛选辣木叶水溶性活性成分,同时设定水溶性预测结果中均为“soluble,soluble/very,soluble/highly”的成分为辣木叶潜在水溶性活性成分[11]。然后,在Swiss Target Prediction数据库(http://www/swisstargetprediction.ch/)检索上述辣木叶水溶性活性成分的相关靶点,同时利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对相关靶点进行标准化。

1.2 辣木叶治疗肠炎作用靶点网络构建

利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)输入“enteritis”为关键词,筛选相关性(relevance)大于2倍中位数的靶点。利用毒性与基因比较数据库(comparative toxicogenomics database,CTD)(http://ctd.mdibl.org/)的MyVenn模块,制作辣木叶水溶性活性成分作用靶点与肠炎靶点韦恩图,以获取辣木叶治疗肠炎的潜在靶点,随后将辣木叶水溶性活性成分对应的相关靶点导入Cytoscape软件构建“活性成分-疾病靶点”网络。

1.3 蛋白质互作(PPI)网络构建

利用GeneCards数据库筛选靶点,并通过在线网站STRING(https://cn.string-db.org/)导入靶点进行PPI网络构建,将结果导入Cytoscape软件进行绘图;同时,使用软件中的CytoNCA插件分析接近中心性、度中心性、特征向量中心性、介数中心性及网络中心性等指标,筛选出排名靠前的靶点作为核心靶点,经Cytoscape软件对PPI网络图进行可视化。

1.4 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析

利用Cytoscape软件插件模块中的CytoNCA插件筛选出符合条件的核心靶点,并且将结果导入在线网站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)中进行富集分析,物种及基因背景设置为“homo sapiens”,以P<0.05为筛选标准进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,以探究辣木叶干预肠炎所参与的主要信号通路,并利用R语言绘制主要信号通路可视化气泡图,同时经clusterProfiler程序包绘制靶点在关键通路中的路线图。最后利用Cytoscape软件构建辣木叶水溶性活性成分-核心靶点-信号通路的网络可视化图,明确活性成分、靶点与通路之间的关系。

1.5 活性成分与治疗肠炎关键靶点的分子对接

以PPI网络中度值排名前2的辣木叶活性成分为分析对象,与其所对应的靶点(度值排名前3)进行分子对接。首先,经PubChem数据库下载辣木叶候选活性成分的2D结构,采用Chem 3D软件进行3D结构修饰。然后,在PDB数据库(https://www.rcsb.org/structure)进行SRC原癌基因非受体酪氨酸激酶(SRC)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及蛋白激酶B1(AKT1)等关键靶点pdb格式的下载,并采用PyMOL软件进行去水去配体处理。最后,采用Autodock-Tools 1.5.6软件进行靶点与活性成分的分子对接,最佳构象选用自由结合能数值最低的结合构象,然后通过PyMOL软件进行分子对接。

2 结果

2.1 辣木叶水溶性活性成分筛选

通过文献搜集,以Lipinski类药性、水溶性及肠吸收等为筛选条件,共获得辣木叶31种水溶性活性成分,其中主要为芥子酸、肉桂酸、山奈酚、槲皮素、柚皮素、辣木碱、niazimin A、原儿茶酸和异硫氰酸苄酯等,其相关参数及化学结构见表1。
表1 辣木叶水溶性活性成分

Table 1 Water-soluble active components of Moringa oleifera leaves

类别
Categories		 编号
ID		 中文名
Chinese
name		 英文名
English
name		 水溶性
Water
solubility		 规范化简化分子
线性输入规范
Canonical SMILES
苯丙素
Phenylpropanoids		 LM01 咖啡酸 caffeic acid √ C1=CC(=C(C=C1C=CC(=O)O)O)O
LM02 邻香豆酸 o-coumaric acid √ C1=CC=C(C(=C1)C=CC(=O)O)O
LM03 对香豆酸 p-coumaric acid √ C1=CC(=CC=C1C=CC(=O)O)O
LM04 阿魏酸 ferulic acid √ COC1=C(C=CC(=C1)C=CC(=O)O)O
LM05 异阿魏酸 iso-ferulic acid √ COC1=C(C=C(C=C1)C=CC(=O)O)O
LM06 3,4,5-甲氧
基肉桂酸		 3,4,5-methoxy-
cinnamic acid		 √ COC1=CC(=CC(=C1OC)OC)/
C=C/C(=O)O
LM07 芥子酸 sinapic acid √ COC1=CC(=CC(=C1O)OC)C=
CC(=O)O
LM08 肉桂酸 cinnamic acid √ C1=CC=C(C=C1)C=CC(=O)O
LM09 香豆素 coumarin √ C1=CC=C2C(=C1)C=CC(=O)O2
黄酮
Flavones		 LM10 山柰酚 kaempferol √ C1=CC(=CC=C1C2=C(C(=O)C3=
C(C=C(C=C3O2)O)O)O)O
LM11 槲皮素 quercetin √ C1=CC(=C(C=C1C2=C(C(=O)C3=
C(C=C(C=C3O2)O)O)O)O)O
LM12 柚皮素 naringenin √ C1C(OC2=CC(=CC(=C2C1=O)O)O)
C3=CC=C(C=C3)O
生物碱
Alkaloids		 LM13 辣木碱 moringine √ C1=CC=C(C=C1)CN
LM14 niazimin A √ CCOC(=O)NCC1=CC=C(C=C1)
OC2C(C(C(C(O2)C)OC(=O)C)O)O
维生素
Vitamins		 LM15 维生素B3 vitamin B3 √ C1=CC(=CN=C1)C(=O)N
LM16 维生素C vitamin C √ C([C@@H]([C@@H]1C(=C(C(=
O)O1)O)O)O)O
LM17 维生素H vitamin H √ C1[C@H]2[C@@H]([C@@H]
(S1)CCCCC(=O)O)NC(=O)N2
酚及酚酸
Phenols and
phenolic acids		 LM18 鞣花酸 ellagic acid √ C1=C2C3=C(C(=C1O)O)OC(=O)C4=
CC(=C(C(=C43)OC2=O)O)O
LM19 没食子酸 gallic acid √ C1=C(C=C(C(=C1O)O)O)C(=O)O
LM20 龙胆酸 gentistic acid √ C1=CC(=C(C=C1O)C(=O)O)O
LM21 香草酸 vanillic acid √ COC1=C(C=CC(=C1)C(=O)O)O
LM22 原儿茶酸 protocatechuic acid √ C1=CC(=C(C=C1C(=O)O)O)O
LM23 对羟基
苯甲酸		 p-hydroxybenzoic
acid		 √ C1=CC(=CC=C1C(=O)O)O
LM24 丁香酸 syringic acid √ COC1=CC(=CC(=C1O)OC)C(=O)O
LM25 邻苯三酚 pyrogallol √ C1=CC(=C(C(=C1)O)O)O
LM26 邻苯二酚 catechol √ C1=CC=C(C(=C1)O)O
LM27 香草醛 vanillin √ COC1=C(C=CC(=C1)C=O)O
异硫氰酸酯
Isothiocyanates		 LM28 异硫氰酸苄酯 benzyl
isothiocyanate		 √ C1=CC=C(C=C1)CN=C=S
LM29 萝卜硫素 sulforaphane √ CS(=O)CCCCN=C=S
脂肪酸
Fatty acids		 LM30 邻苯二甲酸
二乙酯		 diethyl phthalate √ CCOC(=O)C1=CC=CC=
C1C(=O)OCC
LM31 丙二酸二甲酯 dimethyl malonate √ C(C(=O)O)C(=O)O

2.2 辣木叶水溶性活性成分与肠炎相关靶点的获取

将上述筛选的辣木叶水溶性活性成分经Swiss Target Prediction数据库获得957个潜在相关靶点。同时以“enteritis”为检索词,从GeneCards数据库搜索并筛选后获得肠炎相关靶点1 531个。通过CTD中的MyVenn模块将辣木叶活性成分靶点与肠炎靶点取交集制作韦恩图(图1),共获得162个辣木叶水溶性活性成分与肠炎的共有靶点(表2)。
图1 辣木叶活性成分靶点与肠炎靶点韦恩图

Fig.1 Venn diagram of active component targets of Moringa oleifera leaves and enteritis targets

表2 辣木叶活性成分对应肠炎相关交集靶点

Table 2 Active components of Moringa oleifera leaves correspond to intersectional targets associated with enteritis

成分
Components		 靶点
Targets		 靶点全称Full names of targets
英文English 中文Chinese
LM01/04/05/06/07/10/17/18 PTGS2 prostaglandin endoperoxide synthase 2 前列腺素内过氧化物合成酶2
LM01/02/03/04/05/06/07/08/14/21 MMP1 matrix metalloproteinase 1 基质金属蛋白酶1
LM01/04/05/06/07/12/17 PTGS1 prostaglandin endoperoxide synthase 1 前列腺素内过氧化物合成酶1
LM01/04/05/06/07/10/11/12/14/28 APP amyloid beta precursor protein 淀粉样β前提蛋白
LM01/02/03/04/05/06/07/08/10/11/18 ALOX5 arachidonate-5-lipoxygenase 花生四烯酸-5-脂氧合酶
LM01/04/05/06/07/10/11/14 ABCB1 ATP binding cassette subfamily ATP结合盒亚家族B成员1
B member 1
LM01/02/03/04/05/06/07/08/10/11/12/14/21 MMP2 matrix metalloproteinase 2 基质金属蛋白酶2
LM01/04/06/07/08/10/11/28 AHR aryl hydrocarbon receptor 芳香烃受体
LM01/02/03/04/05/06/07/08 TLR4 Toll-like receptor 4 Toll样受体4
LM01/04/06/07 CYP1A1 cytochrome P450 family 1 细胞色素P450家族1亚家族A成员1
subfamily A member 1
LM01/04/06/07/28 CYP1A2 cytochrome P450 family 1 细胞色素P450家族1亚家族A成员2
subfamily A member 2
LM01/04/06/07/10/11/12 CYP1B1 cytochrome P450 family 1 细胞色素P450家族1亚家族B成员1
subfamily B member 1
LM01/02/03/04/05/06/07/08/10/11/12/14/21 MMP9 matrix metalloproteinase 9 基质金属蛋白酶9
LM01/04/06/07 NFE2L2 nuclear factor erythroid 核因子红系2相关因子2
2-related factor 2
LM01/04/06/07/28 STAT3 signal transducer and activator of 信号转导与转录激活因子3
transcription 3
LM01/06/31 HMGCR hydroxymethylglutaryl-CoA reductase 羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶
LM01/04/06/07/10/11/12/14/18 MET MET proto-oncogene, receptor MET原癌基因受体酪氨酸激酶
tyrosine kinase
LM01/06 GSTP1 glutathione S-transferase Pi 1 谷胱甘肽巯基转移酶Pi 1
LM01/06/17/24 PTGDR2 prostaglandin D2 receptor 2 前列腺素D2受体2
LM01/04/06/07/10/11/17/19/21/22/24/27 TTR transthyretin 甲状腺素运载蛋白
LM01/06/07/10/11/12/28 CYP19A1 cytochrome P450 family 19 细胞色素P450家族19
subfamily A member 1 亚家族A成员1
LM01/04/06/08 SLC16A1 solute carrier family 16 member 1 溶质载体家族16成员1
LM01/04/06/07 ACE angiotensin converting enzyme 血管紧张素转化酶
LM01/05/06/07 MME membrane metalloendopeptidase 膜金属肽链内切酶
LM01/06/07/14/17 ECE1 endothelin converting enzyme 1 内皮素转化酶1
LM01/02/03/04/05/06/07/08/10/11/12/14/18/19/22/23 ESR2 estrogen receptor 2 雌激素受体2
LM01/06/17 ITGB1 integrin subunit beta 1 整合素亚基β1
LM01/04/05/06/07/08/09/10/11/14/17/18/25/26 EGFR epidermal growth factor receptor 表皮生长因子受体
LM01/06 CDK8 cyclin dependent kinase 8 细胞周期蛋白依赖性激酶8
LM01/04/05/06/07 RELA RELA proto-oncogene, RELA原癌基因核因子-κB亚基
NF-κB subunit
LM01/03/06/07/10/12/18 ESR1 estrogen receptor 1 雌激素受体1
LM01/06/17 CREBBP CREB binding protein CREB结合蛋白
LM01/06/17 ACE2 angiotensin converting enzyme 2 血管紧张素转化酶2
LM01/06/17 CXCL8 C-X-C motif chemokine ligand 8 C-X-C基序趋化因子配体8
LM01/04/05/06/10/11/13/15/17/28 PARP1 poly (ADP-ribose) polymerase 1 聚ADP核糖聚合酶1
LM01/06/14/17 CXCR2 C-X-C motif chemokine receptor 2 C-X-C基序趋化因子受体2
LM01/23 HDAC8 histone deacetylase 8 组蛋白去乙酰化酶8
LM01/02/03/17/28/29/30 MIF macrophage migration inhibitory factor 巨噬细胞游走抑制因子
LM03/04/05/07/12 F3 coagulation factor Ⅲ 凝血因子Ⅲ
LM03/04/05/12/24/25/26/31 FYN tyrosine-protein kinase Fyn 酪氨酸蛋白激酶Fyn
LM03/04/05/12/21/24/31 LCK tyrosine-protein kinase Lck 酪氨酸蛋白激酶Lck
LM04/05/07/17 CPA1 carboxypeptidase A1 羧肽酶A1
LM04/05/07 TLR9 Toll-like receptor 9 Toll样受体9
LM04/05/07/10/11 ALOX15 arachidonate-15-lipoxygenase 花生四烯酸-15-脂氧合酶
LM04 NOS2 nitric oxide synthase 2 一氧化氮合酶2
LM04/18 CCND1 cyclin D1 细胞周期蛋白D1
LM04/12/18 CDK4 cyclin-dependent kinases 4 细胞周期蛋白依赖性激酶4
LM04/05/07 CTNNB1 catenin beta 1 连环蛋白β1
LM04/05/07/10/11/13/14/28/30 F2 prothrombin 凝血酶原
LM05/07/17 ITGAL integrin alpha L 整合素αL
LM05/07/17 ICAM1 inter-cellular adhesion molecule 1 细胞间黏附分子1
LM05/07/17 ITGB2 integrin subunit beta 2 整合素亚基β2
LM05/07/14/18 ERBB2 Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2 Erb-B2受体酪氨酸激酶2
LM05/07/14 MAPK8 mitogen-activated protein kinase 8 丝裂原活化蛋白激酶8
LM07/12 IGFBP3 insulin-like growth factor- 胰岛素样生长因子结合蛋白3
binding protein 3
LM07/10 CFTR cystic fibrosis transmembrane 囊性纤维化跨膜传导调节蛋白
conductance regulator
LM07 ADA adenosine deaminase 腺苷脱氨酶
LM07 ANPEP alanyl (membrane) aminopeptidase 丙氨酰膜氨基肽酶
LM07 LTA4H leukotriene A4 hydrolase 白三烯A4水解酶
LM07/27 EP300 histone acetyltransferase P300 组蛋白乙酰转移酶P300
LM08/13/26/28 IDO1 indoleamine 2,3-dioxygenase 1 吲哚胺2,3-双加氧酶1
LM09 NFKB1 nuclear factor kappa-B subunit 1 核因子-κB亚基1
LM09/10/11/13/28/30 ACHE acetylcholinesterase 乙酰胆碱酯酶
LM09/10/11/18 XDH xanthine dehydrogenase/oxidase 黄嘌呤脱氢酶/氧化酶
LM10/11 TYR tyrosinase 酪氨酸酶
LM10/11/12/28 ABCC1 ATP binding cassette ATP结合盒亚家族C成员1
subfamily C member 1
LM10/11/12 ABCG2 ATP binding cassette ATP结合盒超家族G成员2
superfamily G member 1
LM10/11/12 SYK lysine-tRNA ligase 赖氨酸tRNA连接酶
LM10/11/12/16/18 GSK3B glycogen synthase kinase 3 beta 糖原合成酶激酶3β
LM10/11 ARG1 arginase 1 精氨酸酶1
LM10/11/18/19/20/22 GPR35 G protein-coupled receptor 35 G蛋白偶联受体35
LM10/11/12/18 CDK2 cyclin-dependent kinase 2 细胞周期蛋白依赖性激酶2
LM10/11/12/18/19/22 IGF1R insulin-like growth factor 1 receptor 胰岛素样生长因子1受体
LM10/11 MPO myeloperoxidase 髓过氧化物酶
LM10/11 PIK3R1 phosphoinositide 3-kinase 磷脂酰肌醇3-激酶调控亚基α
regulatory subunit alpha
LM10/11/12/14/18 SRC SRC proto-oncogene, non-receptor SRC原癌基因非受体酪氨酸激酶
tyrosine kinase
LM10/11/18 PTK2 protein tyrosine kinase 2 蛋白酪氨酸激酶2
LM10/11/12/14/18 KDR kinase insert domain receptor 激酶插入结构域受体
LM10/11/12/14/17 MMP13 matrix metalloproteinase 13 基质金属蛋白酶13
LM10/11/12/14 MMP3 matrix metalloproteinase 3 基质金属蛋白酶3
LM10/11/17 CXCR1 C-X-C motif chemokine receptor 1 C-X-C基序趋化因子受体1
LM10/11/19/22 ALK anaplastic lymphoma receptor 间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶
tyrosine kinase
LM10/11/18 AKT1 protein kinase B1 蛋白激酶B1
LM10/11/12 PLA2G1B phospholipase A2 group ⅠB 磷脂酶A2群ⅠB
LM10/11 AXL tyrosine-protein kinase receptor UFO 酪氨酸-蛋白激酶受体UFO
LM10/11/12/17 MMP12 matrix metalloproteinase 12 基质金属蛋白酶12
LM10/11 TOP1 DNA topoisomerase 1 DNA拓扑异构酶1
LM10/11 TERT telomerase reverse transcriptase 端粒酶逆转录酶
LM11/12/18 INSR insulin receptor 胰岛素受体
LM11 MYLK myosin light chain kinase, 肌球蛋白轻链激酶,平滑肌
smooth muscle
LM11/14 PIK3CG phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸
3-kinase catalytic subunit gamma 3-激酶催化亚基γ
LM12/17/30 CES1 carboxylesterase 1 羧酸酯酶1
LM12/17 PPARG peroxisome proliferator-activated 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
receptor gamma
LM12/17/18/30 CES2 carboxylesterase 1 羧酸酯酶2
LM12/17 PLA2G2A phospholipase A2 group ⅡA 磷脂酶A2群ⅡA
LM12 PLA2G10 phospholipase A2 group Ⅹ 磷脂酶A2群Ⅹ
LM12/19/21/22/24 SERPINE1 serpin family E member 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1
LM12 KIT KIT proto-oncogene, receptor KIT原癌基因受体酪氨酸激酶
tyrosine kinase
LM12 FGFR1 fibroblast growth factor receptor 1 成纤维细胞生长因子受体1
LM12/30 CTSB cathepsin B 组织蛋白酶B
LM12 BCHE butyrylcholinesterase 丁酰胆碱酯酶
LM12 PTGER2 prostaglandin E receptor 2 前列腺素E受体2
LM12/19/22 BCL2L1 Bcl-2-like protein 1 Bcl-2样蛋白1
LM12 PIK3CB phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸
3-kinase catalytic subunit beta 3-激酶催化亚基β
LM12 CYP2C9 cytochrome P450 family 2 细胞色素P450家族2亚家族C成员9
subfamily C member 9
LM12 CYP3A4 cytochrome P450 family 3 细胞色素P450家族3亚家族A成员4
subfamily A member 4
LM12 PIK3CA phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸
3-kinase catalytic subunit alpha 3-激酶催化亚基α
LM12 PGF placenta growth factor 胎盘生长因子
LM12 VEGFA vascular endothelial growth factor A 血管内皮生长因子A
LM12/17 EDNRA endothelin receptor type A 内皮素受体A型
LM12 BCL2 B-cell lymphoma 2 B细胞淋巴瘤2
LM12/18 AURKA aurora kinase A 极光激酶A
LM12 HNF4A hepatocyte nuclear factor 4-alpha 肝细胞核因子4α
LM12 FLG filaggrin 丝聚合蛋白
LM12 CDKN3 cyclin-dependent kinase inhibitor 3 周期蛋白依赖性激酶抑制剂3
LM13/28 PRSS1 serine protease 1 丝氨酸蛋白酶1
LM13/28/30 PLAU plasminogen activator, urokinase 尿激酶纤溶酶原激活物
LM13 KCNN4 potassium calcium-activated channel 钾钙激活通道亚家族N成员4
subfamily N member 4
LM14 ADORA2B adenosine receptor A2b 腺苷受体A2b
LM14 DNMT1 DNA methyltransferase 1 DNA甲基转移酶1
LM14 MAPK1 mitogen-activated protein kinase 1 丝裂原活化蛋白激酶1
LM14 NTRK1 neurotrophic receptor tyrosine kinase 1 神经营养受体酪氨酸激酶1
LM14 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
dehydrogenase
LM14 ABL1 tyrosine-protein kinase ABL1 酪氨酸蛋白激酶ABL1
LM14 SLC5A4 solute carrier family 5 member 4 溶质载体家族5成员4
LM14 ADAM17 ADAM metallopeptidase domain 17 ADAM金属肽酶结构域17
LM14 MTOR mechanistic target of rapamycin kinase 雷帕霉素激酶机制靶点
LM14 GSTM1 glutathione S-transferase Μ1 谷胱甘肽巯基转移酶Μ1
LM14 MAPK14 mitogen-activated protein kinase 14 丝裂原活化蛋白激酶14
LM14/18 FLT4 Fms related receptor tyrosine kinase 4 Fms相关受体酪氨酸激酶4
LM14 SLC5A1 solute carrier family 5 member 1 溶质载体家族5成员1
LM14 MMP14 matrix metalloproteinase 14 基质金属蛋白酶14
LM14 TRPV1 transient receptor potential cation 瞬时受体电位阳离子通道
channel subfamily Ⅴ member 1 亚家族Ⅴ成员1
LM14 LIPG lipase G, endothelial type 内皮型脂肪酶
LM14 CASP8 Caspase-8 半胱天冬酶-8
LM14 CASP1 Caspase-1 半胱天冬酶-1
LM14 PDGFRA platelet-derived growth 血小板衍生生长因子受体α
factor receptor α
LM14/18 PDGFRB platelet-derived growth 血小板衍生生长因子受体β
factor receptor β
LM14 JAK2 Janus kinase 2 Janus激酶2
LM14 HSPA5 heat shock protein family 热休克蛋白家族A成员5
A member 5
LM14 GC GC vitamin D binding protein GC维生素D结合蛋白
LM15 IKBKB inhibitor of nuclear factor kappa B 核因子κB激酶亚基β抑制剂
kinase subunit beta
LM17/18 HSPA1A heat shock protein A1A 热休克蛋白A1A
LM17 PPARA peroxisome proliferator-activated 过氧化物酶体增殖物激活受体α
receptor alpha
LM17/27 PTPRC protein tyrosine phosphatase 蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型
receptor type C
LM17 ITGB3 integrin subunit beta 3 整合素亚基β3
LM17 FABP1 fatty acid binding protein 1 脂肪酸结合蛋白1
LM17 GRK2 G protein-coupled receptor G蛋白偶联受体激酶2
kinase 2
LM17/28 PDE4A phosphodiesterase 4A 磷酸二酯酶4A
LM17 HSP90AA1 heat shock protein 90 alpha 热休克蛋白90 α家族A类成员1
family class A member 1
LM17/28 SLC6A4 solute carrier family 6 member 4 溶质载体家族6成员4
LM18 TEK TEK receptor tyrosine kinase TEK受体酪氨酸激酶
LM18 BRAF B-Raf proto-oncogene, serine/ B-Raf原癌基因丝氨酸/
threonine kinase 苏氨酸激酶
LM18 TNNI3 troponin Ⅰ type 3 肌钙蛋白Ⅰ型3
LM19/20/22 COMT catechol-O-methyltransferase 儿茶酚-O-甲基转移酶
LM20/22 ALB albumin 白蛋白
LM21 MMP8 matrix metalloproteinase 8 基质金属蛋白酶8
LM21/24 POLA1 DNA polymerase alpha 1, DNA聚合酶α1催化亚基
catalytic subunit
LM25/26 PTPN22 protein tyrosine phosphatase 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型
non-receptor type 22
LM27 ALPG alkaline phosphatase, germ cell type 碱性磷酸酶生殖细胞型
LM30 CTSG cathepsin G 组织蛋白酶G
LM28/30 CTSL cathepsin L 组织蛋白酶L

靶点注释图2、图3、图5、图7、图8和表3同。

Target annotations were the same in Fig.2, Fig.3, Fig.5, Fig.7, Fig.8 and Table 3.

2.3 辣木叶活性成分治疗肠炎PPI及核心靶点筛选

为确定筛选的靶点之间的相互作用,挖掘核心调控靶点,将获得的162个共同靶点导入STRING数据库,获取其PPI网络图(图2),结果显示162个靶点经STRING数据库映射后显示节点数为162,边数为989,预期边数为350,平均节点度值为12.2,平均局部聚类系数为0.501,这些靶点即为辣木叶治疗肠炎药效作用的关键靶点;随后将这些靶点导入Cytoscape软件,根据CytoNCA插件对共同靶点进行计算度中心性、接近中心性等指标筛选,同时利用Cytoscape软件绘制PPI网络图(图3),经拓扑分析,确定辣木叶治疗肠炎作用靶点的PPI网络,圆圈越大表示度值越大,相关性越强。由图3可见,共筛选出35个关键靶点,其中排名前6的核心靶点为SRC、EGFR、MMP9、AKT1、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和热休克蛋白90 α家族A类成员1(HSP90AA1),以上结果说明这些蛋白在辣木叶治疗肠炎机制中发挥关键性作用。
图2 辣木叶活性成分治疗肠炎潜在靶点的PPI网络图

Fig.2 PPI network diagram of potential targets of active components of Moringa oleifera leaves for enteritis treatment

图3 辣木叶活性成分-肠炎靶点PPI网络图

Fig.3 PPI network diagram of targets between active components of Moringa oleifera leaves and enteritis

2.4 辣木叶治疗肠炎作用靶点KEGG信号通路和GO功能富集分析

应用DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov/),将物种和基因背景设置为“homo sapiens”,对筛选出的35个辣木叶治疗肠炎活性关键靶点进行KEGG信号通路和GO功能富集分析。以P<0.05为筛选标准,共筛选出30条KEGG信号通路,并应用R语言制备KEGG信号通路富集气泡图(图4)。由KEGG信号通路富集分析可以看出,辣木叶治疗肠炎主要参与的信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)、Toll样受体(TLR)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NOD样受体等信号通路,经分析,PI3K-AKT信号通路是各靶点发挥抗肠炎作用参与最多的通路。随后,使用R语言中的clusterProfiler模块对PI3K-AKT信号通路进行可视化(图5),其中红色靶点表示辣木叶水溶性活性成分的关键靶点在PI3K-AKT信号通路中发挥作用的主要位置,表明这些靶点在该信号通路中起着关键性作用。以上结果揭示,辣木叶水溶性活性成分可以通过多条信号通路发挥治疗肠炎的作用。
图4 KEGG信号通路富集分析

PI3K-AKT signaling pathway:磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路;Relaxin signaling pathway:松弛素信号通路;Salmonella infection:沙门氏菌感染;Influenza A:流行性感冒A;EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性;Chemokine signaling pathway:趋化因子信号通路;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并发症中的糖基化终产物及其受体信号通路;Thyroid hormone signaling pathway:甲状腺激素信号通路;cAMP signaling pathway:环磷酸腺苷信号通路;Toll-like receptor signaling pathway:Toll样受体信号通路;TNF signaling pathway:肿瘤坏死因子信号通路;T cell receptor signaling pathway:T细胞受体信号通路;Sphingolipid signaling pathway:鞘脂信号通路;Pathogenic Escherichia coli infection:致病性大肠杆菌感染;JAK-STAT signaling pathway:Janus激酶-信号转导与转录激活因子信号通路;C-type lectin receptor signaling pathway:C型凝集素受体信号通路;VEGF signaling pathway:血管内皮生长因子信号通路;Neurotrophin signaling pathway:神经营养因子信号通路;MAPK signaling pathway:丝裂原活化蛋白激酶信号通路;Adherens junction:黏附连接;NOD-like receptor signaling pathway: NOD样受体信号通路;IL-17 signaling pathway:白细胞介素-17信号通路;Inflammatory bowel disease:炎症性肠病;AMPK signaling pathway:单磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路;TGF-beta signaling pathway:转化生长因子β信号通路;RIG-Ⅰ-like receptor signaling pathway:维甲酸诱导基因Ⅰ样受体信号通路;NF-kappa B signaling pathway:核因子-κB信号通路;Mitophagy-animal:动物线粒体自噬。图5和图7同 the same as Fig.5 and Fig.7.

Fig.4 KEGG signaling pathway enrichment analysis

图5 关键靶点在PI3K-AKT信号通路中发挥作用的过程

Pathogen-associated molecular patterns:病原体相关分子模式;B cell receptor signaling pathway:B细胞受体信号通路;Antigen:抗原;Cytokine:细胞因子;Focal adhesion:聚焦黏附;ECM:细胞外基质 extracellular matrix;Chemokines, hormones, neurotransmitters:趋化因子,激素,神经递质;RTK:受体酪氨酸激酶 receptor tyrosine kinase;Grb2:生长因子受体结合蛋白2 growth factor receptor bound protein 2;SOS:Ras/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子 Ras/Rac guanine nucleotide exchange factor;TLR:Toll样受体 Toll-like receptor;BCR:RhoGEF和GTP酶的BCR激活剂 BCR activator of RhoGEF and GTPase;CytokineR:细胞因子R;ITGA:整合素亚基α integrin subunit alpha;ITGB:整合素亚基β integrin subunit beta;GPCR:G蛋白偶联受体 G protein-coupled receptor;Gβγ:G蛋白βγ复合物 G protein beta-gamma complex;IRS1:胰岛素受体底物1 insulin receptor substrate 1;BCAP:磷脂酰肌醇3-激酶B细胞适配器 B-cell adapter for PI3K;PAK:P21活化激酶 P21 activated kinase;PI3K:磷脂酰肌醇3-激酶 phosphoinositide 3-kinase;Class ⅠA:ⅠA类;Class ⅠB:ⅠB类;PTEN:磷酸酯酶与张力蛋白同系物 phosphatase and tensin homolog;MAGI:膜相关鸟苷酸激酶WW和PDZ结构域 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain;Insulin signaling pathway:胰岛素信号通路;EebB signaling pathway:Erb-B2受体酪氨酸激酶信号通路;PIP3:磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate;PI(4,5)P2:磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸 phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate;PI(3,4,5)P3:磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate;PDK1:丙酮酸脱氢酶激酶1 pyruvate dehydrogenase kinase 1;CTMP:羧基末端调节蛋白 carboxyl-terminal modulator protein;PP2A:蛋白磷酸酶2A protein phosphatase 2A;AKT:蛋白激酶B protein kinase B;HSP90:热休克蛋白90 heat shock protein 90;Cdc37:细胞分裂周期37 cell division cycle 37;mTORC2:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2 mammalian target of rapamycin complex 2;PHLPP:PH结构域和富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶 PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase;TCL1:T细胞白血病/淋巴瘤蛋白1 T cell leukemia/lymphoma protein 1;Hypoxia:缺氧;REDD1:在发育和DNA损伤反应中受调控1 regulated in development and DNA damage response 1;AMP:单磷酸腺苷 adenosine monophosphate;LKB1:肝激酶B1 liver kinase B1;AMPK:单磷酸腺苷活化蛋白激酶 adenosine monophosphate activated protein kinase;TSC:结节性硬化症 tuberous sclerosis;mTOR signaling pathway:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路;Rheb:在大脑中富集的Ras同系物 Ras homolog enriched in brain;GβL:G蛋白β样 G protein beta subunit-like;4EBPs:4E结合蛋白 4E binding proteins;S6K1/2:核糖体蛋白S6激酶1/2 ribosomal protein S6 kinase 1/2;eIF4E:真核细胞翻译起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E;eIF4B:真核细胞翻译起始因子4B eukaryotic translation initiation factor 4B;S6:核糖体蛋白S6 ribosomal protein S6;Protein synthesis:蛋白质合成;PKCs:磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶 phosphoinositide dependent protein kinases;PKN:蛋白激酶N protein kinase N;SGK:血清和糖皮质激素诱导激酶 serum and glucocorticoid-induced kinase;Glucose uptake:葡萄糖摄取;Vesicle transport:囊泡运输;Actin reorganization:肌动蛋白重组;Survival signal:生存信号;Growth and proliferation:生长繁殖;eNOS:内皮型一氧化氮合酶 endothelial nitric oxide synthase;NO:一氧化氮 nitric oxide;Raf-1:Raf-1原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶 Raf-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase;MEK:丝裂原活化蛋白激酶激酶 mitogen-activated protein kinase kinase;ERK:细胞外信号调节激酶 extracellular signal-regulated kinase;Cell proliferation:细胞增殖;Angiogenesis:血管生成;DNA repair:DNA修复;GSK3:糖原合成酶激酶3 glycogen synthase kinase 3;GYS:糖原合成酶 glycogen synthase;Metabolism:代谢;PEPCK:磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶 phosphoenolpyruvate carboxykinase;Glycolysis:糖酵解;Gluconeogenesis:糖异生;Cell cycle progression:细胞周期进程;CDK:周期蛋白依赖性激酶 cyclin-dependent kinase;Cyclin:周期蛋白;Cell cycle:细胞周期;FOXO:叉头框蛋白O Forkhead box O;FoxO signaling pathway:叉头框蛋白O信号通路;FasL:Fas配体 Fas ligand;BAD:Bcl2相关的细胞死亡蛋白激动剂 Bcl2-associated agonist of cell death;Bcl-xL:b细胞淋巴瘤-特大 B-cell lymphoma-extra large;Casp9:半胱天冬酶-9 Caspase-9;Mcl-1:骨髓性白血病1 myeloid leukemia 1;RXRα:类视黄醇X受体α retinoid X receptor alpha;NUR77:核受体亚家族4群A成员1 nuclear receptor subfamily 4 group A member 1;IKK:核因子-κB激酶抑制剂 inhibitor of nuclear factor-κB kinase;NF-κB:核因子-κB nuclear factor-κB;MDM2:小鼠双分钟2同系物 mouse double minute 2 homolog;NF-κB signaling pathway:核因子-κB信号通路;p53 signaling pathway:p53信号通路。

Fig.5 Processes in which key targets play a role in PI3K-AKT signaling pathway

表3 核心靶点相关拓扑参数

Table 3 Core target related topological parameters

靶点
Targets		 自由度
Degree of
freedom		 特征向量
Eigenvector		 局部平均连同中心性
Local average
connectivity		 介数
Betweenness		 接近中心性
Closeness
centrality		 网络
Netcat
SRC 59 0.248 4 15.627 1 2 071.127 7 0.573 1 44.230 3
EGFR 54 0.240 8 16.074 0 1 198.043 0 0.568 7 39.140 2
MMP9 49 0.207 3 13.265 3 1 780.128 2 0.549 8 31.125 7
AKT1 47 0.207 2 13.574 5 1 376.353 5 0.556 0 29.031 7
PTGS2 47 0.186 5 10.680 9 1 275.601 4 0.537 9 26.004 1
HSP90AA1 43 0.194 6 13.209 3 950.644 8 0.543 8 25.038 6
ALB 42 0.192 8 14.047 6 728.799 9 0.536 0 27.425 1
STAT3 40 0.191 9 15.100 0 312.347 9 0.486 9 29.177 1
CTNNB1 38 0.186 5 15.263 2 256.423 4 0.479 1 28.245 0
CREBBP 36 0.151 1 10.000 0 863.363 1 0.506 8 17.553 9
MAPK1 33 0.152 2 11.939 4 427.686 5 0.500 0 18.378 6
APP 31 0.123 1 9.612 9 637.747 4 0.501 7 16.139 9
GAPDH 30 0.144 7 11.133 3 314.070 0 0.465 6 16.560 1
VEGFA 29 0.154 9 14.069 0 149.957 5 0.458 5 19.609 0
CXCL8 29 0.148 7 12.620 7 343.380 9 0.477 6 17.218 8
PRSS1 29 0.109 0 8.206 9 866.408 7 0.496 7 15.502 1
PPARG 28 0.105 4 8.285 7 1 436.416 3 0.503 4 13.784 7
EP300 28 0.157 6 14.357 1 96.735 6 0.471 5 17.800 9
MAPK8 28 0.148 4 11.928 6 314.798 7 0.501 7 14.738 9
CYP3A4 28 0.131 7 9.928 6 591.795 5 0.486 9 13.291 5
AHR 27 0.124 7 9.629 6 539.672 4 0.503 4 13.804 3
TLR4 27 0.117 4 9.259 3 756.162 9 0.508 5 12.699 8
CYP1A2 27 0.138 0 11.926 0 176.201 1 0.482 2 14.935 1
CYP1A1 27 0.119 4 9.259 3 383.909 6 0.457 1 14.813 6
RELA 26 0.087 7 6.538 5 1 403.458 4 0.512 0 11.872 7
CFTR 25 0.124 3 10.880 0 87.550 3 0.443 5 15.289 9
ITGB3 25 0.099 3 5.920 0 797.061 9 0.479 1 10.022 6
MPO 24 0.088 5 7.250 0 711.857 2 0.490 1 11.493 2
ITGB1 24 0.129 3 11.000 0 181.183 0 0.474 5 12.803 4
ESR1 23 0.120 2 10.956 5 187.399 7 0.473 0 13.924 6
NOS2 22 0.126 8 12.181 9 67.957 3 0.455 7 14.530 2
ABCG2 20 0.118 6 10.900 0 75.007 2 0.444 8 12.272 0
ERBB2 20 0.112 8 10.600 0 58.473 6 0.447 4 12.617 4
JAK2 20 0.096 9 8.000 0 415.138 9 0.447 4 9.585 0
PIK3R1 20 0.074 2 6.900 0 1 391.388 7 0.488 5 11.206 4
GO功能富集分析主要将靶点根据生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)等进行归类,以对所分析的靶点进行注释和分类。本研究对筛选后的前10个条目进行可视化分析(图6)发现,BP主要与细胞凋亡过程负调控(negative regulation of apoptotic process)、蛋白激酶B信号正调控(positive regulation of protein kinase B signaling)、一氧化氮生物合成过程正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、丝裂原活化蛋白激酶活性正调控(positive regulation of MAP kinase activity)以及蛋白质自身磷酸化(protein autophosphorylation)等有关;CC主要与细胞质(cytoplasm)、细胞溶质(cytosol)、细胞核(nucleus)及质膜(plasma membrane)等有关;MF主要与蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)和一氧化氮合酶调节活性(nitric-oxide synthase regulator activity)等有关。
图6 GO功能富集分析

BP:生物过程 biological process;CC:细胞组分 cell component;MF:分子功能 molecular function。

Fig.6 GO functional enrichment analysis

2.5 辣木叶活性成分-肠炎靶点-信号通路网络可视化

利用Cytoscape软件将靶点和前20条KEGG富集信号通路进行可视化分析,结果见图7。图中绿色菱形表示辣木叶水溶性活性成分,红色圆形表示潜在关键靶点,蓝色方形表示活性成分发挥治疗肠炎作用涉及的信号通路,边表示相互关联。由图可以看出,22个辣木叶活性成分主要经23个关键作用靶点依靠20条相关信号通路,通过复杂的相互作用网络关系发挥治疗肠炎的作用,其中芥子酸和niazimin A在发挥治疗肠炎作用中涉及到的关键靶点最多,相关靶点中EGFR、MMP9、RELA原癌基因核因子-κB亚基(RELA)、SRC、AKT1、核因子-κB亚基1(NFKB1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、Toll样受体4(TLR4)、HSP90AA1、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和CREB结合蛋白(CREBBP)等参与治疗肠炎的关联度最大。此外,由图7还发现同一种活性成分可于多个靶点相互联系,同一个靶点则对应于多种活性成分,提示辣木叶活性成分在治疗肠炎作用中呈现多成分和多靶点的特点。
图7 辣木叶活性成分-肠炎靶点-信号通路网络图

Fig.7 Active components of Moringa oleifera leaves-enteritis targets-signaling pathways network diagram

2.6 辣木叶活性成分与靶蛋白的分子对接

以网络分析图中degree值排名前2的辣木叶活性成分为配体,PPI网络图中degree值排名前4的靶蛋白为受体分别进行分子对接,即配体为芥子酸、niazimin A,受体为SRC、EGFR、MMP9和AKT1,分子对接结果见表2和图8。结合自由能为粒子从自由状态成为复合粒子时所释放的能量,即结合自由能越小,提示2个分子在自然状态下更容易结合,且稳定性越高。对接结果显示,辣木叶中的芥子酸、niazimin A与受体蛋白SRC、EGFR、MMP9和AKT1的结合能均小于-5.5 kcal/mol(1 kcal≈4.186 kJ),其中niazimin A与3个蛋白的结合能均为最小值,提示niazimin A与上述靶点之间的相互作用可能为辣木叶治疗肠炎的主要作用机制。
表4 辣木叶活性成分与核心靶点分子对接结果

Table 4 Molecular docking results of core targets with active components of Moringa oleifera leaves

项目
Items		 结合自由能Binding free energy/(kcal/mol)
SRC原癌基因非受体
酪氨酸激酶
SRC		 表皮生长因子受体
EGFR		 基质金属蛋白酶9
MMP9		 蛋白激酶B
AKT1
芥子酸Sinapic acid -5.5 -6.2 -5.9 -6.0
niazimin A -7.2 -6.6 -6.0 -7.1

1 kcal≈4.186 kJ。

图8 芥子酸和niazimin A与核心靶点最佳构象相互作用模式图

Fig.8 Mode diagram of optimal conformational interaction for between sinapic acid and niazimin A with core targets

3 讨论

辣木叶在印度传统医学中主要用于消炎止痛药物[5-6]。近年来研究发现,辣木叶水提物被认为也可以缓解胃肠道疾病。本研究通过采用网络药理学技术筛选出芥子酸、niazimin A、山奈酚、槲皮素及柚皮素等在内的31种辣木叶水溶性活性成分,通过构建辣木叶干预肠炎相关靶点PPI网络,并经网络拓扑参数筛选到辣木叶干预肠炎的35个关键靶点,提示辣木叶治疗肠炎具有多成分和多靶点的特点。此外,本研究继续选择评分前2位的活性成分即芥子酸和niazimin A与前4位的核心靶点即SRC、EGFR、MMP9和AKT1进行分子对接,结果也显示这些活性成分可与核心靶点进行稳定结合,提示辣木叶水溶性活性成分治疗肠炎作用可能与这些靶蛋白密切相关。
对辣木叶31种水溶性活性成分筛选得知,芥子酸、niazimin A、山奈酚和槲皮素等可能是发挥抗肠炎的主要物质。其中,芥子酸具有较强的抗炎活性,研究发现其可通过上调细胞内紧密连接相关因子的转录水平而缓解由脂多糖(LPS)诱导的Caco-2细胞高通透性[12]。辣木中提取的niazimin A与血管紧张素转化酶(ACE)具有较高结合亲和力,可阻断ACE活性位点,具有有效的抗氧化、抗癌、降压、保肝和营养作用[13]。山奈酚具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种生物活性,高摄入山奈酚可有效降低炎性肠病[14]。此外,大量研究证实,山奈酚在各种炎症模型中可通过阻断核因子-κB(NF-κB)信号通路,抑制p65亚基移位入核,抑制炎症因子的表达,缓解炎症症状[15]。槲皮素作为辣木叶的主要黄酮类成分,具有较强的抗炎活性,是一种长效的抗炎物质[16-17]。本研究所筛选出的多种关键活性成分均具有抗炎活性,且与前人的临床研究结果相一致,这充分说明辣木叶可通过多种成分发挥治疗肠炎的作用。
本研究结果表明,辣木叶治疗肠炎的关键靶点为SRC、EGFR、MMP9、AKT1、PTGS2和HSP90AA1等,这些靶点均与细菌、病毒感染及炎症的发生密切相关。肠道发生疾病时SRC常常高表达。研究证实,SRC可以通过超激活EGFR介导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的抗调亡信号通路,抑制SRC的活性可以降低表皮生长因子(EGF)及TNF-α诱导细胞运动的能力[18]。研究发现,SRC还可通过TNF-α诱导AKT的活化,并间接影响NF-κB的活性。此外,研究发现,SRC可以通过促进细胞增生,抑制细胞凋亡来修复炎症介导的肠道黏膜损伤;也可以通过激活相关炎性通路,继而促进炎性介质的释放,进而诱导炎性细胞的归巢与活化,从而促进炎症的发生与发展[19]。由此推测出,辣木叶中的活性成分可通过与SRC、AKT1阻断细胞凋亡从而发挥抗炎作用。岳星男等[20]研究显示,辣木叶和大黄均可通过上调便秘小鼠结肠AKT1、丝裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)基因表达量,降低水通道蛋白3(AQP3)蛋白表达量,从而发挥通便抗炎药效;孙丽平等[21]研究发现,辣木叶提取物可通过降低光老化皮肤中的MMP9、基质金属蛋白酶3(MMP3)和基质金属蛋白酶1(MMP1)含量,有效改善皮肤组织形态和胶原结构,推测与提取物的抗氧化和抗炎活性相关。将辣木生物碱提取物注入癌细胞后,可有效抑制EGFR并延缓癌细胞的生长。沙子珺等[11]研究显示,辣木叶潜在活性成分可抑制高脂血症代谢性炎症,糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、凝血酶原(F2)、AKT1、RELA和丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1(SERPINE1)可能为其关键靶点。也有研究发现,辣木叶可通过下调结肠组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α等促炎介质,缓解小鼠结肠癌变[22];其水提取物可以减轻TNF-α对肠道器官的损伤,降低炎性因子基因的表达,抑制肠道干细胞的过度增殖;还可以通过抗氧化作用缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的大鼠结肠炎[23-24];进一步研究发现,其抗炎功效与富含的多酚和黄酮类活性成分相关[24-25],这些活性成分可通过抑制NF-κB、p38 MAPK等信号通路抑制炎症进展[24,26-27]。此外,其醇提物可通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路缓解机体氧化应激,保护二氧化钛诱导的肾毒性炎症[28];辣木油脂和β-谷甾醇可通过抑制NOD样受体蛋白3(NLRP3)的过度活化改善LPS所致的小鼠肠道炎症[29-30]。
GO功能富集分析表明,辣木叶发挥抗炎作用主要靶点是通过细胞凋亡过程负调控、蛋白激酶B信号正调控、一氧化氮生物合成过程正调控、丝裂原活化蛋白激酶活性正调控以及蛋白质自身磷酸化等途径。KEGG信号通路富集分析结果显示PI3K-AKT、TLR、TNF、MAPK、NOD样受体、白细胞介素-17(IL-17)及NF-κB等信号传导通路为辣木叶发挥治疗肠炎所参与的重要信号通路。而活性成分-肠炎靶点-信号通路网络可视化图中关联度比较可以得知,EGFR、MMP9、MAKP8、AKT1、RELA和SRC等可能是辣木叶治疗肠炎的关键核心靶点。此结果与相关靶点所具有的功能相一致。有研究显示,辣木叶多糖可通过作用于NF-κB信号传导通路发挥其抗炎作用,深入研究发现,其通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α mRNA的表达,继而影响机体促炎细胞因子和炎性介质的释放[31]。Kooltheat等[32]在体外模型中证明,辣木叶水-甲醇提取物抑制人巨噬细胞的TNF、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的产生,数据显示该提取物能抑制NF-κB信号中关键基因RELA的表达。IL-17作为一种重要的促炎细胞因子,可诱导细胞增殖分化和生物因子转录表达,还参与抗感染和多种消化道炎症性过程。张幸怡等[33]研究发现,给SD大鼠饲喂辣木叶粉可显著提高血液及肝脏组织中白细胞介素-10(IL-10)表达,显著降低IL-1β、IL-6和IL-17含量。Ma等[34]对辣木种子中提取的烟碱、丸香苷A和谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷进行体内外研究发现,这3种化合物可抑制IL-17A mRNA的表达。一氧化氮作为机体一种作用广泛性质独特的信号传递因子,在机体神经细胞系统、免疫系统等方面具有关键性作用。Araújo等[35]用辣木籽提取物进行体内和体外的抗炎试验发现,其可缓解由LPS诱导的巨噬细胞的炎性刺激,并减轻小鼠体内急性炎症症状,进一步研究发现可能是通过调节细胞因子和一氧化氮的合成量达到抗炎效果。Waterman等[36]在辣木叶中分离出的2种异硫氰酸酯可减弱iNOS和IL-1β的表达并降低一氧化氮和TNF-α的生成。由此可见,辣木提取物对炎症反应具有显著的抑制功效。
辣木及其提取物多在人源消炎止痛中应用,然而在畜禽中的临床应用并未见报道。在当前畜禽多种养殖模式并存的背景下,由多样应激、病原菌等导致的畜禽肠道炎症多发,以抗生素等为主的治疗药物,带来的毒副作用较为明显,不仅影响畜牧业发展,而且不利于人类健康。因此,开发新型健康药物缓解家禽肠道炎症,改善肠道健康,是保障畜禽高效生产及养殖获利的研究热点,也是绿色养殖的重点研究领域。
本研究结果发现,辣木叶水溶性活性成分包括:芥子酸、肉桂酸、山奈酚、槲皮素及柚皮素等,进一步分析发现关键活性成分可能通过SRC、EGFR、MMP9、AKT1、PTGS2及HSP90AA1等靶点起到治疗肠炎的作用,而这些关键蛋白在畜禽体内同样也与机体细菌、病毒感染及炎症发生和肠道功能息息相关;如在猪肠道功能的研究发现,次级胆汁酸可以通过EGFR-SRC通路调控肠道上皮细胞屏障功能[37],MMP9作为猪宿主基因与猪生长形状和腹泻相关。宿主SRC可影响鸡传染性喉气管炎病毒感染,参与炎症和细胞凋亡进程;抗生素可以通过抑制PI3K-AKT信号通路而缓解鸡白痢沙门菌感染导致的肉仔鸡肠道损伤[38]。因此,本研究结果为辣木叶提物在畜禽肠道炎症疾病治疗提供了一种新思路,同时为进一步阐明辣木叶在治疗畜禽肠炎作用中的作用机制提供了一定的参考价值。

4 结论

本研究通过网络药理学与分子对接技术预测了辣木叶水溶性活性成分干预肠炎作用的关键途径,得到了芥子酸、niazimin A和山奈酚等31种辣木叶主要活性成分,获得了SRC、EGFR、MMP9、AKT1、PTGS2和HSP90AA1等辣木叶治疗肠炎的关键靶点,同时富集了包括PI3K-AKT、TLR、TNF、MAPK和NOD样受体等相关的多种信号通路,并通过EGFR、MMP9、RELA、SRC、AKT1、NFKB1、MAPK8、TLR4、HSP90AA1、STAT3、VEGFA和CREBBP等起到治疗肠炎的作用。

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