动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 199 - 209

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.019

研究论文

槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能和盲肠菌群的影响

  • 付连港 , 1 ,
  • 刘伊笑 1 ,
  • 赵剑 2 ,
  • 石玉祥 1 ,
  • 刘华 3 ,
  • 刘秀斌 3 ,
  • 宋伟光 , 4, 5, * ,
  • 曾建国 , 1, 6, *
展开
  • 1 河北工程大学生命科学与食品工程学院,邯郸 056038
  • 2 晨光生物科技集团股份有限公司,邯郸 057250
  • 3 湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128
  • 4 河北植物提取创新中心有限公司,邯郸 057250
  • 5 河北省植物源动物保健品技术创新中心,邯郸 057250
  • 6 湖南农业大学动物医学院,长沙 410128
* 宋伟光,高级工程师,E-mail: ;
曾建国,教授,硕士生导师,E-mail:

付连港(1997—),男,山东滨州人,硕士研究生,从事植物提取物饲料添加剂开发研究。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-06-02

  网络出版日期: 2024-01-12

基金资助

河北省省级科技计划资助(215A2801D)

收起

Effects of Quercetagetin on Growth Performance, Antioxidant Capacity, Immune Function and Cecal Microflora of Weaned Piglets

  • FU Liangang , 1 ,
  • LIU Yixiao 1 ,
  • ZHAO Jian 2 ,
  • SHI Yuxiang 1 ,
  • LIU Hua 3 ,
  • LIU Xiubin 3 ,
  • SONG Weiguang , 4, 5, * ,
  • ZENG Jianguo , 1, 6, *
Expand
  • 1 College of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China
  • 2 Chenguang Biotech Group Co., Ltd., Handan 057250, China
  • 3 College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
  • 4 Hebei Plant Extraction Innovation Center Co., Ltd., Handan 057250, China
  • 5 Hebei Province Plant Source Animal Health Products Technology Innovation Center, Handan 057250, China
  • 6 College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
* SONG Weiguang, senior engineer, E-mail: ;
ZENG Jianguo, professor, E-mail:

Received date: 2023-06-02

  Online published: 2024-01-12

Fold

摘要

本试验旨在研究饲粮中添加槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能和盲肠菌群的影响。选取144头平均体重为(10.40±1.97) kg的28日龄断奶仔猪,随机分为4组,每组6个重复,每个重复6头猪(公母各占1/2)。在4组仔猪的基础饲粮中分别添加0(对照组)、150(试验Ⅰ组)、300(试验Ⅱ组)和450 mg/kg(试验Ⅲ组)槲皮万寿菊素,饲养31 d,其中预试期3 d,正试期为28 d。试验结束后,计算正试期内的平均日增重、平均日采食量、料重比和腹泻率;每组选取4头仔猪屠宰取样,测定十二指肠抗氧化酶活性和分泌型免疫球蛋白含量、血清免疫球蛋白和细胞因子含量以及盲肠菌群组成。结果显示:与对照组相比,饲粮添加不同水平槲皮万寿菊素对断奶仔猪的生长性能均未产生显著影响(P>0.05),但添加300 mg/kg槲皮万寿菊素能显著降低腹泻率(P<0.05),显著提高十二肠道中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性和分泌型免疫球蛋白含量(P<0.05),显著降低血清中白细胞介素-2和肿瘤坏死因子-α含量(P<0.05),且有降低盲肠菌群中变形菌门相对丰度的趋势(P=0.074)。由此可见,饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素可提高断奶仔猪的抗氧化能力和免疫功能,降低盲肠中有害菌群的比例,进而降低腹泻率,维持肠道健康。

关键词： 槲皮万寿菊素; 断奶仔猪; 生长性能; 抗氧化; 免疫; 盲肠菌群

本文引用格式

付连港 , 刘伊笑 , 赵剑 , 石玉祥 , 刘华 , 刘秀斌 , 宋伟光 , 曾建国 . 槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能和盲肠菌群的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(1) : 199 -209 . DOI: 10.12418/CJAN2024.019

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of dietary supplemented with quercetagetin on growth performance, antioxidant capacity, immune function and cecal microflora of weaned piglets. One hundred and forty-four weaned piglets at 28 days of age and with the average body weight of (10.40±1.97) kg were selected and divided into four groups with six replicates per group and six pigs (half male and half female) per replicate. The diets of the four groups were supplemented with 0 (control group), 150 (test group Ⅰ), 300 (test group Ⅱ) and 450 mg/kg (test group Ⅲ) of quercetagetin based on a basal diet, respectively. Piglets were fed for 31 days, with a pre-test period of 3 days and a trial period of 28 days. The average daily gain, average daily feed intake, feed to gain ratio and diarrhea rate were calculated at the end of the trial; four piglets of each group were slaughtered and sampled for the determination of duodenal antioxidant enzyme activities and secreted immunoglobulin (sIgA) content, serum immunoglobulin and cytokine contents, and the composition of cecal microflora. The results showed that dietary supplemented with different levels of quercetagetin had no significant effects on the growth performance of weaned piglets compared with control group (P<0.05), but the supplementation of quercetagetin at 300 mg/kg could significantly reduce the diarrhea rate (P<0.05), significantly increase the duodenal catalase, superoxide dismutase activities and sIgA content (P<0.05), significantly reduce the serum interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) contents (P<0.05), and tend to decrease the relative abundance of Proteobacteria in cecal flora (P=0.094). It can be seen that the supplementation of quercetagetin at 300 mg/kg can improve the antioxidant capacity and immune function of weaned piglets, reduce the proportion of harmful bacteria in cecum, and then reduce the diarrhea rate and maintain intestinal health.

Key words： quercetagetin; weaned piglets; growth performance; antioxidant; immune; cecal microflora

仔猪断奶应激是养猪生产上普遍存在的问题,是由于母仔分离及食物状态改变造成的。断奶应激破坏仔猪肠道形态和屏障功能的完整性,扰乱肠上皮细胞增殖和凋亡的平衡,降低消化酶的分泌,影响肠道菌群的多样性[1]。断奶应激还会提高仔猪机体氧化活动,释放过量的活性氧自由基,合成和释放促炎因子,进一步损伤肠道的结构和功能[2]。已有研究显示,植物提取物具有抗氧化、抗炎和抑菌作用,对仔猪断奶应激的改善能起到有益效果[3]。槲皮素(quercetin),也称作五羟黄酮,是一种多羟基黄酮类化合物,因具有抗氧化应激和维护上皮细胞屏障功能,可用于改善断奶仔猪肠道抗氧化能力[4]。槲皮万寿菊素(quercetagetin)是从万寿菊中提取的黄酮类化合物,其分子结构比槲皮素在A环上多1个羟基[5](图1),因此被认为具有更好的清除氧自由基的能力[6]。研究表明,无论是体内还是体外,槲皮万寿菊素都有着较强的抗氧化能力[7-8]。因此,本试验通过在饲粮中添加不同水平的槲皮万寿菊素,研究其对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫功能和肠道菌群的影响,以期为槲皮万寿菊素在仔猪生产中的应用提供参考。
图1 槲皮万寿菊素和槲皮素的分子结构

Fig.1 Molecular structure of quercetagetin and quercetin[5]

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验中使用的槲皮万寿菊素(有效成分含量>80%)由河北某生物科技有限公司提供,其提取方法参见中国专利《一种快速高效地提取叶黄素和槲皮万寿菊素的工业化方法》(专利号CN201910397773.0)。

1.2 试验设计

选取144头28日龄的三元杂断奶仔猪,平均体重(10.40±1.97) kg,随机分成4组,每组6个重复,每个重复6头猪,公母各占1/2。采用单因素试验设计,各组饲粮中槲皮万寿菊素添加量分别为0(对照组)、150(试验Ⅰ组)、300(试验Ⅱ组)和450 mg/kg(试验Ⅲ组)。饲养试验时间共计31 d,其中预试期3 d,正试期为28 d。基础饲粮为玉米-豆粕型粉状饲料,营养水平参考NRC(2012)猪营养需要设计,其组成及营养水平见表1。饲粮中粗蛋白质、氨基酸、总磷和钙含量均按照对应的国标方法测定。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

原料Ingredients 含量Content 营养水平Nutrient levels2) 含量Content
玉米Corn 60 消化能DE/(MJ/kg) 14.43
鱼粉Fish meal 1 粗蛋白质CP 17.60
豆粕Soybean meal 19 赖氨酸Lys 1.42
膨化大豆Expanded soybean 8 蛋氨酸Met 0.33
乳清粉Whey powder 6 苏氨酸Thr 0.85
磷酸氢钙CaHPO4 1 色氨酸Trp 0.25
预混料Premix1) 5 总磷TP 0.62
合计Total 100 钙Ca 0.80

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provides the following per kg of the diet:VA 12 000 IU,VD 6 000 IU,VE 800 IU,VB1 35 mg,VB2 20 mg,VB3 200 mg,VB6 35 mg,VB12 0.1 mg,叶酸 folic acid 1.5 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 50 mg,氯化胆碱 choline chloride 1 g,Fe 90 mg,Cu 20 mg,Zn 80 mg,Mn 40 mg,Se 0.3 mg,I 0.4 mg。

2)消化能根据NRC(2012)计算得出,其余营养水平均为实测值。DE is calculated according to NRC(2012), while other nutrient levels are all measured values.

1.3 饲养管理

试验期间每天定时饲喂3次(08:00、12:00和18:00),仔猪自由采食和饮水。猪舍温度在断奶后第1周保持在32 ℃左右,第2周保持在30 ℃左右,之后保持在不低于28 ℃,每日清扫和定时通风。

1.4 样品采集与方法

正式试验开始时每头仔猪空腹称重并打耳标。试验结束时每头仔猪空腹称重后,每组选取4只体重接近该组平均体重的仔猪,用三氯甲烷麻醉后从前腔静脉采血,待血液凝固后放置于冰盒,析出血清后离心分离血清,-80 ℃保存备用;采血后将仔猪放血致死,剖开腹腔剪开一段十二指肠,用载玻片轻柔刮下黏膜层组织,-80 ℃保存备用;迅速结扎取下盲肠,并在无菌条件下将盲肠内容物取出放入灭菌的2 mL离心管中,在液氮中迅速冷冻后置于-80 ℃保存备用。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 生长性能和腹泻率

在正式试验开始和结束时每头仔猪空腹称重,并以重复为单位每日结算耗料量,按如下公式计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G):

平均日增重(g/d)=总增重/(各重复头数×试验天数);

平均日采食量(g/d)=总耗料量/(各重复头数×试验天数);

料重比=总耗料量/总增重。

正式试验期间每天统计各重复内仔猪腹泻情况,以成形的团块状、长条状为正常粪便标准,水样便、血便及油样粪便为腹泻粪便标准,按如下公式计算腹泻率[9]:

腹泻率(%)=[各重复腹泻头数总和/(各重复头数×试验天数)]×100。

1.5.2 十二指肠中抗氧化酶活性和分泌型免疫球蛋白(sIgA)含量

将解冻后的十二指肠黏膜组织匀浆后,使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和sIgA含量。以上指标测定所用试剂盒均为上海酶联生物科技有限公司生产,测定步骤按照试剂盒说明书操作。

1.5.3 血清中免疫球蛋白和细胞因子含量

血清样品解冻后,使用ELISA法测定其中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)含量。以上指标测定所用试剂盒为上海酶联生物科技有限公司生产,测定步骤按照试剂盒说明书操作。

1.5.4 盲肠菌群组成

将采集好的盲肠内容物样品经干冰运送至青岛百迈客生物科技有限公司进行菌群结构检测。微生物多样性分析包括以下操作:从原始数据中导出CCS序列,对CCS序列进行Barcode识别,长度过滤,去除嵌合体,得到Effective CCS;将Effective CCS序列进行聚类/去噪,划分操作分类单元(OTU)/扩增子序列变体(ASV)(后面统一称之为Feature),并根据Feature的序列组成得到其物种分类;基于特征分析结果,对样品在各个分类水平上进行分类学分析;通过alpha多样性分析研究单个样本内部的物种多样性,统计各样本的Ace指数、Chao1指数、Shannon指数及Simpson指数,绘制稀释曲线;通过beta多样性分析来比较不同样本在物种多样性方面(群落组成及结构)存在的差异大小,使用QIIME软件进行beta多样性分析,使用R语言工具绘制主成分分析(PCA)图和主坐标分析(PCoA)图;在门水平层面,通过组间差异显著性分析,进一步衡量不同样本间的物种丰度组成差异。

1.6 数据统计与分析

使用SPSS 21.0软件中的单因素方差分析程序进行方差分析,P<0.05视为显著差异,差异显著时采用LSD法进行组间多重比较。试验结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

由表2可知,与对照组相比,饲粮中添加150、300或450 mg/kg槲皮万寿菊素对断奶仔猪的平均日增重、平均日采食量和料重比均未产生显著影响(P>0.05),但添加300或450 mg/kg槲皮万寿菊素显著降低了断奶仔猪的腹泻率(P<0.05)。
表2 槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

Table 2 Effects of quercetagetin on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
平均日增重ADG/(g/d) 454.87±81.83 469.33±63.72 461.60±77.34 462.22±69.46 0.939
平均日采食量ADFI/(g/d) 979.03±190.15 1 006.50±173.23 993.84±138.06 985.69±173.35 0.961
料重比F/G 2.16±0.18 2.17±0.22 2.16±0.22 2.15±0.14 0.999
腹泻率Diarrhea rate/% 10.42±2.98a 10.72±1.61a 3.87±1.24b 3.43±1.90b <0.001

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Data with different letter superscripts in the same row indicate significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 槲皮万寿菊素对断奶仔猪十二指肠中抗氧化酶活性的影响

由表3可知,与对照组相比,饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素显著提高了十二指肠中CAT和SOD活性(P<0.05),添加150mg/kg槲皮万寿菊素显著提高了十二指肠中CAT活性(P<0.05),而添加450 mg/kg槲皮万寿菊素对十二指肠中GSH-Px、CAT和SOD活性均没有产生显著影响(P>0.05)。
表3 槲皮万寿菊素对断奶仔猪十二指肠中抗氧化酶活性的影响

Table 3 Effects of quercetagetin on antioxidant enzyme activities in duodenum of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
过氧化氢酶
CAT/[μmol/(min·g鲜重)]		 53.97±12.64b 75.83±2.70a 75.44±10.93a 64.11±8.28ab 0.027
超氧化物歧化酶
SOD/(U/g鲜重)		 303.64±25.30bc 324.03±12.43ab 341.99±11.94a 296.72±14.24c 0.010
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/[nmol/(min·g鲜重)]		 130.74±8.99 139.89±6.77 140.37±5.12 142.52±14.65 0.356

2.3 槲皮万寿菊素对断奶仔猪血清和十二指肠中免疫球蛋白含量的影响

由表4可知,与对照组相比,饲粮中添加150、300或450 mg/kg槲皮万寿菊素均显著提高了十二指肠中sIgA含量(P<0.05),但只有添加150mg/kg槲皮万寿菊素显著提高了血清中IgA含量(P<0.05),添加300或450 mg/kg槲皮万寿菊素则显著降低了血清中IgA含量(P<0.05);此外,饲粮中添加150、300或450 mg/kg槲皮万寿菊素对血清中IgM和IgG含量均没有显著影响(P>0.05)。
表4 槲皮万寿菊素对断奶仔猪血清和十二指肠中免疫球蛋白含量的影响

Table 4 Effects of quercetagetin on immunoglobulin contents in duodenum and serum of weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
血清Serum
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL) 138.25±5.55a 137.38±9.48ab 123.59±4.99c 128.21±2.61bc 0.014
免疫球蛋白M IgM/(mg/mL) 3.27±0.19 3.19±0.20 3.19±0.20 2.98±0.20 0.093
免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) 4.71±0.46 4.69±0.67 4.03±0.10 4.25±0.31 0.126
十二指肠Duodenum/(μg/mL)
分泌型免疫球蛋白A sIgA 35.36±2.40c 37.25±2.25b 41.27±4.58ab 42.50±2.26a 0.020

2.4 槲皮万寿菊素对断奶仔猪血清中细胞因子含量的影响

由表5可知,与对照组相比,饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素显著降低了血清中IL-2和TNF-α含量(P<0.05),添加450 mg/kg槲皮万寿菊素显著降低了血清中TNF-α含量(P<0.05);此外,饲粮中添加150、300和450 mg/kg槲皮万寿菊素对血清中IL-6和TGF-β含量均无显著影响(P>0.05)。
表5 槲皮万寿菊素对断奶仔猪血清中细胞因子含量的影响

Table 5 Effects of quercetagetin on cytokine contents in serum of weaned pigletspg/mL

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
白细胞介素-2 IL-2 239.98±16.85a 236.79±15.13a 210.73±11.54b 225.83±7.17ab 0.035
白细胞介素-6 IL-6 879.81±85.68 900.00±44.02 914.10±51.80 857.69±57.55 0.608
肿瘤坏死因子-α TNF-α 165.23±1.55a 161.14±8.83ab 147.20±6.51b 130.76±16.72c 0.002
转化生长因子-β TGF-β 42.55±3.20 42.16±1.51 40.60±2.18 40.64±1.78 0.514

2.5 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠菌群的影响

由表6可知,试验Ⅱ组仔猪盲肠内容物中物种丰富度在门水平上显著低于试验Ⅰ组(P<0.05),仔猪盲肠内容物中物种丰富度在其他分类水平上各组间均无显著差异(P>0.05)。
表6 仔猪盲肠内容物各等级物种统计

Table 6 Statistics of species by grade of piglet cecal contents

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
界Kingdom 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 0.138
门Phylum 6.50±1.00ab 7.50±1.00b 5.75±0.50a 6.50±1.00ab 0.018
纲Class 9.50±1.00 10.25±0.96 9.00±0.82 9.75±0.96 0.105
目Order 22.25±2.22 24.75±1.71 22.75±4.11 22.50±3.00 0.281
科Family 44.50±4.12 50.50±1.73 46.00±6.83 46.75±5.91 0.144
属Genus 111.00±12.46 116.25±4.50 112.00±17.79 114.00±8.28 0.572
种Species 150.25±18.08 154.50±9.26 148.25±32.42 156.75±13.23 0.144

2.5.1 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物OTU数量的影响

图2显示了各组所共有的和特有的OTU,其中4个组共有的OTU数量是334个,对照组特有的OTU数量是4个,试验Ⅰ组特有的OTU数量是25个,试验Ⅱ组特有的OTU数量是34个,试验Ⅲ组特有的OTU数量是13个。上述结果显示试验Ⅱ组特有OTU最丰富,说明饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素可以增加断奶仔猪盲肠菌群丰富度。
图2 断奶仔猪盲肠微生物的OTU维恩图

维恩图中不同椭圆的颜色代表不同的组,重叠部分代表组间共有的OTU数量,非重叠部分是该组特有的OTU数量。C:对照组;Ⅰ:试验Ⅰ组;Ⅱ:试验Ⅱ组;Ⅲ:试验Ⅲ组。下图同。

Fig.2 Venn diagram of OTU of cecal microorganisms in weaned piglets

The colors of different ellipses in Venn diagram represent different groups, the overlapping parts represent the number of OTU shared by the groups, and the non-overlapping parts represent the number of OTU unique to the groups. C: control group; Ⅰ: test group Ⅰ; Ⅱ: test group Ⅱ; Ⅲ: test group Ⅲ. The same as below.

图3是基于Shannon指数绘制的稀释曲线,每条曲线代表1个样本,以用不同颜色标记,可反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。Shannon指数越大,则物种种类越多,物种越丰富;当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,已涵盖绝大多数的微生物物种信息,特征种类不会在随测序量增加而增长,可以进行结果分析。
图3 基于Shannon指数的稀释曲线

Fig.3 Dilution curve based on Shannon index

2.5.2 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物alpha多样性和beta多样性的影响

2.5.2.1 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物alpha多样性的影响

alpha多样性用于体现群落的丰富度和均匀度,常用的度量指数主要包括侧重于体现群落丰富度的Chao1指数和ACE指数,以及兼顾群落多样性和均匀度的Shannon指数和Simpson指数。如表7所示,各组ACE指数、Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数均无显著差异(P>0.05),但Simpson指数、Shannon指数均以试验Ⅱ组最高,说明饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素可以改善断奶仔猪肠道微生物多样性。此外,Coverage指数显示,各组样本文库的覆盖率均可达到99.5%。
表7 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物alpha多样性的影响

Table 7 Effects of quercetagetin on alpha diversity of cecal microorganisms in weaned piglets

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
ACE指数ACE index 336.14±65.67 349.58±45.30 330.39±120.20 327.51±54.45 0.714
Chao1指数Chao1 index 336.77±60.73 356.27±44.03 344.66±120.68 335.84±56.39 0.732
Simpson指数Simpson index 0.92±0.06 0.94±0.02 0.96±0.02 0.92±0.04 0.134
Shannon指数Shannon index 5.27±0.43 5.56±0.40 5.90±0.88 5.48±0.53 0.187
Coverage指数Coverage index 0.995±0.001 0.995±0.000 0.995±0.001 0.995±0.001 0.171

2.5.2.2 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物beta多样性的影响

beta多样性用于比较不同样本在物种多样性方面存在的相似程度。PCA是一种分析和简化数据集的技术,通过将方差进行分解,坐标轴取能够最大反映方差的2个特征值,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,2个样本距离越近,则表示这2个样本的组成越相似。PCA图(图4)显示,试验Ⅱ组内聚性较好,且对照组与其他组间距离较远,说明同组的微生物群落组成相似,分类效果较好,且添加槲皮万寿菊素组与未添加槲皮万寿菊素组的样本组成有差异。PCoA是一种与PCA类似的降维排序方法,原理是假设对n个样品有衡量它们之间差异或距离的数据,就可以用此方法找出一个直角坐标系,将n个样品表示成n个点,而使点间的欧式距离的平方正好等于原来的差异数据,实现定性数据的定量转换,从多维数据中提取出最主要的元素和结构。通过PCoA可以实现多个样本的分类,进一步展示样本间物种多样性差异,坐标图上距离越近的样本,相似性越大。PCoA图(图5)显示,对照组和试验Ⅰ组坐标距离较近,与试验Ⅱ、Ⅲ组距离较远,表明饲粮中添加300或450 mg/kg槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物组成产生了影响。
图4 PCA图

Fig.4 PCA diagram

图5 PCoA图

Fig.5 PCoA diagram

2.5.3 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠菌群门水平上组成的影响

图6显示了断奶仔猪盲肠中在门水平上相对丰度大于0.001%的菌群,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、弯曲杆菌门(Campylobacterota)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)作为断奶仔猪盲肠中的优势菌门,占菌群分类的99%以上。由表8可知,与对照组相比,试验Ⅱ组变形菌门的相对丰度有降低趋势(P=0.094);其他菌门的相对丰度各组间均无显著差异(P>0.05)。
图6 断奶仔猪盲肠菌群门水平上物种分布柱状图

Fig.6 Histogram of species distribution of cecal microflora at phylum level in weaned piglets

表8 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠微生物门水平上相对丰度的影响

Table 8 Effects of quercetagetin on relative abundance of cecal microflora at phylum level in weaned piglets %

项目
Items		 对照组
Control group		 试验Ⅰ组
Test group Ⅰ		 试验Ⅱ组
Test group Ⅱ		 试验Ⅲ组
Test group Ⅲ		 P值
P-value
厚壁菌门Firmicutes 83.90±5.73 79.73±14.83 86.43±8.45 87.25±6.61 0.324
拟杆菌门Bacteroidetes 12.25±5.55 11.83±9.17 12.28±8.75 9.19±4.10 0.585
弯曲杆菌门Campylobacterota 0.11±0.19 6.39±12.65 0.21±0.42 1.48±2.91 0.228
变形菌门Proteobacteria 3.24±3.25 1.49±1.42 0.38±0.16 1.44±2.12 0.094
放线菌门Actinobacteria 0.37±0.37 0.36±0.27 0.46±0.72 0.48±0.41 0.642
螺旋体门Spirochaetes 0.10±0.06 0.15±0.10 0.22±0.27 0.14±0.12 0.330
蓝细菌门Cyanobacteria 0.04±0.03 0.05±0.04 0.01±0.01 0.01±0.01 0.122
迷踪菌门Elusimicrobia <0.001±0.000 0.003±0.004 <0.001±0.000 0.004±0.007 0.267
疣微菌门Verrucomicrobia <0.001±0.000 0.005±0.010 <0.001±0.000 <0.001±0.000 0.214

3 讨论

3.1 槲皮万寿菊素对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

腹泻是仔猪断奶应激最常见的症状[1]。梅华迪等[9]报道,在平均体重7.5 kg的断奶仔猪饲粮中添加200或400 mg/kg的槲皮素显著改善了断奶仔猪的生长性能,但对腹泻率没有显著影响。然而,张卫辉等[10]的研究发现,饲粮中添加200或400 mg/kg的槲皮素对平均体重9.5 kg的断奶仔猪的平均日增重和料重比没有显著影响,但能显著降低断奶仔猪的腹泻率。这些研究结果的差异与使用断奶仔猪的体重可能有很大关系。本研究发现,饲粮中添加不同水平的槲皮万寿菊素对体重10 kg左右的断奶仔猪的生长性能没有产生显著影响,但能显著降低腹泻率。本试验选用美系生长速度有优势的28日龄断奶仔猪,按照公母各占1/2的比例进行筛选称重,此时大部分仔猪体重在9~10 kg,公母之间体重有差异,断奶后1~3周仔猪所受应激比较大,易出现腹泻、疾病或者死亡出现。

3.2 槲皮万寿菊素对断奶仔猪抗氧化能力的影响

黄酮类化合物在机体内可保护和增强内源性抗氧化物质的活性,降低氧化应激的伤害[10]。Degroote等[4]报道,饲粮中添加100~900 mg/kg的槲皮素显著提高了断奶后5 d仔猪肝脏中谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性。对槲皮素的研究还发现,槲皮素可以促进谷胱甘肽合成,提高内源性抗氧化酶如铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、CAT和GSH-Px的活性[12];给断奶仔猪饲喂950 mg/kg的槲皮素提高了肠道总抗氧化能力和CAT活性[13];饲喂槲皮素还能提高人工感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)的仔猪肠道GSH-Px和CAT活性[14]。在肉鸡上的研究表明,饲喂槲皮万寿菊素能提高血清、肝脏、肌肉和肠黏膜中GSH-Px、SOD活性和总抗氧能力,其提高抗氧化能力是通过Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)调节核转录因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路来实现[15-16]。有关槲皮万寿菊素对仔猪抗氧化能力的影响还未见报道。本研究发现,饲粮添加150或300 mg/kg槲皮万寿菊素有利于提高断奶仔猪的抗氧化能力,而添加450 mg/kg槲皮万寿菊素则对抗氧化能力没有提高效果,说明大剂量的槲皮万寿菊素可能会抑制体内抗氧化酶的生成,其具体机制还不清楚,有待进一步研究。

3.3 槲皮万寿菊素对断奶仔猪免疫功能的影响

万寿菊属植物如万寿菊和孔雀草(法国万寿菊),在中医或欧洲民间医学中至今仍被用于治疗炎症相关疾病。万寿菊提取物中有多种黄酮及其苷类成分,如槲皮万寿菊素、槲皮素、山奈酚等,具有抗氧化、镇咳等药理作用[17]。郑婷等[18]对万寿菊的药性理论进行了完善,认为万寿菊性凉、味苦辛,有清热解毒、消肿散结、抗炎镇痛之效。万寿菊抗炎镇痛的效果在小鼠模型上已得到证实。曾益等[19]研究发现,使用万寿菊茎叶醇提取物能显著降低小鼠的疼痛阈值,显著降低血清中炎性细胞因子含量,并提高血清中抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的含量。国外对孔雀草的研究也得到了类似的结论。Chkhikvishvili等[20]从孔雀草提取物中鉴定出了槲皮万寿菊素、槲皮素、藤菊黄素等成分,能有效增加抗炎因子IL-10的生成。从作用机理上来看,槲皮万寿菊素对细胞因子表达的影响应与丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路有关。在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞中,甲氧基化的槲皮万寿菊素通过阻断核转录因子-κB(NF-κB)抑制因子α的磷酸化来降低NF-κB核移位,抑制了TNF-α等促炎因子的生成[21]。本研究发现,在饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素显著降低断奶仔猪血清中IL-2和TNF-α含量,添加450 mg/kg槲皮万寿菊素显著降低血清中TNF-α含量,表明饲粮中添加槲皮万寿菊素可以抑制断奶仔猪体内致炎因子的生成,对断奶仔猪机体免疫水平有提高作用。

3.4 槲皮万寿菊素对断奶仔猪盲肠菌群的影响

目前规模化育肥猪生产过程中最关键的时期就是断奶期,这与养猪场的经济效益有直接的关系。肠道是营养物质消化和吸收的主要场所,是抑制细菌和内毒素入侵的重要防线,是断奶仔猪应对应激的重要器官。断奶应激不仅与免疫系统和肠道屏障功能密切相关,而且可破坏氧化-抗氧化系统,诱导氧化应激。此外,断奶应激还会导致仔猪肠道菌群的生态失调,并进一步增加了仔猪发生胃肠道疾病的风险[1]。Saladrigas-García等[22]研究发现,断奶后的仔猪肠道菌群组成发生明显变化。本研究对各组所共有和特有的OTU数量进行了分析,其中4个组共有的OTU数量是334个,对照组特有OTU数量是4个,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组特有OTU数量分别为25、34、13个,该结果显示饲粮中添加不同水平的槲皮万寿菊素均可以提高断奶仔猪肠道微生物的丰富度,且以添加300 mg/kg槲皮万寿菊素的组特有OTU最丰富。本研究通过对断奶仔猪盲肠微生物alpha多样性进行分析,结果显示添加300 mg/kg槲皮万寿菊素组的Simpson指数、Shannon指数在4组之中最高,说明在断奶仔猪饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素可以改善肠道微生物多样性。此外,对各组样本进行了beta多样性分析,通过比较PCA坐标距离的远近,发现添加300 mg/kg槲皮万寿菊素组的内聚性最好,且与其他组距离较远,说明此组的微生物群落组成相似,分类效果较好。
肠道菌群在维持动物健康方面具有重要作用[23],在营养、消化、抗病和维生素与其他代谢物的合成中起着关键的调节作用[24]。黄酮类化合物在抗菌方面有着较强的作用,仔猪断奶期间受环境、营养等因素影响导致肠道菌群多样性会发生改变,造成肠道内致病菌的占比增加。有研究发现,槲皮素能显著降低肉鸡盲肠内细菌总数和致病菌数量[25]。Zhang等[26]的研究表明,淫羊藿提取物能够通过调控核心菌属改善肠道菌群组成。变形菌门是肠道菌群中主要的一门,包括很多的病原菌,如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等,其中的大肠杆菌、沙门氏菌等都有可能引起仔猪腹泻,该菌门相对丰度下降通常被认为有利于肠道健康。本研究发现,在饲粮中添加300 mg/kg槲皮万寿菊素后,断奶仔猪盲肠菌群中变形菌门、蓝细菌门的相对丰度有下降的趋势,厚壁菌门、拟杆菌门的相对丰度有增加的趋势。由此推测,槲皮万寿菊素可能通过改善断奶仔猪盲肠菌群的丰富度和降低有害菌群的比例来降低腹泻率,从而促进肠道的健康发展。

4 结论

综上可知,槲皮万寿菊素能够提高断奶仔猪的抗氧化能力和免疫功能,降低盲肠有害菌群的比例,进而降低腹泻率。综合来看,断奶仔猪饲粮中槲皮万寿菊素的适宜添加量为300 mg/kg。

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