动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 579 - 591

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.052

研究论文

响应面法优化超声波辅助提取公英散工艺参数及其抑菌和抗氧化性能研究

  • 何若萱 ,
  • 曹亚芹 ,
  • 王子越 ,
  • 孙阳 ,
  • 沈昊一 ,
  • 张思喆 ,
  • 高爽 ,
  • 童津津 ,
  • 姚华 ,
  • 张华 , *
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  • 北京农学院动物科学技术学院,北京 102206
* 张华,副教授,硕士生导师,E-mail:

何若萱(1999—),女,山东东营人,硕士研究生,从事兽用载中药纳米制剂的研发。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2023-07-13

  网络出版日期: 2024-01-12

基金资助

国家自然科学基金项目(32272904)

北京农学院研究生创新项目(5056516030/003)

收起

Study on Response Surface Method Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction Process Parameters for Gongying Powder and Its Antibacterial and Antioxidant Properties

  • HE Ruoxuan ,
  • CAO Yaqin ,
  • WANG Ziyue ,
  • SUN Yang ,
  • SHEN Haoyi ,
  • ZHANG Sizhe ,
  • GAO Shuang ,
  • TONG Jinjin ,
  • YAO Hua ,
  • ZHANG Hua , *
Expand
  • Animal Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2023-07-13

  Online published: 2024-01-12

Fold

摘要

本试验旨在通过响应面法优化超声波辅助提取公英散工艺参数,并对公英散水提物的体外抗氧化和抑菌活性进行测定。通过单因素试验确定各因素的取值范围,用Plackett-Burman设计并筛选出超声温度、超声时间、液料比3个显著影响公英散提取效率的因素,然后采用Box-Behnken响应面分析法得出最佳提取条件。通过微量肉汤稀释法和Kirby-Bauer纸片扩散法评价公英散水提物体外抑菌活性,采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法和羟自由基清除法研究公英散水提物体外抗氧化活性。结果表明:在超声波功率420 W、超声温度80 ℃、超声时间65 min、液料比37∶1时,公英散的提取效率最高。公英散水提物对3种奶牛乳房炎临床致病菌都有不同程度的体外抑制作用,对大肠杆菌(E. coli)的最低抑菌浓度(MIC)为9.00 mg/mL,最低杀菌浓度(MBC)为18.00 mg/mL;对无乳链球菌(S. agalactiae)的MIC为4.50 mg/mL,MBC为9.00 mg/mL;对金黄色葡萄球菌(S. aureus)的MIC为2.25 mg/mL,MBC为4.50 mg/mL。此外,当公英散水提物浓度达到1.00 mg/mL时,对羟自由基(78.70%)和DPPH自由基体外清除率(75.63%)良好。综上所述,本试验成功筛选出了公英散的最佳提取工艺条件,且所得公英散水提物有良好的体外抗氧化活性,并对3种奶牛乳房炎临床致病菌均有不同程度的体外抑菌活性。

关键词： 公英散; 超声波辅助提取; Plackett-Burman设计; 响应面分析; 抗氧化; 抑菌

本文引用格式

何若萱 , 曹亚芹 , 王子越 , 孙阳 , 沈昊一 , 张思喆 , 高爽 , 童津津 , 姚华 , 张华 . 响应面法优化超声波辅助提取公英散工艺参数及其抑菌和抗氧化性能研究[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(1) : 579 -591 . DOI: 10.12418/CJAN2024.052

Abstract

The purpose of this experiment was to optimize the process parameters of ultrasonic-assisted extraction of Gongying powder through response surface method, and to determine the in vitro antioxidant and antibacterial activity of aqueous extract of Gongying powder. The value range of each factor was determined by a single factor experiment, and three significant factors affecting the extraction rate of Gongying powder, such as ultrasonic temperature, ultrasonic time and ratio of liquid to material, were screened out by Plackett-Burman design, and then the optimum extraction conditions were obtained by Box-Behnken response surface analysis. The in vitro antibacterial activity was evaluated by microbroth dilution method and Kirby-Bauer disk diffusion method, and the in vitro antioxidant activity of aqueous extract of Gongying powder was investigated by 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) radical scavenging methodand hydroxyl radical scavenging method. The results showed that the extraction rate of Gongying powder was the highest when the ultrasonic power was 420 W, the ultrasonic temperature was 80 ℃, the ultrasonic time was 65 min and the ratio of liquid to material was 37∶1. The aqueous extract of Gongying powder had different inhibitory effects on three clinical pathogenic bacteria of dairy cow mastitis in vitro, the minimum inhibitory concentration (MIC) of Escherichia coli (E. coli) was 9.00 mg/mL, and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 18.00 mg/mL; the MIC of Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) was 4.50 mg/mL, and the MBC was 9.00 mg/mL; the MIC of Staphylococcus aureus (S. aureus) was 2.25 mg/mL, and the MBC was 4.50 mg/mL. In addition, when the concentration of aqueous extract of Gongying powder reached 1.00 mg/mL, it had good scavenging rates on hydroxyl radical (78.70%) and DPPH radical (75.63%) in vitro. In conclusion, the optimum extraction conditions of Gongying powder are successfully selected in this study, and the aqueous extract of Gongying powder has good in vitro antioxidant activity and different degrees of in vitro antibacterial activity against three clinical pathogenic bacteria of dairy cow mastitis.

Key words： Gongying powder; ultrasound-assisted extraction; Plackett-Burman design; response surface analysis; antioxidant; antibacterial

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最常见的疾病之一,可造成奶牛的产奶量下降、乳品质降低及治疗成本增加等问题,严重制约了包括我国在内的全球多国奶牛养殖业的快速发展[1⇓⇓-4]。微生物感染是引发奶牛乳房炎的重要原因之一,如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S. agalactiae)、牛支原体以及环境型病原菌大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)、肺炎克雷伯菌等,这些微生物通过乳头管进入乳房,引起乳房炎[5-6]。目前,抗生素的使用是最常见的一种奶牛乳房炎治疗手段,但容易造成细菌耐药性和抗生素残留等问题,不仅使其治疗难度增加,还给人类的公共卫生安全带来极大挑战[7-8]。因此,亟待开发更加绿色、安全的药物制剂来替代抗生素的使用,这对于奶牛健康养殖的发展具有重要意义。
公英散是《中华人民共和国兽药典》(2000年版第2部)中治疗乳痈的经典方剂,该方剂中蒲公英、金银花和连翘为寒性药材,具有清热解毒、疏散风热的功效[9⇓-11];后几味药材包括丝瓜络、通草、芙蓉叶和浙贝母,有通气下乳、消肿散结等功效[12⇓⇓-15]。研究发现,黄酮类、萜类、酚酸类是公英散中的重要成分,以绿原酸为代表的有机酸类是金银花发挥清热解毒、抑制细菌的主要成分;黄酮类、环烯醚萜类能有效抑制炎症类反应,但其多难溶于水[16-17]。然而,公英散水提物的体外药理作用尚不完全清楚,有待进一步研究。
从植物基质中提取目标分析物是鉴定和分析其功能活性的关键步骤,所采用的提取工艺效率和有效性对提取物成分的组成有很大影响。传统的提取方法包括浸渍、浸泡、煎煮和索氏提取法,这些方法通常耗时长,且需要大量的有机溶剂,所用提取温度较高,导致目标活性成分容易发生降解或氧化[18]。超声波提取是一种简单、廉价、环保和高效的提取方式,已成功应用于从各种植物基质中回收目标成分[19]。Box-Behnken响应面设计结合了数学和统计学技术,能够同时分析多个因素与响应指标之间的拟合关系,相比于传统的单因素分析方法更有效,并且有助于试验方案的开发、改进和优化[20]。
因此,本研究先通过单因素试验确定各因素的取值范围,进一步通过Plackett-Burman设计筛选出显著因素,再通过Box-Behnken响应面设计得到公英散的最佳提取条件,并测定公英散水提物的体外抑菌和抗氧化活性,从而为公英散水提物在奶牛乳房炎防治中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

植物材料:干燥的蒲公英、金银花、连翘、丝瓜络、通草、芙蓉叶、浙贝母等中药材,均购自北京同仁堂有限公司。化学试剂:甲醇、乙腈、甲酸为色谱级,其他化学试剂为分析级。

1.2 主要仪器

2500C粉碎机(东莞华太电器有限公司)、KQ-700DE超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)、WFJ7200可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

1.3 公英散提取流程和提取率判定

1.3.1 公英散的提取流程

用磨粉机将公英散的每味药材(一副公英散方剂含蒲公英60.0 g、金银花60.0 g、连翘60.0 g、丝瓜络30.0 g、通草25.0 g、芙蓉叶25.0 g、浙贝母30.0 g)粉碎成粉末,过80目筛密封保存备用。按公英散方剂的组成,准确称取每味药材的粉末混合制成公英散,用超纯水浸泡30 min并搅拌均匀,然后用超声波提取仪超声提取一定时间,将混合物冷却至室温,4 ℃、1 500 r/min条件下离心10 min。上清液经抽滤(0.45 μm微孔滤膜)获得滤液,于4 ℃保存备用,若制备成冻干粉末,可在-20 ℃长期保存。

1.3.2 公英散提取率的判定

通过前期研究发现,公英散中绿原酸含量较高,因此,以绿原酸得率高低为指标判定公英散提取率。参照罗娜等[21]的方法,准确称取绿原酸标准品2.00 mg于10.00 mL的60%甲醇中,然后进行10倍稀释即得20.00 μg/mL的标准品母液。分别吸取不同体积的母液,用60%甲醇定容,得到质量浓度分别为2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00 μg/mL的标准液,在329 nm处测吸光度,得到绿原酸的回归方程为:y=0.047 5x+0.002 7 (R2=0.99)。测量不同工艺条件下所得水提物的吸光度,然后按照公式[22-23]计算绿原酸得率:

绿原酸得率(%)=[N×V×(A-0.002 7)/0.047 5]/W。

式中:N是稀释倍数;V是比色皿中的溶液体积;W是一副公英散方剂的重量。

1.4 单因素试验

参照1.3.1提取流程,分别考察超声功率、时间、温度和液料比对绿原酸得率的影响,每次试验仅改变1个因素,并且保持其他因素不变(以液料比10∶1,超声功率490 W,温度80 ℃,时间30 min为基础条件)。各因素的考察范围:超声功率为280~560 W,时间为30~150 min,温度为20~80 ℃,液料比为10∶1~50∶1,每组试验重复3次。

1.5 Plackett-Burman试验

在1.4的基础上,设计n=12的Plackett-Burman试验对超声功率、时间、温度和液料比等因素的显著性,再分别进行考查,试验设计见表1,并运用Minitab 17软件进行数据的方差分析。
表1 Plackett-Burman试验因素和水平

Table 1 Plackett-Burman test factors and levels

因素
Factors		 水平Levels
-1 +1
超声温度Ultrasonic temperature/℃ (A) 50 80
超声时间Ultrasonic time/min (B) 30 90
液料比Liquid-material ratio (C) 20∶1 40∶1
超声功率Ultrasonic power/W (D) 350 490

1.6 Box-Behnken响应面优化试验

在1.5的基础上,采用Box-Behnken设计方法进行响应面优化,以确定超声时间、温度和液料比的最佳取值,使用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行方差分析,试验设计见表2。
表2 Box-Behnken响应面试验因素和水平

Table 2 Box-Behnken response surface test factors and levels

因素
Factors		 水平Levels
-1 0 +1
超声温度Ultrasonic temperature/℃(A) 50 65 80
超声时间Ultrasonic time/min (B) 30 60 90
液料比Liquid-material ratio (C) 20∶1 30∶1 40∶1

1.7 抗氧化试验

1.7.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除试验

参照文献[24]的方法,配制0.20~1.20 mg/mL的维生素C作为阳性对照,配制0.50~3.00 mg/mL的公英散水提物作为供试品,分别精密移取不同浓度样品(维生素C或公英散水提物)和DPPH无水乙醇溶液各1.00 mL于试管中混匀,然后在室温且避光条件下反应30 min,于517 nm波长下测量混合溶液的吸光度(AⅠ);用等体积的无水乙醇作为空白对照,重复上述操作,测定其吸光度(AⅢ);取样品溶液与等体积无水乙醇混合,重复上述操作,测定其吸光度(AⅡ),按下式计算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(AⅠ-AⅡ)/AⅢ]×100。

式中:AⅠ为样品吸光度;AⅡ为无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液的吸光度;AⅢ为空白对照吸光度。

1.7.2 羟自由基清除试验

参照文献[24]的水杨酸法,分别精密移取不同浓度样品(维生素C或公英散水提物)、硫酸亚铁溶液(9.00 mmol/L)、水杨酸-无水乙醇溶液(9.00 mmol/L)和过氧化氢溶液(8.80 mmol/L)各2.00 mL于试管中混匀,然后在37 ℃条件下反应30 min,于510 nm波长下测量混合溶液的吸光度(AⅠ);分别用去离子水代替样品提取液和过氧化氢溶液并测得溶液的吸光度(AⅡ和AⅢ),按下式计算羟自由基清除率:

羟自由基清除率(%)=[1-(AⅠ-AⅡ)/AⅢ]×100。

式中:AⅠ为样品吸光度;AⅡ为无过氧化氢溶液的吸光度;AⅢ为空白对照吸光度。

1.8 公英散水提物的体外抑菌试验

1.8.1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

采用微量肉汤稀释法对公英散水提物进行稀释,然后将0.10 mL稀释后的样品溶液(用0.22 μm的滤膜过滤除菌)加入培养基,使药液终浓度分别为36.00、18.00、9.00、4.50、2.25、1.13、0.56、0.28、0.14、0.07 mg/mL(公英散水提物冻干粉浓度),再加入0.10 mL待测菌悬液(终浓度约为5×105 CFU/mL),即E. coli(CVCC1450)、S. agalactiae (CVCC3940)或S. aureus(ATCC29740)等奶牛乳房炎临床菌株,再将药物-细菌混合液在37 ℃的保温箱中培养24 h。无明显细菌生长的最后一个清亮孔浓度为MIC,然后,取0.10 mL药物-细菌混合液接种到新鲜的固体培养基上,37 ℃培养24 h,无细菌生长的样品最低浓度被认为是MBC。在96孔板的前10个孔中依次加入配制好的不同浓度待测药液100 μL,再加入100 μL待测菌悬液(3×105~6×105 CFU/mL),后2个孔为阳性(0.20 mL菌悬液)和阴性(0.20 mL肉汤培养基)对照孔。将96孔板在37 ℃的温箱中培养24 h。无明显细菌生长的最后一个清亮孔浓度为MIC,滴在固体培养基上无细菌生长的最后一个孔浓度为MBC,每组试验重复3次。

1.8.2 抑菌圈直径的测定

采用Kirby-Bauer纸片扩散法,取0.10 mL的1×108 CFU/mL的待测菌悬液(E. coli、S. agalactiae或S. aureus)均匀涂布于MH(A)培养基上,然后贴附青霉素、头孢氨苄、万古霉素、庆大霉素等抗生素纸片(6.00 mm)和制备好的高浓度(144.00 mg/mL)、中浓度(72.00 mg/mL)、低浓度(36.00 mg/mL)、较低浓度(18.00 mg/mL)4个不同浓度的公英散纸片,在37 ℃下过夜培养18~24 h后测量抑菌圈直径。

1.9 统计分析方法

利用Minitab 17、Design-Expert 8.0.6、SPSS 26等统计学软件分析数据,差异显著性分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行,数据以平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声温度对绿原酸得率的影响

由图1可知,在其他条件不变时,超声温度由20 ℃上升到80 ℃过程中,在65 ℃时绿原酸得率最高,显著高于20、35、50、80 ℃时(P<0.05),所以选定65 ℃的超声温度为响应面的中心点。
图1 超声温度对绿原酸得率的影响

数据标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.1 Effects of ultrasonic temperature on chlorogenic acid yield (n=3)

Values with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.1.2 超声时间对绿原酸得率的影响

由图2可知,在其他条件不变时,超声时间在30~150 min变化,绿原酸得率先升高后降低,在60 min时最高,显著高于30、90、120、150 min时(P<0.05),所以选定60 min的超声时间为响应面的中心点。
图2 超声时间对绿原酸得率的影响

Fig.2 Effects of ultrasonic time on chlorogenic acid yield (n=3)

2.1.3 液料比对绿原酸得率的影响

由图3可知,在其他条件不变时,液料比在10∶1~50∶1变化,当液料比从10∶1上升至30∶1时,绿原酸得率随温度升高而增加,液料比为30∶1时绿原酸得率显著高于液料比为10∶1和20∶1时(P<0.05),与液料比为40∶1和50∶1时无显著差异(P>0.05),所以选定30∶1的液料比作为响应面的中心点。
图3 液料比对绿原酸得率的影响

Fig.3 Effects of liquid material ratio on chlorogenic acid yield (n=3)

2.1.4 超声功率对绿原酸得率的影响

由图4可知,在其他条件不变时,超声功率取在280~560 W变化,绿原酸得率先升高后降低,在超声功率为420 W时最高,显著高于280、350、490、560 W时(P<0.05),所以选定420 W的超声功率为响应面的中心点。
图4 超声功率对绿原酸得率的影响

Fig.4 Effects of ultrasonic power on chlorogenic acid yield (n=3)

2.2 Plackett-Burman试验

表3为Plackett-Burman试验结果,表4为数据方差分析结果。由表4可知,该模型显著性为极显著(P<0.01)。超声温度、超声时间、液料比对绿原酸得率的影响均达到极显著水平(P<0.01),但超声功率对绿原酸得率的影响不显著(P>0.05)。所以选择超声温度、超声时间、液料比进行后续的响应面优化试验,将超声功率固定为420 W。
表3 Plackett-Burman试验结果

Table 3 Results of Plackett-Burman test

试验号
Test No.		 因素Factors 绿原酸得率
Chlorogenic
acid yield/%
A B C D
1 1(80) 1(90) 1(40∶1) -1(350) 2.48
2 1 1 -1(20∶1) -1 2.41
3 1 1 -1 1(490) 2.25
4 1 -1(30) 1 1 2.43
5 1 -1 1 1 2.43
6 -1(50) -1 1 -1 1.99
7 1 -1 -1 -1 1.98
8 -1 1 -1 1 1.92
9 -1 1 1 1 2.11
10 -1 1 1 -1 2.04
11 -1 -1 -1 1 1.49
12 -1 -1 -1 -1 1.43

A:超声温度 ultrasonic temperature;B:超声时间 ultrasonic time;C:液料比 liquid-material ratio;D:超声功率 ultrasonic power。下表同 the same as below。

表4 Plackett-Burman试验各因素显著性分析

Table 4 Significant analysis of various factors in Plackett-Burman test

来源
Sources		 自由度
DF		 平方和
Adj SS		 均方和
Adj MS		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 4 1.268 5 0.317 1 24.36 <0.001 **
A 1 0.750 0 0.750 0 57.61 <0.001 **
B 1 0.177 6 0.177 6 13.64 0.008 **
C 1 0.333 3 0.333 3 25.60 0.001 **
D 1 0.007 5 0.007 5 0.58 0.473
误差Error 7 0.091 1 0.013 0
失拟Lack of fit 6 0.091 1 0.015 2
纯误差Pure error 1 <0.000 1 <0.000 1
合计Total 11 1.359 6

决定系数=93.30%,校正决定系数=89.47%,**表示极显著(P<0.01)。

R2=93.30%, R A d j 2=89.47%, ** indicates extremely significant (P<0.01).

2.3 Box-Behnken响应面试验

表5为公英散提取响应面试验结果,分析表6得到回归模型:Y=2.33+0.34A+0.21B+0.27C-0.13AB-0.13AC-0.068BC-0.027A2-0.095B2-0.086C2。可见该模型中A、B、C、AB、AC和B2等项对绿原酸得率具有极显著影响(P<0.01),C2和BC项绿原酸得率具有显著影响(P<0.05)。此外,模型的P<0.01,失拟项的P>0.05,说明此模型是可靠的。拟合度决定系数(R2)=99.09%,说明拟合值与实际值显著相关,满足模型精确度要求。校正决定系数( R A d j 2)=97.91%,说明97.91%响应值的变化能被该模型解释。综上所述,以上预测公英散超声辅助提取工艺的模型具有可行性。
表5 Box-Bchnken响应面试验结果

Table 5 Results of Box-Bchnken response surface test

试验号
Test No.		 因素Factors 绿原酸得率
Chlorogenic acid yield/%
A B C
1 1 -1 0 2.51
2 0 -1 -1 1.55
3 0 0 0 2.39
4 1 0 -1 2.43
5 -1 0 -1 1.51
6 0 -1 1 2.28
7 0 0 0 2.31
8 -1 -1 0 1.54
9 1 1 0 2.62
10 0 0 0 2.35
11 0 0 0 2.28
12 0 0 0 2.31
13 -1 0 1 2.27
14 -1 1 0 2.16
15 0 1 1 2.61
16 1 0 1 2.66
17 0 1 -1 2.16
表6 回归模型方差分析结果

Table 6 Results of variance analysis of regression model

来源
Source		 平方和
Adj SS		 自由度
DF		 均方
MS		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 2.100 9 0.230 84.450 <0.000 1 **
A 0.930 1 0.930 337.060 <0.000 1 **
B 0.350 1 0.350 127.670 <0.000 1 **
C 0.590 1 0.590 212.620 <0.000 1 **
AB 0.064 1 0.064 23.070 0.002 0 **
AC 0.068 1 0.068 24.540 0.001 6 **
BC 0.018 1 0.018 6.630 0.036 8 *
A2 0.003 1 0.003 1.140 0.320 4
B2 0.038 1 0.038 13.760 0.007 6 **
C2 0.031 1 0.031 11.150 0.012 4 *
残差Residual 0.019 7 0.003
失拟Lack of fit 0.012 3 0.004 2.040 0.251 5
纯误差Pure error 0.007 4 0.002
合计Total 2.111 16

决定系数=99.09%,校正决定系数=97.91%,*表示显著(P<0.05),**表示极显著(P<0.01)。

R2=99.09%, R A d j 2=97.91%, * indicates significant (P<0.05), ** indicates extremely significant (P<0.01).

借助Design-Expert 8.0.6软件由模型分析得出,超声辅助提取公英散的最优条件为:超声温度80 ℃,超声时间65.20 min,液料比37.54∶1。此条件下的公英散中绿原酸得率理论值可达2.70%。为了方便操作,将最优提取条件定为:超声温度80 ℃,超声时间65 min,液料比37∶1。根据修正后的最优条件进行3次验证试验,公英散中绿原酸得率可达(2.66±0.05)%,十分接近预测值,这表明响应面法优化提取工艺具有可行性。

2.4 提取条件的交互作用对绿原酸得率的影响

分析各因素之间的交互作用对响应值的影响,可见3D响应曲面图均成抛物状,有最高点。结合图5和表6可知,超声温度和液料比交互作用的响应面曲线最陡,且等高线密集,效应面曲线较陡,随着液料比和超声温度的升高,响应面曲线变化,影响开始变小。交互作用对公英散中绿原酸得率的影响大小为:超声温度和液料比>超声温度和超声时间>超声时间和液料比。
图5 两因素间交互作用响应面图

Fig.5 Response surface diagram of interaction between two factors

2.5 体外抗氧化试验结果

2.5.1 DPPH自由基清除能力

由图6可知,通过清除DPPH自由基来考察公英散水提物的体外抗氧化活性,在选定的浓度范围内,公英散水提物对DPPH自由基的清除能力较强,略低于维生素C。在0.20~1.00 mg/mL内,DPPH自由基清除率从40.74%持续增加到75.63%,表现出剂量依赖性。统计分析发现,公英散水提物和维生素C清除DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)值分别为0.38和0.15 mg/mL。
图6 公英散水提物对DPPH自由基的体外清除率

VC:维生素C vtamin C;G:公英散水提物 aqueous extract of Gongying powder。图7同 the same as Fig.7.

Fig.6 Scavenging rate of aqueous extract of Gongying powder on DPPH free radical in vitro

2.5.2 羟自由基清除能力

羟自由基可以损伤如核酸、脂质或氨基酸等生物大分子,常作为评价抗氧化活性的重要指标之一。由图7可知,在0.20~1.00 mg/mL内,公英散水提物和维生素C对羟自由基的清除率表现出剂量依赖性,随着浓度升高,公英散水提物对羟自由基清除率从50.40%持续增加到78.70%。统计分析发现,公英散水提物和维生素C清除羟自由基的IC50值分别为0.24和0.06 mg/mL。结合2.5.1结果可知,公英散水提物具有良好的抗氧化活性,其抗氧化能力略低于维生素C。
图7 公英散水提物对羟自由基的体外清除率

Fig.7 Scavenging rate of aqueous extract of Gongying powder on hydroxyl radical in vitro

2.6 体外抑菌试验

由表7可知,公英散水提物对3种奶牛乳房炎临床致病菌(S. aureus、E. coli和S. agalactiae)的MIC分别为2.25、9.00 和4.50 mg/mL,MBC分别为4.50、18.00和9.00 mg/mL。公英散水提物对3种奶牛乳房炎致病菌株均表现出良好的抑制作用,对S. aureus的抑制效果最好,对E. coli的抑制效果最弱。
表7 公英散水提物对3种奶牛乳房炎临床致病菌的MIC和MBC

Table 7 MIC and MBC of aqueous extract of Gongying powder against three clinical pathogenic bacteria of dairy cow mastitismg/mL

菌株Strains 最低抑菌浓度MIC 最低杀菌浓度MBC
金黄色葡萄球菌S. aureus 2.25 4.50
大肠杆菌E. coli 9.00 18.00
无乳链球菌S. agalactiae 4.50 9.00
由表8可知,以常用的抗生素作为对照,结果显示公英散水提物在高浓度(144.00 mg/mL)时对S. aureus敏感,介于万古霉素和头孢氨苄的抑菌效果之间。青霉素对S. aureus的敏感性最好,抑菌圈直径为(33.08±0.18) mm。公英散水提物在高浓度(144.00 mg/mL)时对E. coli敏感。庆大霉素对E. coli的敏感性最好,抑菌圈直径为(24.05±0.29) mm。E. coli对青霉素不敏感,无抑菌圈。公英散水提物在高浓度(144.00 mg/mL)时对S. agalactiae敏感。青霉素对S. agalactiae的抑菌效果最好,抑菌圈直径为(37.05±0.18) mm。由以上结果可知,公英散水提物对S. aureus的抑菌效果最好,对E. coli的抑菌效果最弱。由此可知,公英散水提物对3种奶牛乳房炎临床致病菌均有不同程度的抑制作用,且药液浓度越高,抑菌效果越好,具有剂量依赖性。
表8 不同药物对3种奶牛乳房炎临床致病菌的抑菌圈直径

Table 8 Diameter of antibacterial zone of different drugs against three clinical pathogenic bacteria of dairy cow mastitis

项目
Items		 抑菌圈直径Diameter of antibacterial zone/mm
金黄色葡萄球菌
S. aureus		 大肠杆菌
E. coli		 无乳链球菌
S. agalactiae
青霉素Penicillin 33.08±0.18 - 37.05±0.18
头孢氨苄Cephalexin 25.07±0.15 23.06±0.21 31.02±0.17
庆大霉素Gentamicin / 24.05±0.29 /
万古霉素Vancomycin 17.01±0.16 / 25.06±0.18
G1(144.00 mg/mL) 22.04±0.20 15.07±0.19 18.11±0.59
G2(72.00 mg/mL) 15.15±0.59 8.34±0.52 11.13±0.20
G3(36.00 mg/mL) 11.22±0.54 - 7.02±0.26
G4(18.00 mg/mL) 8.06±0.20 - -

-表示无抑菌圈,/表示没有进行该次试验,G1~G4分别代表高、中、低和较低浓度的公英散水提物。

- indicates no bacteriostatic ring, / indicates the test has not been carried out, and G1 to G4 represent the high, medium, low and lower concentrations of the aqueous extract of Gongying powder, respectively.

3 讨论

3.1 公英散提取工艺的优化

在本研究中,首先通过前期的高效液相色谱试验发现公英散水提物中绿原酸含量较高,因此我们以绿原酸得率为指标判定公英散的提取率,得到超声时间、超声温度和液料比是影响公英散提取率的主要因素。其中,绿原酸得率随超声温度增加而升高,当超声温度超过65 ℃时,绿原酸得率随超声温度增加出现降低趋势。这可能是由于随着超声温度的升高,公英散中的难溶性化学物质溶解度增加,但当超声温度继续升高时,许多不耐高温的化学成分被降解,导致公英散提取效率降低。高林晓等[25]在利用响应面法优化提取水麻果中绿原酸的工艺中发现,随着温度的升高,水麻果内的绿原酸分子加快运动,因此更易析出。但随着温度的继续升高,绿原酸分子会形成同分异构体或者水解,继而导致得率下降。由此可见,超声辅助提取时超声温度不宜过高。
超声时间对公英散提取效率的影响也有类似规律,绿原酸得率随着超声时间的延长逐渐增加,在60 min时达到最高峰,继续增加超声时间,绿原酸得率反而降低。这是由于短时间内,溶质由植物基质内部渗出至外部,萃取效率随着时间的延长而增加。但溶质随时间延长逐渐趋于内外平衡后,延长时间不会影响萃取效率,相反,长时间的超声和高温会导致一些成分的降解。舒玉凤等[26]在超声辅助法提取蒲公英多糖时发现,随着超声时间的延长,蒲公英多糖得率开始下降,其原因可能是随着长时间的高温加热和超声波引发的热量聚集,使得蒲公英中的多糖出现降解。
此外,从液料比单因素试验中可以发现,液料比为30∶1时,绿原酸得率最高。这可能是因为液料比的增加提高了介质渗透压和接触面积,导致更多的溶剂渗入植物基质,提高了生物活性物质通过细胞壁渗透到溶剂中的能力,但当溶剂继续增加达到饱和时,公英散的提取效率几乎不再改变。吕欣等[27]在优化提取金银花试验中发现,金银花多糖得率随着料液比的增加而明显增高,这是因为多糖随着溶剂的增多充分溶出,但是当溶剂继续增多时,可能导致溶出的多糖迅速在水中降解,且料液比过大可导致后期处理的损耗增加,从而降低了多糖的得率。因此,液料比要选择合适范围。而在实际的提取流程中,超声时间、超声温度和液料比三者是共同发挥作用来影响公英散的提取效率。

3.2 公英散水提物的体外抗氧化活性

超声辅助提取的公英散水提物有较好的体外抗氧化活性,当质量浓度达到1.00 mg/mL时,公英散水提物对羟自由基的清除率为78.70%,对DPPH自由基的清除率为75.63%。公英散中的蒲公英、金银花、连翘等多味药材是天然的抗氧化剂,大量研究都报道过这些药材具有良好的抗氧化活性。Majewski等[28]发现富含L-菊苣酸的蒲公英叶和花分别通过降低小鼠血浆中蛋白质羰基化水平和提高血浆中蛋白质硫醇基团含量,从而使得小鼠体内过氧化应激生物标记物的含量显著降低。此外,Wang等[29]发现金银花水提物可能通过提高大鼠血清中超氧化物歧化酶活性以及降低丙二醛含量来抑制高脂血症大鼠体内氧化应激的形成。赵泮峰[30]发现,通过在肉鸡饲粮中添加连翘提取物(100 mg/kg)来替代维生素C(200 mg/kg),可以提高总抗氧化能力,清除体内DPPH自由基含量,降低丙二醛含量,从而缓解运输应激对肉鸡血清、肌肉和肝脏的氧化损伤反应,并提高鸡肉品质。氧化应激往往与炎症途径的激活有关,所以许多具有良好抗氧化活性的天然产物也用于炎症的治疗。卢德勋[31]认为氧化应激常常伴随着炎症反应和免疫功能失衡发生,当病原菌入侵奶牛乳腺后,机体中吞噬细胞会产生大量活性氧来对抗细菌感染,此时会出现自由基稳态失衡,进而导致奶牛乳房炎的发生。由此可以推测,公英散水提物能够有效治疗奶牛乳房炎可能与其良好的抗氧化活性相关。

3.3 公英散水提物的体外抑菌活性

本试验采用超声辅助提取的公英散水提物对3种奶牛乳房炎临床致病菌均表现出良好的抑制作用,对比发现对S. aureus的生长抑制作用最明显,对S. agalactiae的抑制效果次之,对E. coli的抑制效果最弱。奶牛乳房炎可由多种病原体引起,从症状上可分为环境型致病菌引起的临床性乳房炎和接触传染型致病菌引起的亚临床性乳房炎,E. coli是最常见的环境型致病菌,S. aureus和S. agalactiae是常见的传染型致病菌。这些病原微生物被乳腺中的模式识别受体(PRR)、Toll样受体4(TLR4)等受体识别,进而激发核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信号通路,出现一系列免疫炎症反应,介导体内包括一氧化氮合酶、环氧合酶在内的炎症过程相关酶的表达[32]。蒲公英、金银花、连翘等药材的体外抑菌活性已被多次报道。霍佳楠等[33]研究发现,蒲公英水提物在一定浓度范围内可以有效抑制S. aureus的生长和生物膜的形成。吕归红等[34]研究发现,金银花枝叶提取液有一定的抑菌、抗炎作用,在体外作用于E. coli、S. aureus的抑菌效果良好。连翘酯苷是连翘中最主要的活性物质,有抑菌、抗炎、抗氧化等多种功效。龚春燕等[35]将连翘提取物与头孢他啶联合作用,发现二者联用增强了对E. coli、S. aureus的生长抑制作用,存在协同作用,可能是因为连翘提取物可阻碍此类细菌的繁殖。本研究不仅证实了超声辅助提取的公英散水提物对S. aureus和E. coli的抑菌效果,还发现其对奶牛乳房炎常见临床致病菌株S. agalactiae亦有一定抑制作用。由此可知,公英散水提物能够有效治疗奶牛乳房炎可能与其良好的抑菌性能有关,但具体作用机制还有待于进一步研究。

4 结论

本研究优化了超声波辅助提取公英散的条件,其最佳提取条件是超声温度80 ℃,超声功率420 W,超声时间65 min,液料比37∶1,此条件下能高效提取公英散活性成分,得到的公英散水提物在体外有良好的抗氧化和抑菌效果,可为公英散水提物在奶牛养殖中的应用以及奶牛乳房炎临床制剂的研发提供重要参考。

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