动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 602 - 609

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.054

研究论文

桑椹来源的寡核苷酸显著改善小鼠骨质疏松症

  • 穆雪萌 , 1 ,
  • 杜芯仪 2 ,
  • 王彦超 3 ,
  • 金云峰 4 ,
  • 张嘉 , 1, *
展开
  • 1 中国医学科学院北京协和医院骨科,北京 100010
  • 2 中国医学科学院北京协和医学院基础学院,北京 100010
  • 3 上海弗艾柏生物科技有限公司,上海 200433
  • 4 北京优准生物科技有限公司,北京 110000
* 张嘉,教授,硕士生导师,E-mail:

穆雪萌(1998—),女,山东德州人,硕士研究生,研究方向为骨质疏松性骨折。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-07-23

  网络出版日期: 2024-01-12

收起

Mulberry-Derived Oligonucleotides Significantly Improved Osteoporosis in Mice

  • MU Xuemeng , 1 ,
  • DU Xinyi 2 ,
  • WANG Yanchao 3 ,
  • JIN Yunfeng 4 ,
  • ZHANG Jia , 1, *
Expand
  • 1 Department of Orthopaedics, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100010, China
  • 2 School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100010, China
  • 3 Fiber Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai 200433, China
  • 4 Beijing Precision Biotech Co., Ltd., Beijing 110000, China
* professor, E-mail:

Received date: 2023-07-23

  Online published: 2024-01-12

Fold

摘要

本试验旨在探究桑椹来源的寡核苷酸ASON-OP对小鼠骨质疏松症的改善作用。将30只雌性小鼠随机分为5组,分别为假手术组、模型对照组、阳性药物组、ASON-OP组和ASON-NC组(ASON-NC为无义序列,作为阴性对照),每组6只。除假手术组小鼠以外,其他4组小鼠均进行双侧卵巢切除(OVX),构建骨质疏松症小鼠模型。建模成功后,继续饲养1周,而后进行给药处理。假手术组和模型对照组每天灌胃300 μL生理盐水;阳性对照组皮下注射特立帕肽,剂量为80 μg/(kg BW·d),1周给药5次;ASON-NC组每天灌胃ASON-NC溶液,剂量为2 mg/(kg BW·d);ASON-OP组每天灌胃ASON-OP溶液,剂量为2 mg/(kg BW·d)。连续给药4周后,检测小鼠骨组织微结构、骨转化指标等。结果显示:与模型对照组和ASON-NC组相比,连续4周灌胃寡核苷酸ASON-OP显著增加了OVX小鼠的骨密度(P<0.05);显著提高了OVX小鼠血清成骨因子骨钙素(OCN)含量(P<0.05),显著降低了血清破骨因子Ⅰ型胶原C末端肽(CTX-1)含量(P<0.05);显著提高了OVX小鼠股骨中促进成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、肝/骨/肾型碱性磷酸酶(Alpl)、骨钙素(Bglap)的mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,桑椹来源的寡核苷酸ASON-OP具有显著的抗骨质疏松症作用。

关键词： 桑椹; 寡核苷酸; ASON-OP; 小鼠; 骨质疏松症

本文引用格式

穆雪萌 , 杜芯仪 , 王彦超 , 金云峰 , 张嘉 . 桑椹来源的寡核苷酸显著改善小鼠骨质疏松症[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(1) : 602 -609 . DOI: 10.12418/CJAN2024.054

Abstract

The objective of this experiment was to explore the improvement effects of ASON-OP, an oligonucleotide derived from the mulberry. Thirty female mice were randomly divided into five groups: sham surgery group, model control group, positive control group, ASON-OP group, and ASON-NC group (ASON-NC is a nonsense sequence, as negative control), with six mice in each group. Except for the mice in the sham surgery group, bilateral ovariectomy (OVX) was performed on mice in the other four groups to induce the osteoporosis mouse model. After successful modeling, continued to feed for 1 week, and then administered the drug. Mice in the sham surgery group and model control group were given 300 μL normal saline per day by gavage; mice in the positive control group were injected subcutaneously with teriparatide at the dose of 80 μg/(kg BW·d), five times a week; mice in the ASON-NC group were given ASON-NC solution by gavage, 2 mg/(kg BW·d); mice in the ASON-OP group were given ASON-OP solution by gavage, 2 mg/(kg BW·d). The mice were continuously administered for 4 weeks, and their bone tissue microstructure and bone turnover markers were measured. The results showed as follows: compared to the model control group and ASON- NC group, mice gavaged with oligonucleotide ASON-OP for 4 weeks significantly increased the bone mineral density of OVX mice (P<0.05); it significantly increased the serum content of osteocalcin (OCN) as a bone formation marker of OVX mice (P<0.05), and significantly decreased the serum content of type Ⅰ collagen C-terminal telopeptide (CTX-1) as a bone resorption marker (P<0.05); it also significantly increased the mRNA relative expression levels of the bone formation-related genes Runt-related transcription factor 2 (Runx2), alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (Alpl) and bone gamma-carboxyglutamate protein (Bglap) in the femur of OVX mice (P<0.05). In conclusion, ASON-OP, an oligonucleotide derived from mulberry, exhibits significant anti-osteoporotic effect.

Key words： mulberry; oligonucleotide; ASON-OP; mice; osteoporosis

骨质疏松症(osteoporosis)是一种常见的骨骼疾病,主要表现为骨密度降低、骨骼脆弱易碎,容易发生骨折。骨质疏松症的发病机制复杂,与遗传、环境和生活方式等多种因素有关。据世界卫生组织(WHO)统计,全球有超过2亿人患有骨质疏松症,每年导致约890万例骨折事件,给公共卫生经济带来了重大负担。现有的治疗骨质疏松症的药物主要包括抗骨吸收剂和促进骨形成剂2类。抗骨吸收剂包括双磷酸盐、选择性雌激素受体调节剂等,促进骨形成剂包括甲状旁腺类似物等。抗骨吸收剂和促进骨形成剂在治疗骨质疏松症方面都有一定的优劣。抗骨吸收剂能够快速地减缓骨密度降低和骨折风险,但长期使用可能会导致骨质转换不良和颅内高压等;而促进骨形成剂虽然能够增加骨量,但治疗效果较慢,代表性药物特立帕肽还有可能导致骨肉瘤风险增高。骨质疏松症现有治疗药物有限,开发一种新的抗骨质疏松症的药物具有重大意义。
植物来源的寡核苷酸在哺乳动物的生物调控中起到了不可忽略的作用。水稻来源的miR168a靶向人类和小鼠的低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1),可降低血液中低密度脂蛋白含量[1]。草莓来源的FvmiR168可以作为配体结合树突状细胞上的Toll样受体3,调节炎症反应[2]。金银花来源的miR2911可以靶向甲型流感病毒、新型冠状病毒(SARS-Cov-2)等,抑制病毒复制[3-4]。生姜来源的mdo-miR7267-3p可以改善小鼠结肠炎[5]。红景天来源的HJT-sRNA-m7可以改善小鼠肺损伤[6]。这些研究成果表明,植物来源的寡核苷酸是药用植物的一种新的有效成分,为药物开发和药用植物作用机制研究开启了新的领域。
中医学自古以来便有“药食同源”理论,药食同源的中药材是优异的保健和药用资源,并可向日常饮食中推广。药食同源的桑椹为补虚药下的补血药,具有滋阴补血、生津润燥之效,用于肝肾阴虚的治疗。已有研究显示,桑椹和人参的水提液以及醇提液能显著促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖,并且提高了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性[7]。桑椹被广泛用于骨质疏松症食疗药膳方中[8-9]。目前,国内外对外源性寡核苷酸,特别是植物来源的寡核苷酸抗骨质疏松症的研究报道尚少。已有研究通过小RNA(small RNA,sRNA)测序分析发现,桑椹中药饮片水煎液中广泛存在寡核苷酸,结果提示寡核苷酸可能是桑椹中被忽略的药理成分之一[10]。基于此,我们选择桑椹来源的寡核苷酸进行抗骨质疏松症药效学研究,探究其对小鼠骨质疏松症的改善作用,以期为抗骨质疏松症药物的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 寡核苷酸序列信息及引物信息

试验用桑椹来源的寡核苷酸ASON-OP(自定义名称)和作为阴性对照的ASON-NC(自定义名称,为无义序列)以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)所需引物委托北京擎科生物科技有限公司生产,寡核苷酸序列信息与PCR引物信息如表1所示。
表1 寡核苷酸序列信息与PCR引物信息

Table 1 Sequence information of oligonucleotides and primer information of PCR

名称
Names		 序列或引物信息
Sequence or primer information (5'—3')
ASON-OP UAACAAGGUUUCCGUAGG
ASON-NC UUGUACUACACAAAAGUACUG
ASON-OP逆转录引物ASON-OP RT primer GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGA
GGTATTCGCACTGGATACGACCCTUCG
ASON-OP上游引物ASON-OP forward primer TCGCGCUAACAAGGUUU
ASON-OP下游引物ASON-OP reverse primer GAGCGTGCACTGGATACGAC

1.1.2 试验动物

试验动物为30只无特定病原体(SPF)级6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,所有动物试验均遵循政府和动物护理和使用委员会的指导方针。

1.1.3 主要试剂

脂质小分子化合物棕榈酰基溶血磷脂酸(16∶0 Lyso PA),购自美国Sigma-Aldrich公司;无菌无酶水,购自北京翱擎生物科技有限公司;CTAB提取缓冲液,购自北京索莱宝生物科技有限公司;TRIzol裂解液,购自美国Sigma-Aldrich公司;三氯甲烷、异丙醇和无水乙醇,购自中国国药集团化学试剂有限公司;逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒,购自南京诺唯赞生物科技有限公司;骨钙素(OCN)检测试剂盒和Ⅰ型胶原C末端肽(CTX-1)检测试剂盒,购自上海酶联生物科技有限公司。

1.1.4 仪器设备

组织匀浆仪(IKA,德国)、普通PCR基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,美国)、4 ℃高速离心机(Beckman,美国)、4 ℃冰箱(海尔集团)、-80 ℃超低温冰箱(SANYO,日本)、μCT-100小动物活体三维断层扫描系统(SCANCO,瑞士)、全功能酶标仪(BioTek,美国)。

1.2 试验方法

使用传统方法制备桑椹中药饮片水煎液,使用改良的CTAB法提取水煎液中的RNA。每200 μL桑椹中药饮片水煎液中加入1 mL CTAB提取缓冲液和20 μL β-巯基乙醇,于65 ℃烘箱中放置30 min;4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取500 μL上清,加入等体积异丙醇,充分混匀,置于-20 ℃冰箱放置 30 min;4 ℃、12 000 r/min离心25 min;弃去上清,使用1 mL CTAB提取缓冲液和20 μL β-巯基乙醇重悬,于65 ℃烘箱中放置30 min;加入200 μL三氯甲烷,充分振荡混匀,4 ℃、12 000 r/min离心15 min;取500 μL上清,加入400 μL异丙醇,充分振荡,置于-20 ℃冰箱放置30 min;4 ℃、12 000 r/min离心25 min;弃去上清,使用75%乙醇清洗沉淀2次,得到总RNA。
采用RT-qPCR法检测桑椹中药饮片水煎液中寡核苷酸ASON-OP含量。
使用无菌无酶水溶解寡核苷酸ASON-OP和ASON-NC,与适量脂质小分子化合物16∶0 Lyso PA物理混合,制备ASON-OP和ASON-NC溶液,用于后续动物试验。
30只SPF级6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠[平均体重(20±2) g]适应性饲养1周后,随机分为5组,分别为假手术组、模型对照组、阳性对照组、ASON-NC组(作为阴性对照)和ASON-OP组,每组6只。小鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液进行麻醉,去除小鼠背部毛发。小鼠采用俯卧位,在髂脊顶部下方1 cm左右,腰椎骶棘肌两侧做纵行切口,打开后腹膜,卵巢呈粉红色颗粒样组织,周围有乳白色脂肪组织。除假手术组,其他4组小鼠均行双侧卵巢切除(OVX),并结扎输卵管;假手术组保留双侧卵巢,切除卵巢周围部分脂肪组织。
建模成功后,继续饲养1周,而后进行给药处理,连续给药4周。假手术组和模型对照组每天灌胃300 μL生理盐水;阳性对照组皮下注射特立帕肽,剂量为80 μg/(kg BW·d),1周给药5次(连续给药5 d、间断2 d);ASON-NC组每天灌胃ASON-NC溶液,剂量为2 mg/(kg BW·d);ASON-OP组每天灌胃ASON-OP溶液,剂量为2 mg/(kg BW·d)。试验期间小鼠保证自由饮食和饮水,末次给药后禁食8 h,采用摘眼球取血法采集小鼠血液制备血清,收集小鼠左侧股骨置于液氮中,后转移至-80 ℃保存,收集小鼠右侧股骨使用4%多聚甲醛固定。

1.3 检测指标

1.3.1 小鼠体重监测及一般状态观察

开始给药后,每2 d记录1次小鼠体重,并观察小鼠毛发光泽度和个体活跃度。

1.3.2 小鼠骨组织微结构检测

将小鼠右侧股骨标本周围筋膜、肌肉组织彻底去除,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗掉附带血迹后放入4%的多聚甲醛溶液中固定48 h,用PBS冲洗后转入75%的酒精中,然后放入样品管中, 对小鼠股骨进行微计算机断层扫描(microCT)及三维重建。扫描参数为:电压(E)=70 kV,电流(I)=200 μA,分辨率=10 μm,扫描部位为股骨远端至中段区域。

1.3.3 小鼠血清骨转换指标检测

将收集的小鼠全血置于1.5 mL 离心管中,室温静置60 min后12 000 r/min离心10 min,使用移液器分离血清至干净的离心管中待测。OCN是骨组织中含量最丰富的非胶原蛋白,是反映骨形成的重要生化指标;CTX-1是骨胶原降解后的产物,可反映破骨细胞骨吸收的活性。采用相关试剂盒检测小鼠血清成骨转换指标OCN和破骨转换指标CTX-1含量。

1.3.4 小鼠股骨成骨基因mRNA水平检测

使用TRIzol法提取小鼠左侧股骨组织的总RNA,使用逆转录试剂盒将提取到的RNA反转录得到cDNA,使用实时荧光定量PCR法检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、肝/骨/肾型碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,Alpl)、骨钙素(bone gamma-carboxyglutamate protein,Bglap)的mRNA水平,以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,Gapdh)作为内参基因进行相对定量。引物信息见表2。
表2 引物信息

Table 2 Primer information

引物名称Primer names 引物序列Primer sequences (5'—3')
小鼠Runx2上游引物Mouse Runx2 forward primer AACGATCTGAGATTTGTGGGC
小鼠Runx2下游引物Mouse Runx2 reverse primer CCTGCGTGGGATTTCTTGGTT
小鼠Alpl上游引物Mouse Alpl forward primer CCAACTCTTTTGTGCCAGAGA
小鼠Alpl下游引物Mouse Alpl reverse primer GGCTACATTGGTGTTGAGCTTTT
小鼠Bglap上游引物Mouse Bglap forward primer GCCCAGACCTAGCAGACAC
小鼠Bglap下游引物Mouse Bglap reverse primer TGGGCTTGGCATCTGTGAG
小鼠Gapdh上游引物Mouse Gapdh forward primer AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
小鼠Gapdh下游引物Mouse Gapdh reverse primer TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 25.0.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。试验数据以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 寡核苷酸ASON-OP在药食同源中药饮片桑椹中存在

经测定,寡核苷酸ASON-OP在桑椹中药饮片水煎液中的RPM(reads per million)值为200.8。针对寡核苷酸ASON-OP设计特定的逆转录引物,进一步采用RT-qPCR法进行验证,测定显示寡核苷酸ASON-OP的阈值循环数(cycle threshold,Ct)值为21.3。上述结果表明,寡核苷酸ASON-OP存在于药食同源的植物桑椹中,可能是被忽略的有效药用成分,在此基础上进一步对寡核苷酸ASON-OP的抗骨质疏松症作用进行探究。

2.2 寡核苷酸ASON-OP抵抗雌激素缺乏导致的小鼠体重增加

通过双侧卵巢切除术构建骨质疏松症模型模拟绝经后骨质疏松症,在给药过程中小鼠的体重变化如表3所示。雌激素缺乏导致小鼠体重增加明显,连续给药28 d后,ASON-OP组小鼠体重趋近假手术组(P>0.05),且显著低于模型对照组、阳性对照组和ASON-NC组(P<0.05)。上述结果说明寡核苷酸ASON-OP可以抵抗雌激素缺乏诱导的小鼠体重增加。
表3 小鼠体重变化

Table 3 Body weight change of mice (n=6)g

项目
Items		 给药前(第0天)
Before administration
(day 0)		 给药中(第14天)
During administration
(day 14)		 给药后(第28天)
After administration
(day 28)
假手术组Sham surgery group 18.0±0.2 21.1±0.7c 22.3±0.4c
模型对照组Model control group 18.3±0.4 23.4±0.8a 26.2±0.8a
阳性对照组Positive control group 18.6±0.9 21.6±1.4bc 25.0±1.3b
ASON-NC组ASON-NC group 17.9±1.1 22.9±1.1ab 25.4±0.9ab
ASON-OP组ASON-OP group 18.3±0.4 21.6±1.5bc 22.5±0.6c

同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter of the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.3 寡核苷酸ASON-OP改善双侧卵巢切除小鼠骨组织微结构

使用microCT检测小鼠股骨组织微结构,三维重建图如图1所示,统计结果如表4所示。假手术组为正常小鼠骨组织微结构,与模型对照组相比,小鼠股骨的骨密度、相对骨体积、骨小梁数量明显减小,骨小梁分离度增大,且具有统计学差异(P<0.05),说明骨质疏松症小鼠模型构建成功。与ASON-NC组和模型对照组相比,连续4周灌胃寡核苷酸ASON-OP显著增加了双侧卵巢切除小鼠的骨密度(P<0.05),显著提高了相对骨体积和骨小梁数量(P<0.05),显著降低了骨小梁分离度(P<0.05)。
图1 双侧卵巢切除小鼠股骨microCT三维重建图

Fig.1 MicroCT 3D reconstruction image of femur from OVX mice

表4 双侧卵巢切除小鼠股骨组织microCT结果分析

Table 4 Analysis of microCT results of femoral tissues from OVX mice

项目
Items		 检测指标Detection indexes
骨密度
BMD/
(g/cm3)		 相对骨体积
Relative bone
volume/%		 骨小梁数量
Trabecular
number/(1/mm)		 骨小梁宽度
Trabecular
width/μm		 骨小梁分离度
Trabecular
separation/μm
假手术组Sham surgery group 755.3±7.0a 6.30±0.67a 1.88±0.15a 33.53±1.21c 0.50±0.05b
模型对照组Model control group 700.2±12.7b 3.46±1.56b 0.99±0.31b 30.38±1.89c 1.13±0.31a
阳性对照组Positive control group 753.0±22.6a 6.29±2.96a 1.80±0.68a 39.12±4.76a 0.59±0.15b
ASON-NC组ASON-NC group 719.5±17.8b 3.36±1.19b 1.08±0.30b 34.35±3.14bc 0.98±0.26a
ASON-OP组ASON-OP group 746.9±20.4a 5.90±1.50a 1.55±0.27a 37.62±3.95ab 0.63±0.14b

2.4 寡核苷酸ASON-OP改善双侧卵巢切除小鼠血清骨转化指标

如表5所示,模型对照组与假手术组相比,双侧卵巢切除导致的骨质疏松症使小鼠血清OCN含量显著降低(P<0.05),血清CTX-1含量显著升高(P<0.05);与ASON-NC组和模型对照组相比,连续4周灌胃寡核苷酸ASON-OP显著提高了双侧卵巢切除小鼠血清OCN含量(P<0.05),显著降低了血清CTX-1含量(P<0.05)。
表5 双侧卵巢切除小鼠血清骨转化指标

Table 5 Serum bone turnover indexes in OVX mice

项目
Items		 检测指标Detection indexes
骨钙素OCN/(ng/mL) Ⅰ型胶原C末端肽CTX-1/(pg/mL)
假手术组Sham surgery group 79.5±6.3a 2 207.4±546.1b
模型对照组Model control group 62.5±6.6b 3 812.5±678.3a
阳性对照组Positive control group 81.4±7.4a 2 030.5±447.7b
ASON-NC组ASON-NC group 63.9±7.5b 3 414.5±365.2a
ASON-OP组ASON-OP group 83.3±5.2a 2 211.2±572.1b

2.5 寡核苷酸ASON-OP促进双侧卵巢切除小鼠股骨中成骨基因Runx2、Alpl和Bglap表达

如图2所示,模型对照组与假手术组相比,双侧卵巢切除导致的骨质疏松症使小鼠股骨中成骨基因Runx2、Alpl和Bglap的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与ASON-NC组和模型对照组相比,连续4周灌胃寡核苷酸ASON-OP显著提高了双侧卵巢切除小鼠股骨中Runx2、Alpl和Bglap的mRNA相对表达量(P<0.05)。
图2 Runx2、Alpl、Bglap mRNA相对表达量

数据柱标注相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Fig.2 Relative expression levels of Runx2, Alpl and Bglap mRNA

Data column with the same small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

3 讨论

在世界范围内,人口老龄化程度进一步加深,骨质疏松症的发病率已经攀升到慢性疾病的第3位,仅次于心血管疾病和糖尿病[11]。现有抗骨质疏松症药物存在价格昂贵、有不良反应等问题。例如,服用双磷酸盐类药物可能存在上腹疼痛、反酸、发热、肌痛及流感样症状,并且可能发生罕见的下颌骨坏死、不典型骨折等;特立帕肽可能会导致病人恶心、腿部抽搐等[12]。开发一种新的抗骨质疏松症的药物具有重大前景。
中医疗法因其中药复方配伍灵活,疗效温和,适合长期使用而具有独特优势,食物疗法也被广泛用于骨质疏松症的治疗[13]。药食同源类中药是具有治疗作用的中药,又可用作日常饮食中,药食同源类中药及其组成成分往往具有更低的毒副作用等特点,适合慢性疾病的治疗。现有对药食同源中药治疗骨质疏松症的研究集中在小分子化合物。来源于当归的藁本内酯可以下调炎症因子的表达,达到缓解大鼠骨质疏松症的作用[14]。黄芪甲苷可以降低骨质疏松大鼠的氧化应激水平,上调β-链蛋白(β-catenin)和Wnt家族成员2(Wnt2)蛋白表达,发挥抗骨质疏松症作用[15]。葛根素可以提高前成骨细胞ALP活性,促进成骨细胞增殖及矿化[16]。然而,药食同源中药来源寡核苷酸抗骨质疏松症的研究在国内外还未见报道。本试验发现,来源于补虚类药食同源中药桑椹的寡核苷酸ASON-OP在双侧卵巢切除小鼠上具有显著的抗骨质疏松症作用,可以改善双侧卵巢切除小鼠的骨微结构损伤,提高骨密度、相对骨体积,降低骨分离度等。OCN是一种钙离子结合蛋白,参与骨代谢和骨形态发生,主要通过促进骨细胞成熟和骨基质沉积来促进骨形态发生和维持骨密度,是骨形成的早期指标[17]。成骨作用与破骨作用的失衡导致骨质疏松症的产生。在骨吸收过程中,胶原Ⅰ分子被胶原酶降解,CTX-1大量释放到血液中。CTX-1在骨质疏松症患者血液中的含量通常较高,是评价骨吸收的重要指标[18]。桑葚来源的寡核苷酸ASON-OP提高了双侧卵巢切除小鼠血清中OCN含量,降低了血清中CTX-1含量,通过促进成骨形成和抑制破骨产生,进而减少骨量的流失和骨质疏松症的发生。Runx2、Alpl和Bglap是在成骨形成过程中的关键基因,桑葚来源的寡核苷酸ASON-OP可能是通过促进Runx2、Alpl、Bglap mRNA表达来提高骨密度的。寡核苷酸类药物直接作用于致病基因的信使RNA,理论上具有更长的药物作用时间和更精准的靶向治疗,有望开启骨质疏松症药物开发的新热点。
药食同源的植物是优秀的保健和药用资源,近年来逐渐受到国内外学者和药品研发企业的关注。然而,现有研究主要聚焦在小分子成分,包括黄酮类、生物碱类等[19-20]。药食同源植物的寡核苷酸成分为骨质疏松症的治疗提供了新的思路。本文提出一种新的药食同源类植物的有效成分筛选方法,并确定桑葚来源的寡核苷酸ASON-OP在动物水平具有显著的抗骨质疏松症作用,有望进行下一步的转化和应用。

4 结论

综上所述,来自药食同源桑椹的寡核苷酸ASON-OP能显著提高双侧卵巢切除小鼠的骨密度,改善骨微结构;显著提高双侧卵巢切除小鼠血清中OCN含量,并显著降低血清中CTX-1含量;显著提高双侧卵巢切除小鼠股骨中Runx2、Alpl、Bglap mRNA的相对表达量。上述结果说明桑椹来源的寡核苷酸ASON-OP具有显著的抗骨质疏松症作用。

参考文献

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