动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 1: 610 - 625

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.055

研究论文

枸杞叶对大鼠生长性能、血清生化与抗氧化指标及血浆代谢组的影响

  • 郭引弟 , 1, 2, 3 ,
  • 妥强 2, 4 ,
  • 刘杰 1, 2, 3 ,
  • 张东涛 1, 2, 3 ,
  • 辛国省 , 1, 2, 3, *
展开
  • 1 宁夏大学生命科学学院,银川 750021
  • 2 宁夏饲料工程技术研究中心,银川 750021
  • 3 宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,银川 750021
  • 4 宁夏大学动物科技学院,银川 750021
* 辛国省,教授,博士生导师,E-mail:

郭引弟(1999—),女,甘肃天水人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-08-03

  网络出版日期: 2024-01-12

基金资助

宁夏重点研发计划项目(2023BCF01037)

收起

Effects of Lycium barbarum Leaves on Growth Performance, Serum Biochemical and Antioxidant Indexes and Plasma Metabolome of Rats

  • GUO Yindi , 1, 2, 3 ,
  • TUO Qiang 2, 4 ,
  • LIU Jie 1, 2, 3 ,
  • ZHANG Dongtao 1, 2, 3 ,
  • XIN Guosheng , 1, 2, 3, *
Expand
  • 1 School of Life and Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 2 Ningxia Feed Engineering Technology Research Center, Yinchuan 750021, China
  • 3 Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China of Ningxia University, Yinchuan 750021, China
  • 4 College of Animal Science and Technology, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
* Correspond author, professor, E-mail:

Received date: 2023-08-03

  Online published: 2024-01-12

Fold

摘要

本试验以大鼠为模式动物,旨在探究枸杞叶对动物生长性能、血清生化与抗氧化指标及血浆代谢组的影响。选取体重相近的健康雄性SD大鼠25只,随机分为5组(每组5个重复,每个重复1只):NC组(对照组)大鼠饲喂基础饲粮,PC组(枸杞果实阳性对照组)大鼠在饲喂基础饲粮的基础上灌服4 g/kg BW的枸杞果实匀浆,LD组、MD组和HD组(枸杞叶试验组)大鼠在饲喂基础饲粮的基础上分别灌服2、4和8 g/kg BW枸杞叶匀浆。预试期7 d,正试期28 d。结果显示:1)LD组大鼠的末重(338.63 g)和平均日增重(6.25 g/d)最高,显著高于NC组、PC组和MD组(P<0.05)。2)随枸杞叶匀浆灌胃剂量的上升,血清白球比降低,且HD组显著低于其他组(P<0.05)。3)LD组血清总抗氧化能力显著高于其他组(P<0.05),且随枸杞叶匀浆灌胃剂量的升高,血清总抗氧化能力显著下降(P<0.05)。4)通过血浆代谢组学分析共筛选出31种差异代谢物,富集的代谢通路主要有花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢及烟酸和烟酰胺代谢等。综上所述,枸杞叶可提高模式动物大鼠的生长性能,并可能通过花生四烯酸代谢、氨基酸代谢等途径及中间代谢产物调控机体的抗氧化能力与免疫功能。本试验条件下,枸杞叶匀浆灌胃剂量为2 g/kg BW时效果较好。

关键词： 枸杞叶; 功能饲料; 枸杞多糖; 模式动物; 免疫; 抗氧化; 代谢组

本文引用格式

郭引弟 , 妥强 , 刘杰 , 张东涛 , 辛国省 . 枸杞叶对大鼠生长性能、血清生化与抗氧化指标及血浆代谢组的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(1) : 610 -625 . DOI: 10.12418/CJAN2024.055

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of Lycium barbarum (L. barbarum) leaves on growth performance, serum biochemical and antioxidant indexes and plasma metabolome of rats. Twenty-five healthy male SD rats were selected and randomly divided into five groups with five rats according to the principle of similar body weight, and each rat as one replicate. The rats in NC group (control group) were fed a basal diet, and those in PC group (L. barbarum fruit positive control group) were fed the basal diet with 4 g/kg BW of L. barbarum fruit homogenate by gavage, while rats in LD, MD and HD groups (L. barbarum leaves test groups) were fed the basal diet with 2, 4 and 8 g/kg BW of L. barbarum leaves homogenate, respectively. The pre-testing period was 7 d, and the formal test period was 28 d. The results showed as follows: 1) LD group had the highest final weight (338.63 g) and average weight gain (6.25 g/d), which significantly higher than those in the NC, PC and MD groups (P<0.05). 2) With the increase of L. barbarum leaves homogenate gavage dose, serum albumin/globulin (A/G) in HD group was the lowest, and significantly lower than that in other groups (P<0.05). 3) Compared with other groups, serum total antioxidant capacity in LD group was significantly increased (P<0.05), and it decreased significantly with the increase of L. barbarum leaves homogenate gavage dose (P<0.05). 4) A total of 31 differential metabolites were screened by plasma metabolomics analysis, main enrichment the metabolic pathways of arachidonic acid metabolism, purine metabolism, amino acid metabolism, and nicotinate and nicotinamide metabolism, etc. In summary, L. barbarum leaves can improve the growth performance of model animal rats, it may regulate antioxidant capacity and immune function through metabolic pathways such as arachidonic acid and amino acids and intermediate metabolites. Under the conditions of this experiment, the gavage dose of L. barbarum leaves homogenate with 2 g/kg BW has the better effect.

Key words： Lycium barbarum leaves; functional feed; Lycium barbarum polysaccharide; model animal; immune; antioxidant; metabolome

枸杞(Lycium barbarum L.)为管状花目茄科枸杞属的一种落叶灌木,是中国传统的中草药,也是一种食品补充剂[1]。枸杞果实具有提高机体生长性能、抗氧化能力,改善免疫力的功能[2-3],并具有抗菌、抗炎及保护细胞等作用[4]。枸杞叶是枸杞种植产业中常见的副产物,有研究表明,枸杞叶无论在功能性成分、营养成分还是微量元素方面,都与枸杞果实很相近,并含有枸杞多糖(LBP)、黄酮类化合物及甜菜碱等活性成分,有些活性成分的含量甚至比枸杞果实还要高,具有很高的营养保健功效[5]。研究显示,LBP、甜菜碱及黄酮类化合物是枸杞叶的主要功能性成分[6]。Long等[7]研究发现,饲粮中添加LBP可以显著提高肉鸡的平均日增重,进而提高生长性能。Yang等[8]研究发现,饲粮中添加甜菜碱可提高育肥猪的生长性能。血清生化指标能及时地反映动物的生理机能,在正常范围的前提下,相对较高的水平预示着动物体代谢功能旺盛[9]。Liu等[10]研究发现,在饲粮中添加8 g/kg LBP可增加肉鸡血清中总蛋白、球蛋白及白蛋白的含量。奴尔古扎力·艾热提等[11]研究显示,在肉鸡饲粮中添加一定量的LBP,血清中谷草转氨酶活性与对照组相比无显著差异。研究显示,植物多糖具有抗氧化能力[12]。尹业鑫等[13]在断奶大鼠饲粮中添加LBP,结果表明,LBP组血清中总抗氧化能力与谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著提高,丙二醛含量显著降低。代谢组学依赖于高通量分析技术,通过定性、定量分析研究细胞或生物体的代谢特征和功能调控,为评价饲粮相关综合代谢提供了独特的视角[14]。代谢组学已广泛应用于动物营养学研究中,通过代谢组学技术可揭示营养代谢过程、代谢通路及作用机理,为营养精准调控提供科学依据[15-16]。虽然目前有关枸杞叶主要单一活性成分的生理功能研究较多,但对枸杞叶在动物生长、生理及代谢组方面的研究报道较少,不利于枸杞叶饲料资源化利用[6]。枸杞叶营养物质及生理功能研究对其作为新型饲料添加剂及拓展饲草来源具有重要意义[17]。大鼠作为模式动物具有可重复性高、稳定性好、成本低及试验周期短等优势。因此,本试验拟以大鼠为模式动物,探究枸杞叶对动物生长性能、血清生化与抗氧化指标及血浆代谢组的影响,为枸杞叶作为饲料添加剂的开发和利用提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用雄性SD大鼠,购自陕西诺优生物科技有限公司;大鼠基础饲粮为商品饲粮(主要营养成分含量的分析值为:水分10%、粗蛋白质18%、粗脂肪4%、粗纤维5%、粗灰分8%、钙1.0%~1.8%、磷0.6%~1.2%);枸杞叶及枸杞果实均于2022年7月在宁夏回族自治区中卫市中宁县采摘,将采摘的新鲜枸杞叶及枸杞果实用打磨机制成匀浆(将720 g枸杞叶或枸杞果实打磨后,分别溶至1 L蒸馏水中制备成匀浆,其浓度为0.72 g/mL),4 ℃低温保存备用。枸杞叶及枸杞果实中常规营养成分和功能性成分含量见表1。
表1 枸杞叶及枸杞果实中常规营养成分和功能性成分含量(干物质基础)

Table 1 Contents of conventional nutritional components and functional components in Lycium barbarum leaves and fruits (DM basis)[18⇓-20]%

项目Items 枸杞叶Lycium barbarum leaves 枸杞果实Lycium barbarum fruits
常规营养成分Conventional nutritional components
粗蛋白质CP 27.80 13.79
粗脂肪EE 1.10 2.23
中性洗涤纤维NDF 31.07 10.29
酸性洗涤纤维ADF 13.33 10.58
粗灰分Ash 17.83 13.95
功能性成分Functional components
多糖Polysaccharide 9.56 2.93
黄酮Flavonoid 1.32 0.02
甜菜碱Betaine 1.36 1.11

1.2 试验设计及饲养管理

选取健康雄性SD大鼠(6周龄)25只,按体重相近原则随机分成5组,每组5个重复,每个重复1只。其中对照组(NC组)饲喂基础饲粮,枸杞果实阳性对照组(PC组)在饲喂基础饲粮基础上灌服4 g/kg BW的枸杞果实匀浆,枸杞叶试验组在饲喂基础饲粮基础上分别按照2(LD组)、4(MD组)和8 g/kg BW(HD组)的剂量灌服枸杞叶匀浆。大鼠饲养试验在宁夏大学实验动物房内完成,实验房内自然采光、干燥、通风。于每天08:00和19:00分别灌服1次[NC组、PC组、LD组、MD组、HD组每次每只大鼠灌服量分别为1.0(生理盐水)、1.0、0.5、1.0、2.0 mL],共灌服35 d,在适应性饲养7 d后进入正式试验,正试期为28 d。试验期间大鼠采用自由采食和饮水,按照常规程序进行饲养管理。

1.3 样品采集

试验结束禁食12 h后,对25只大鼠进行麻醉,待大鼠处于昏迷状态时,对大鼠进行心脏采血。将采集的血液静置2 h后在4 ℃、3 000 r/min的离心机中离心15 min,将分离出的血清分装到EP管中,-20 ℃冷冻保存,用于血清生化和抗氧化指标的测定。用采血针采集大鼠的心脏血液样品,装入抗凝管中,静置2 h后在4 ℃、3 000 r/min的离心机中离心15 min,将分离出的血浆装入冻存管中,-80 ℃冷冻保存备用。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能的测定

每只大鼠作为1个单位。试验第1天对大鼠进行称重,作为初重;第28天进行第2次称重,作为终重;记录大鼠每天的饲喂量及剩料重,计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。

平均日增重=(末重-初重)/试验天数;

平均日采食量=饲养期耗料量/试验天数;

料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.4.2 血清生化指标的测定

将制备好的血清送至宁夏迪安乐嘉医学检验中心有限公司,测定血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)含量及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,并计算白球比(A/G)。以上指标测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,所有试验操作步骤均参考试剂盒说明书。

1.4.3 血清抗氧化指标的测定

将制备好的血清送至宁夏昊标检测服务研究院(有限公司),检测血清中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性与总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量。以上指标均采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒进行测定,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,操作步骤参考试剂盒说明书。

1.4.4 血浆代谢组的测定

将制备好的血浆用干冰低温送至武汉迈维生物科技有限公司基于超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)代谢组学技术检测代谢物。首先将血浆样本从-80 ℃冰箱取出,于冰上解冻、涡旋、混匀分装至离心管中,加入20%乙腈甲醇内标提取液、涡旋,4 °C下12 000 r/min离心10 min,上清液移至新的离心管中,-20 ℃静置30 min;上清液12 000 r/min、4 ℃条件下再离心3 min,取上清液到进样瓶内衬管中,用于UPLC-MS/MS分析。

1.5 数据处理与分析

原始数据用Excel 2016进行处理,运用SPSS 26.0统计软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行方差分析,差异显著时采用Duncan氏法进行组间多重比较,结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,以P<0.05为差异显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 枸杞叶对大鼠生长性能的影响

由表2可知,5组大鼠的初重无显著差异(P>0.05),但LD组大鼠的末重和平均日增重显著高于NC组、MD组和PC组(P<0.05)。此外,灌服枸杞果实和枸杞叶匀浆对大鼠的平均日采食量及料重比均无显著影响(P>0.05)。
表2 枸杞叶对大鼠生长性能的影响

Table 2 Effects of Lycium barbarum leaves on growth performance of rats

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
NC PC LD MD HD
初重IW/g 176.09 177.77 176.14 177.64 176.26 0.32 0.217
末重FW/g 294.96b 307.04b 338.63a 298.82b 313.12ab 5.10 0.035
平均日增重ADG/(g/d) 4.57b 4.97b 6.25a 4.66b 5.26ab 0.20 0.032
平均日采食量ADFI/(g/d) 34.31 35.96 32.34 34.54 32.68 0.76 0.662
料重比F/G 7.51 7.60 5.24 7.54 6.22 0.38 0.217

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表3、表4同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 3 and Table 4.

2.2 枸杞叶对大鼠血清生化指标的影响

由表3可知,灌服枸杞叶和枸杞果实匀浆对大鼠血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及天门冬氨酸氨基转移酶活性均无显著影响(P>0.05),但HD组血清中白球比显著低于NC组、PC组和LD组(P<0.05)。
表3 枸杞叶对大鼠血清生化指标的影响

Table 3 Effects of Lycium barbarum leaves on serum biochemical indexes of rats

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
NC PC LD MD HD
总蛋白TP/(g/L) 62.73 64.67 69.40 67.30 63.90 1.18 0.456
白蛋白ALB/(g/L) 45.87 48.90 50.73 48.15 42.75 1.05 0.105
球蛋白GLB/(g/L) 16.87 15.77 18.67 19.15 21.15 0.72 0.119
白球比A/G 2.70ab 3.10a 2.73ab 2.53bc 2.08c 0.11 0.014
天门冬氨酸氨基转移酶AST/(U/L) 142.33 146.33 154.67 194.00 187.25 12.34 0.589

2.3 枸杞叶对大鼠血清抗氧化指标的影响

由表4可知,灌服枸杞叶和枸杞果实匀浆对大鼠血清中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量均无显著影响(P>0.05),但LD组血清总抗氧化能力显著高于其他组(P<0.05),且随枸杞叶匀浆灌服剂量的升高,血清总抗氧化能力显著下降(P<0.05)。
表4 枸杞叶对大鼠血清抗氧化指标的影响

Table 4 Effects of Lycium barbarum leaves on serum antioxidant indexes of rats

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
NC PC LD MD HD
总抗氧化能力T-AOC/(U/mL) 6.29c 4.23c 26.15a 16.82b 4.36c 2.50 <0.001
过氧化氢酶CAT/(U/mL) 5.38 5.77 4.38 4.43 4.98 0.26 0.365
丙二醛MDA/(nmol/mL) 4.06 3.59 4.39 5.27 5.73 0.34 0.293
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U/mL)		 1 268.60 1 131.40 1 120.93 1 126.75 1 230.23 24.04 0.150
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) 90.59 86.59 83.45 82.73 82.25 1.39 0.211

2.4 枸杞叶对大鼠血浆代谢组的影响

2.4.1 代谢物鉴定

基于代谢数据库,对样品代谢物进行质谱定性定量分析。多反应监测(MRM)模式代谢物展示了样本中能够检测到的物质。基于广泛靶向代谢组学技术的代谢分析,在大鼠血浆中共检测到1 044个代谢物。如图1所示,这些代谢物主要分为氨基酸及其代谢物、有机酸及其衍生物、脂肪酰类、核苷酸及其代谢物、甘油磷脂类、杂环化合物、碳水化合物及其代谢物等16个类别。
图1 代谢物类别组成环形图

Alcohol and amines:酒精和胺类;Aldehyde, ketones, esters:醛、酮、酯类;Amino acid and its metabolites:氨基酸及其代谢物;Benzene and substituted derivatives:苯和取代衍生物;Bile acids:胆汁酸;Carbohydrates and its metabolites:碳水化合物及其代谢物;Coenzyme and vitamins:辅酶和维生素;Fatty acyls:脂肪酰类;Glycerophospholipids:甘油磷脂类;Heterocyclic compounds:杂环化合物;Hormones and hormone related compounds:激素和激素相关化合物;Nucleotide and its metabolites:核苷酸及其代谢物;Organic acid and its derivatives:有机酸及其衍生物;Others:其他;Sphingolipids:鞘脂类;Tryptamines, cholines, pigments:色胺、胆碱、色素。

Fig.1 Circular diagram of metabolite class composition

2.4.2 血浆样本的主成分分析

本试验中PC组、LD组、MD组、HD组分别与NC组相比,进行无监督模式识别的多维数据统计分析方法,通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量,即主成分分析(PCA),结果如图2所示。根据PCA图可以看出,PC组、LD组、MD组、HD组均与NC组区分较明显,各组数据点基本都聚在一起,说明试验误差小,数据的可靠性较高。
图2 主成分分析图

Fig.2 PCA diagram

2.4.3 差异代谢物筛选、KEGG注释及通路分析

进一步利用变量投影重要性(VIP)和差异倍数(FC)进行差异代谢物的筛选,选取VIP≥1及FC≥2和FC≤0.5的代谢物,得到具有显著性差异的潜在生物标志物。由表5和图3可知,NC组与PC组相比,共筛选出16种代谢物具有对应的KEGG注释,上调的有花生四烯酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸盐、顺式-4-羟基-D-脯氨酸、L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸及溶血磷脂酰胆碱(O-18∶0/0∶0),下调的有11,12-双羟基-5Z,8Z,14Z-二十二碳三烯酸、(±)15-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸、8,9-双羟基-5Z,11Z,14Z-二十二碳三烯酸、血栓素B2、D-鸟氨酸、α-酮戊二酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、环状ADP核糖、L-鸟氨酸及精胺,涉及到的代谢通路主要有ko00590(花生四烯酸代谢)、ko04726(5-羟色胺能突触)、ko00470(D-氨基酸代谢)、ko00565(乙醚脂质代谢)、ko04921(催产素信号通路)、ko00330(精氨酸和脯氨酸代谢);NC组与LD组相比,共筛选出5种代谢物具有对应的KEGG注释,上调的有溶血磷脂酰胆碱(O-18∶0/0∶0)和花生四烯酸,下调的有sn-甘油-3-磷酸胆碱、(±)15-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸和血栓素B2,涉及到的代谢通路主要有ko00565(乙醚脂质代谢)和ko00590(花生四烯酸代谢);NC组与MD组相比,共筛选出5种代谢物具有对应的KEGG注释,上调的有4-二氢-1-甲基-4-氧代-3-吡啶甲酰胺、6-羟基-3-琥珀酰吡啶、N'-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺,下调的有(±)15-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸和血栓素B2,涉及到的代谢通路主要有ko00760(烟酸和烟酰胺代谢)和ko00590 (花生四烯酸代谢);NC组与HD组相比,共筛选出17种代谢物具有对应的KEGG注释,上调的有溶血磷脂酰胆碱(O-18∶0/0∶0)、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸盐、顺式-4-羟基-D-脯氨酸、L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、顺式-L-3-羟基脯氨酸、5'-腺苷酸硫酸(APS)、二磷酸腺苷、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)和胸腺嘧啶脱氧核苷,下调的有sn-甘油-3-磷酸胆碱、5'-单磷酸-2'-脱氧腺苷、D-鸟氨酸、L-鸟氨酸、亚精胺、腺苷和鸟嘌呤,涉及到的代谢通路主要有ko00565(乙醚脂质代谢)、ko00470(D-氨基酸代谢)、ko00330(精氨酸和脯氨酸代谢)、ko00230(嘌呤代谢)及ko01232(核苷酸代谢)。由上述内容可知,涉及的差异代谢物主要分为脂肪酰类、氨基酸及其代谢物、杂环化合物及有机酸及其衍生物,代谢通路包括花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢、乙醚脂质代谢及5-羟色胺能突触等。
表5 差异代谢物KEGG代谢通路富集分析

Table 5 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathways of differential metabolites

项目
Items		 代谢物
Metabolites		 物质一
级分类		 差异倍数
FC		 变量投影
重要性
VIP		 类型
Type		 通路号
Pathway ID
NC组vs
PC组
NC group vs
PC group		 11,12-双羟基-5Z,8Z,
14Z-二十二碳三烯酸		 脂肪酰类 0.31 1.36 下调 ko00590、ko01100、ko04726
(±)15-羟基-5Z,8Z,
11Z,13E-二十碳四烯酸		 脂肪酰类 0.16 1.72 下调 ko00590、ko04750
8,9-双羟基-5Z,11Z,
14Z-二十二碳三烯酸		 脂肪酰类 0.31 1.36 下调 ko00590、ko01100、ko04726
花生四烯酸 脂肪酰类 2.02 2.02 上调 ko00590、ko00591、ko01040、ko01100、
ko04216、ko04217、ko04270、ko04611、
ko04664、ko04666、ko04723、ko04726、
ko04730、ko04745、ko04750、ko04912、
ko04913、ko04921、ko04923、
ko04925、ko05140、ko05146
血栓素B2 脂肪酰类 0.02 1.97 下调 ko00590、ko01100、
ko04726、ko04976
1-吡咯啉-4-羟基-
2-羧酸盐		 杂环化合物 3.54 1.23 上调 ko00470、ko01100
顺式-4-羟基-
D-脯氨酸		 氨基酸
及其代谢物		 10 322 869.30 1.90 上调 ko00470、ko01100
D-鸟氨酸 氨基酸及
其代谢物		 0.31 1.64 下调 ko00470、ko01100
L-脯氨酸 氨基酸及
其代谢物		 874.77 2.25 上调 ko00330、ko00470、ko00970、
ko01100、ko01230、ko02010、
ko04974、ko04978、ko05230
反式-4-羟基-
L-脯氨酸		 氨基酸及
其代谢物		 10 322 869.30 1.90 上调 ko00330、ko00470、
ko01100、ko02010
α-酮戊二酸 有机酸及
其衍生物		 0.45 1.86 下调 ko00020、ko00040、ko00053、ko00220、
ko00250、ko00300、ko00310、ko00340、
ko00430、ko00470、ko00630、ko00650、
ko00660、ko01100、ko01200、
ko01210、ko01230、ko01240、
ko04066、ko04727、ko04922、
ko04964、ko04976、ko05230
溶血磷脂酰胆碱
(O-18∶0/0∶0)		 甘油磷脂类 510 704.21 2.31 上调 ko00565、ko01100
sn-甘油-3-
磷酸胆碱		 色胺、胆碱、
色素		 0.20 1.19 下调 ko00564、ko00565、ko05231
环状ADP核糖 核苷酸及
其代谢物		 0.26 1.35 下调 ko04020、ko04921、
ko04970、ko04972
L-鸟氨酸 氨基酸及
其代谢物		 0.34 1.78 下调 ko00220、ko00330、ko00470、
ko00480、ko01100、ko01210、
ko01230、ko02010
精胺 醇、胺类 0.11 1.27 下调 ko00330、ko00410、ko00480、
ko00770、ko01100、ko01240、
ko04976
NC组vs
LD组
NC group vs
LD group		 溶血磷脂酰胆碱
(O-18∶0/0∶0)		 甘油磷脂类 506 137.30 2.22 上调 ko00565、ko01100
sn-甘油-3-
磷酸胆碱		 色胺、胆碱、
色素		 0.33 1.18 下调 ko00564、ko00565、ko05231
(±)15-羟基-5Z,
8Z,11Z,13E-
二十碳四烯酸		 脂肪酰类 0.12 1.80 下调 ko00590、ko04750
花生四烯酸 脂肪酰类 2.19 1.67 上调 ko00590、ko00591、ko01040、ko01100、
ko04216、ko04217、ko04270、ko04611、
ko04664、ko04666、ko04723、ko04726、
ko04730、ko04745、ko04750、ko04912、
ko04913、ko04921、ko04923、
ko04925、ko05140、ko05146
血栓素B2 氧化脂质 0.05 1.68 下调 ko00590、ko01100、
ko04726、ko04976
NC组vs
MD组
NC group vs
MD group		 4-二氢-1-甲
基-4-氧代-3-
吡啶甲酰胺		 杂环化合物 4.07 2.05 上调 ko00760、ko01100
6-羟基-3-
琥珀酰吡啶		 杂环化合物 12.44 1.19 上调 ko00760、ko01100
N'-甲基-2-吡
啶酮-5-甲酰胺		 杂环化合物 3.07 2.11 上调 ko00760、ko01100
(±)15-羟基-5Z,
8Z,11Z,13E-
二十碳四烯酸		 脂肪酰类 0.49 1.33 下调 ko00590、ko04750
血栓素B2 脂肪酰类 0.33 1.30 下调 ko00590、ko01100、
ko04726、ko04976
NC组vs
HD组
NC group vs
HD group		 溶血磷脂酰胆碱
(O-18∶0/0∶0)		 甘油磷脂类 544 983.33 2.35 上调 ko00565、ko01100
sn-甘油-3-
磷酸胆碱		 色胺、胆碱、
色素		 0.44 1.14 下调 ko00564、ko00565、ko05231
5'-单磷酸-2'-
脱氧腺苷		 核苷酸及
其代谢物		 0.38 1.66 下调 ko00230、ko01100、ko01232
1-吡咯啉-4-羟
基-2-羧酸盐		 杂环
化合物		 7.58 1.46 上调 ko00470、ko01100
顺式-4-羟基-
D-脯氨酸		 氨基酸及
其代谢物		 13 006 403.04 2.34 上调 ko00470、ko01100
D-鸟氨酸 氨基酸及
其代谢物		 0.33 1.60 下调 ko00470、ko01100
L-鸟氨酸 氨基酸及
其代谢物		 0.38 1.70 下调 ko00220、ko00330、ko00470、
ko00480、ko01100、ko01210、
ko01230、ko02010
L-脯氨酸 氨基酸及
其代谢物		 871.91 2.31 上调 ko00330、ko00470、ko00970、
ko01100、ko01230、ko02010、
ko04974、ko04978、ko05230
反式-4-羟基-
L-脯氨酸		 氨基酸及
其代谢物		 13 006 403.04 2.34 上调 ko00330、ko00470、
ko01100、ko02010
顺式-L-3-
羟基脯氨酸		 氨基酸及
其代谢物		 13 006 403.04 2.34 上调 ko00330
亚精胺 醇、胺类 0.48 2.07 下调 ko00330、ko00410、ko00480、
ko01100、ko02010、ko04976
5'-腺苷
酸硫酸		 核苷酸及
其代谢物		 2.47 1.60 上调 ko00230、ko00261、
ko00920、ko01100
腺苷 核苷酸及
其代谢物		 0.21 1.49 下调 ko00230、ko01100、ko01232、ko02010、
ko04022、ko04024、ko04071、ko04080、
ko04270、ko04923、ko04924、
ko05012、ko05032、ko05034
二磷酸腺苷 核苷酸及
其代谢物		 2.02 1.42 上调 ko00190、ko00230、ko01100、ko01232、
ko01240、ko04068、ko04080、ko04142、
ko04152、ko04611、ko04714、
ko04742、ko04924、ko05012、
ko05014、ko05022
脱氧鸟苷
二磷酸		 核苷酸及
其代谢物		 2.02 1.42 上调 ko00230、ko01100、ko01232
鸟嘌呤 核苷酸及
其代谢物		 5.76 1.91 下调 ko00230、ko01100、ko01232
胸腺嘧啶
脱氧核苷		 核苷酸及
其代谢物		 2.29 1.82 上调 ko00240、ko01100、ko01232
图3 差异代谢物KEGG代谢通路富集图

Arachidonic acid metabolism:花生四烯酸代谢;Serotonergic synapse:血清素能突触;D-amino acid metabolism:D-氨基酸代谢;Ether lipid metabolism:乙醚脂质代谢;Oxytocin signaling pathway:催产素信号通路;Arginine and proline metabolism:精氨酸和脯氨酸代谢;Linoleic acid metabolism:亚油酸代谢;Arginine biosynthesis:精氨酸生物合成;C5-branched dibasic acid metabolism:C5支链二元酸代谢;Inflammatory mediator regulation of TRP channels:TRP通道的炎症介质调节;Leishmaniasis:利什曼病;Necroptosis:坏死性凋亡;Phototransduction-fly:光转导-飞;Citrate cycle (TCA cycle):柠檬酸盐循环(TCA循环);Pentose and glucuronate interconversions:戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化;Lysine degradation:赖氨酸降解;Glyoxylate and dicarboxylate metabolism:乙醛酸和二羧酸代谢;Bile secretion:胆汁分泌;Metabolic pathways:代谢途径;Folate biosynthesis:叶酸生物合成;Biosynthesis of cofactors:辅因子的生物合成;Primary bile acid biosynthesis:原代胆汁酸生物合成;Tryptophan metabolism:色氨酸代谢;Nicotinate and nicotinamide metabolism:烟酸和烟酰胺代谢;Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species:化学致癌-活性氧;Fatty acid degradation:脂肪酸降解;Pancreatic secretion:胰腺分泌物;Caffeine metabolism:咖啡因代谢;Calcium signaling pathway:钙信号通路;Salivary secretion:唾液分泌;Cholesterol metabolism:胆固醇代谢;Tyrosine metabolism:酪氨酸代谢;Starch and sucrose metabolism:淀粉和蔗糖代谢;Purine metabolism:嘌呤代谢;Renin secretion:肾素分泌;Alpha-linolenic acid metabolism:α-亚麻酸代谢;Tryptophan metabolism:色氨酸代谢;Beta-alanine metabolism:β-丙氨酸代谢;AMPK signaling pathway:AMPK信号通路;Lysosome:溶酶体;Oxidative phosphorylation:氧化磷酸化;Platelet activation:血小板活化;ABC transporters:ABC转运蛋白。

Fig.3 Enrichment map of KEGG metabolic pathways of differential metabolites

3 讨论

3.1 枸杞叶对大鼠生长性能的影响

动物生长性能是实际生产性能关注的焦点之一,动物的平均日增重能够反映动物机体的生长情况[21]。本试验结果显示,灌服2 g/kg BW枸杞叶匀浆显著提高了大鼠的末重和平均日增重。Long等[10]在肉鸡饲粮中分别添加不同水平的LBP,结果发现2 000 mg/kg LBP可以显著提高肉鸡的平均日增重,提高肉鸡的生长性能。Zhang等[22]研究发现,在饲粮中添加LBP可以显著提高尼罗罗非鱼的生长速率、相对长度和相对体重增加,促进生长。Yang等[8]研究表明,饲粮中添加甜菜碱可提高育肥猪的生长性能。本试验结果与上述结果一致,说明大鼠生长性能的提高可能与枸杞叶中的LBP和甜菜碱有关;此外,相关研究表明,枸杞叶中LBP和甜菜碱的含量高于枸杞果实,具有较高的功能开发潜力[18,20]。

3.2 枸杞叶对大鼠血清生化指标的影响

血清生化指标广泛用于评估动物的健康、代谢和营养状况[23]。血清总蛋白包含白蛋白和球蛋白,由肝脏合成,在一定程度上反映了饲粮中蛋白质的营养水平和动物对蛋白质的消化吸收程度[24]。血清白蛋白和球蛋白含量与机体内蛋白质代谢直接相关,球蛋白含量还与机体免疫功能有一定关系[25]。有研究表明,LBP通过增加免疫调节分子白细胞介素-2(IL-2)等表达,从而改善免疫应答并增加机体的体液免疫[26]。白球比可作为评价动物机体免疫能力的指标[27]。郑梦荷等[28]在饲粮中分别添加不同水平的LBP,结果表明LBP对犊牛血清中总蛋白含量无显著影响。刘亚娟等[29]在獭兔饲粮中添加LBP后发现,獭兔血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白含量均无显著变化。本试验中,灌服剂量的枸杞叶匀浆对大鼠血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白含量均无显著影响,与上述研究结果一致。天门冬氨酸氨基转移酶是参与氨基酸代谢的重要酶类[30],其主要存在于肝细胞中,正常情况下随细胞凋亡进入血液,应激时肝脏功能受损会导致肝细胞膜通透性升高,从而加快胞内酶进入血液的速度,使血液中天门冬氨酸氨基转移酶的活性升高[31]。奴尔古扎力·艾热提等[11]研究表明,在肉鸡饲粮中添加一定量的LBP,肉鸡血清中天门冬氨酸氨基转移酶活性无显著变化,本试验结果与此一致,说明枸杞叶对大鼠肝脏功能未产生不良影响。一般认为大鼠血清总蛋白含量正常范围在61.5~72.5 g/L,白蛋白含量在35.6~40.0 g/L,球蛋白含量为25.3~33.1 g/L,白球比在1.20~1.50[32]。本试验中大鼠血清球蛋白含量略低于正常范围,导致白球比均高于正常范围,而随着枸杞叶匀浆灌服剂量的升高,白球比趋于正常范围,说明高剂量的枸杞叶有助于改善机体的免疫能力。

3.3 枸杞叶对大鼠抗氧化能力的影响

枸杞叶中的活性成分可以清除机体内多种活性氧自由基,提高机体中的多种抗氧化酶的活性,降低体内多种生物分子的氧化[33]。机体内的抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等,它们互相协作使自由基在体内处于动态平衡,抗氧化酶活性的高低对衡量活性物质的抗氧化能力具有重要的意义[34]。研究表明,枸杞叶中的多糖和黄酮是主要潜在的抗氧化物质[35],枸杞叶黄酮清除自由基的能力与维生素C相当[36]。总抗氧化能力能在一定程度上反映机体遭受过氧化损伤的程度,是衡量动物机体抗氧化能力的综合指标,本试验结果显示,灌服2 g/kg BW枸杞叶匀浆显著提高了大鼠血清的总抗氧化能力。Chen等[27]在断奶仔猪饲粮中添加LBP,结果表明仔猪的血清总抗氧化能力显著升高,与本试验结果一致。超氧化物歧化酶的抗氧化指数对清除活性氧自由基有很强的作用,过氧化氢酶提供抗氧化防御和保护[37-38]。谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,通过清除超氧阴离子保护机体组织细胞免受氧化损伤[39]。脂质过氧化物分解代谢产生丙二醛,其含量可用于评估脂质过氧化程度[40]。本试验结果显示,灌服不同剂量的枸杞叶匀浆对大鼠血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛含量均无显著影响。Niu等[41]的研究发现,枸杞叶黄酮含量达909.84 mg/g,是天然的抗氧化物质,可通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径激活靶基因以减轻氧化损伤。白敏等[42]对雌性小鼠连续灌胃7周的枸杞叶多糖,结果发现高剂量(150 mg/kg)枸杞叶多糖可升高小鼠血浆中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低丙二醛的含量,与本试验结果不一致,其原因可能与动物种类及枸杞叶多糖的剂量等相关。

3.4 枸杞叶对大鼠血浆代谢组的影响

代谢组学是使用高通量技术对生物样品中的小内源性代谢物进行检测,可以揭示生物反应过程以及代谢通路中的代谢规律[43]。本试验通过对NC组与PC组、NC组与LD组、NC组与MD组及NC组与HD组血浆样品进行广泛靶向代谢组分析,分析差异代谢物的类型主要包括脂肪酰类、氨基酸及其代谢物、核苷酸及其代谢物、杂环化合物及色胺、胆碱、色素等。作为底物或中间代谢产物,它们参与多种体内代谢,代谢途径主要包括花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢及烟酸和烟酰胺代谢等。

3.4.1 枸杞叶对花生四烯酸代谢通路的影响

花生四烯酸是一种重要的多不饱和脂肪酸,通过环氧合酶代谢形成不同类型的类花生酸,可以提高机体的抗氧化能力和免疫能力[15,44]。吴金平等[45]的研究表明,饲料中添加花生四烯酸纯化油能够增强子二代中华鲟的抗氧化能力。王成强等[46]的研究表明,刺参饲料中添加适量的花生四烯酸可提高机体的总抗氧化能力,但当花生四烯酸添加过量时,总抗氧化能力呈现逐渐下降的趋势。本试验中,LD和PC组血浆中中间代谢产物花生四烯酸的水平显著上调,LD组总抗氧化能力显著上升,但PC组总抗氧化能力下降,这可能与4 g/kg BW的枸杞果实匀浆导致大鼠血浆代谢产物花生四烯酸的水平过高相关。研究表明,饲粮中添加LBP可以上调血浆代谢组中的花生四烯酸及细胞色素P450的水平,增强机体的抗氧化能力,其实现抗氧化能力增强的机制可能是通过细胞色素P450途径将花生四烯酸代谢为环氧二十碳三烯酸(EET),EET参与调节抗炎及抗氧化等作用[47⇓-49]。Zhao等[50]研究显示,在大鼠中饲粮中添加枸杞叶提取物可上调花生四烯酸代谢通路中的代谢产物,与本试验结果一致,这可能与枸杞叶含有大量活性成分有关。

3.4.2 枸杞叶对嘌呤代谢通路的影响

研究发现,在肉鸡饲粮中添加适量LBP可增强血清中天门冬氨酸氨基转移酶的活性,天门冬氨酸氨基转移酶是肝脏代谢的重要指标,可参与嘌呤代谢过程[11]。Zhang等[51]在小鼠饲粮中添加不同剂量的LBP后发现,与嘌呤代谢相关的代谢物显著下调,与本试验结果一致。嘌呤代谢的最终产物是尿酸[52],尿酸是细胞外液中重要的抗氧化剂,可以清除氧化应激产生的氧自由基,防止衰老[53]。本试验中,大鼠灌服枸杞叶匀浆后,血浆中的代谢物鸟嘌呤、腺苷、5'-单磷酸-2'-脱氧腺苷等显著下调,说明枸杞叶可能通过调节尿酸的生成来防止细胞氧化损伤,从而增强机体的抗氧化能力。Liang等[47]的研究显示,在小鼠饲粮中添加LBP显著上调了辅因子和维生素代谢。烟酸是维生素B复合物,可转化为辅酶的形式参与机体的炎症调控[54]。本试验中,MD组与NC组相比,烟酰胺代谢产物4-二氢-1-甲基-4-氧代-3-吡啶甲酰胺和N'-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺显著上调,说明枸杞叶有助于缓解动物机体中炎症的发生,其原因可能与枸杞叶多糖上调了烟酸和烟酰胺代谢通路的中间代谢产物,提高了机体的免疫功能相关。

3.4.3 枸杞叶对氨基酸代谢通路的影响

氨基酸及代谢产物能够反映蛋白质和氨基酸的吸收代谢状况,与动物的健康状况密切相关[55]。Liang等[47]在小鼠饲粮中添加LBP显著上调了氨基酸代谢通路。卢冬梅[56]研究发现,鸟氨酸对氨态氮的排出及解除氨中毒有重要的作用,在鸟氨酸脱羧酶催化下,生成亚精胺及精胺,或者参与脯氨酸的合成。本试验中,与NC组相比,PC组和HD组血浆中D-鸟氨酸及L-鸟氨酸水平显著下调,而L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸及顺式-4-羟基-D-脯氨酸水平显著上调,这可能是因为部分鸟氨酸分解转化成脯氨酸,导致鸟氨酸的水平下调、脯氨酸的水平上调。脯氨酸在机体内代谢可转化为酪氨酸,枸杞叶黄酮的儿茶酚部位与酪氨酸酶口袋中的铜原子结合,通过抑制酪氨酸酶活性负向调控MAPK信号通路,抑制细胞凋亡因子及炎症因子,衰减过氧化氢(H2O2)引发的细胞凋亡,降低活性氧和丙二醛的产生,提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性,从而提高机体的抗氧化能力[57-58]。脯氨酸是组成蛋白质的重要氨基酸[59],是动物营养中的非必需氨基酸,在营养物质代谢中发挥着许多重要的生理功能[60-61]。研究表明,饲粮中添加适宜水平的脯氨酸可以提高机体的抗氧化能力和免疫能力[62]。荣华等[63]研究发现,饲料中添加脯氨酸有助于提高黄姑鱼的抗氧化能力。本试验中,灌服枸杞叶匀浆提高了大鼠机体的抗氧化能力,其原因可能是枸杞叶中的活性成分枸杞叶多糖及黄酮化合物等通过影响氨基酸代谢途径产生的代谢产物调节动物机体的抗氧化能力及免疫功能。

4 结论

① 枸杞叶可提高大鼠的生长性能,增强机体的免疫功能和抗氧化能力。
② 血浆代谢组学分析表明,枸杞叶可能是通过影响花生四烯酸、嘌呤与氨基酸代谢途径及中间代谢产物调控机体的免疫功能及抗氧化能力。
③ 剂量效应分析表明,枸杞叶匀浆的灌服剂量可影响试验效果,在本试验条件下的推荐枸杞叶匀浆的灌服剂量为2 g/kg BW。

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