在犬精细化喂养的背景下,通过天然药物成分改善机体抗氧化能力和免疫功能是目前犬饲养行业降低疾病发生的有效途径。然而,现阶段行业内缺少从天然药用植物中提取的可有效促进犬免疫系统发育的饲料添加剂或兽药产品。因此,积极寻求预防或治疗效果显著且无副作用的天然药物成分来提高犬的整体性能具有重要意义。黄芩苷(baicalin)是唇形科多年生草本植物黄芩根部的主要活性成分,随着药理学研究的不断深入,发现其具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖的药理活性[1⇓⇓-4]。张顺芬[5]和柴守宏等[6]研究发现,黄芩苷能够显著提升生长猪肠道黏膜损伤的修复能力和抗氧化能力,并且黄芩苷还具有降低炎症因子表达和提高优势菌群相对丰度的效果。许海健等[3]研究也表明,黄芩苷具有抗炎、提高免疫和抗氧化等药理活性,在治疗炎症性肠病方面有很好的功效。然而,黄芩苷作为一种具有优质功效的天然药物成分在犬的饲养中却鲜有研究。因此,基于黄芩苷作为饲料添加剂或兽药产品在饲料中应用的广阔前景,本研究以成年泰迪犬作为试验对象,探究不同剂量的黄芩苷对犬抗氧化能力、肝脏和肾脏功能以及肠道免疫功能的影响,评价其对犬抗氧化能力和免疫功能等方面的调节作用,并确定黄芩苷的适宜添加剂量及实用安全性,为黄芩苷在犬处方类饲料的科学应用提供理论依据和重要参考。
1 材料与方法
1.1 试验设计
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)% |
| 项目 Items | 含量 Content | ||
|---|---|---|---|
| 原料 Ingredients | |||
| 啤酒米 Brewers rice | 21.20 | ||
| 玉米 Corn | 21.40 | ||
| 小麦 Wheat | 21.20 | ||
| 鸡肉副产品粉 Chicken by-product meal | 21.40 | ||
| 鸡油脂 Chicken fat | 5.34 | ||
| 甜菜浆 Beet pulp | 4.00 | ||
| 玉米蛋白粉 Corn gluten meal | 2.39 | ||
| 碳酸钙 CaCO3 | 0.75 | ||
| 氯化钾 KCl | 0.49 | ||
| 氯化钠 NaCl | 0.46 | ||
| 磷酸氢钙 CaHPO4 | 0.87 | ||
| 预混料 Premix1) | 0.50 | ||
| 合计 Total | 100.00 | ||
| 营养水平 Nutrient levels2) | |||
| 干物质 DM | 93.90 | ||
| 粗蛋白质 CP | 21.70 | ||
| 粗脂肪 EE | 12.10 | ||
| 总膳食纤维 TDF | 4.73 | ||
| 粗纤维 CF | 0.68 | ||
| 淀粉 Starch | 46.90 | ||
| 粗灰分 Ash | 7.24 |
1)每千克预混料含有 One kilogram of the premix contained the following:VE 1 450 IU,VA 227 000 IU,VD3 27 800 IU,VB1 122.5 mg,VB2 262.5 mg,VB3 850 mg,VB4 90 mg,VB6 75 mg,VB12 1.85 mg,Fe 1 600 mg,Cu 330 mg,Zn 3 000 mg,Mn 230 mg,I 47 mg,Se 17.5 mg,Ca 19 000 mg,Na 35 000 mg,Cl 60 000 mg,Mg 30 000 mg。 2)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values. |
1.2 饲养管理
试验犬采用单笼饲养,并在试验开始前对试验犬按标准程序进行防疫、驱虫并进行标号。预试期所有试验犬均饲喂基础饲粮,正试期各试验犬分别饲喂对应的试验饲粮。试验期间自由采食和饮水,超过10 min不再进食的情况下结束本次饲喂。每次进食结束40 min后进行自由活动,每次自由活动时间不少于60 min[8]。试验期间定期对试验场所进行冲洗、消毒。
1.3 样品采集及指标测定
1.3.1 饲粮营养水平检测
饲喂前采集饲粮样品200 g,于65 ℃鼓风干燥箱中烘干,全部粉碎后过0.42 mm筛(60目)。测定饲粮干物质(GB/T 6435—2006)、粗蛋白质(GB/T 6432—1994)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗灰分(GB/T 6438—2007)、粗纤维(GB/T 6434—2006)、总膳食纤维(NY/T 1594—2008)以及淀粉(GB 5009.9—2016)含量,每个指标测定2个平行,取平均值。
1.3.2 血清生化和抗氧化指标检测
试验期第30天,饲喂前经前肢头静脉采集所有犬的血液,将5 mL血液置于促凝管中静置30 min后于2 500 r/min离心10 min,分离血清于-20 ℃保存。采用全自动生化分析仪(7600-020,日本日立公司)测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(UN)、总蛋白(TP)含量和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性;按酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)操作说明测定血清肾损伤分子-1(KIM-1)含量;采用免疫比浊法测定血清免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)含量(免疫球蛋白检测试剂盒)。采用比色法测定血清抗氧化指标,包括总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3.3 流式细胞术检测
试验期第30天,每组随机选取2只试验犬,获取其肠道淋巴结样品,对其进行研磨,提取单细胞,取100 μL单细胞悬液,分别加入CD3、CD4、CD8抗体,混匀后于冰上避光孵育20 min,加入1 mL细胞染色缓冲液洗涤2次,100 μL细胞染色缓冲液重悬,通过流式细胞仪检测细胞分群比例。抗原异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD3、别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)-CD4、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-CD8购自美国Biolegend公司。
1.3.4 犬肠道切片检测
试验期第30天,每组随机选取2只试验犬,获取其肠道组织样品,进行甲醛固定(时长1周),双面切取2 cm左右的肠段进行包埋,使用石蜡切片机(KD-3358,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)对包埋好的组织样进行连续切片(厚度4~5 μm),对切片组织进行苏木精-伊红(HE)染色及Toll样受体4(TLR4)蛋白免疫组化染色。
1.4 数据分析
数据采用SAS 9.4的MEANS模块对基本统计量进行分析,采用GLM模块对各组试验犬血清生化和抗氧化指标进行方差分析,以Duncan氏法进行多重比较。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,使用GraphPad Prism 8.0软件制作统计图。
2 结果与分析
2.1 黄芩苷对犬血清生化和抗氧化指标的影响
由图1可见,与对照组相比,高剂量黄芩苷组的血清T-AOC、SOD活性极显著升高(P<0.01),且呈现出剂量依赖性趋势;而血清MDA含量极显著降低(P<0.01)。这表明饲粮中添加20 mg/kg的黄芩苷可以有效提高犬的机体抗氧化能力。在血清生化指标中,各组之间反映肝脏(TP含量和ALT、AST活性)、肾脏功能的指标(Cr、UN、KIM-1含量)没有显著差异(P>0.05)。这表明黄芩苷在增强机体抗氧化能力的同时不会对犬的肝脏、肾脏功能造成影响。
图1 黄芩苷对犬血清生化和抗氧化指标的影响*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01),ns表示差异不显著(P>0.05)。图2同。 Fig.1 Effects of baicalin on serum biochemical and antioxidant indexes of dogs * mean significant different compared with the control group (P<0.05), ** mean extremely significant different compared with the control group (P<0.01), ns mean no significant different (P>0.05). The same as Fig.2. |
2.2 黄芩苷对犬血清免疫指标和肠道淋巴结细胞数量的影响
由图2可见,与对照组相比,高剂量黄芩苷组的血清IgA含量显著升高(P<0.05),血清IgM含量极显著升高(P<0.01),并且二者随着黄芩苷添加剂量的升高而升高。通过比较各组之间肠道淋巴结细胞数量发现,与对照组相比,低剂量黄芩苷组和高剂量黄芩苷组的淋巴结细胞中CD3、CD4、CD8细胞数量增加,且高剂量黄芩苷组的肠道淋巴结细胞中CD4/CD8极显著升高(P<0.01)。这表明黄芩苷可以有效增强犬的肠道免疫功能。
图2 黄芩苷对犬血清免疫指标和肠道淋巴结细胞数量的影响SSC-H:侧向角散射-高度 side scatter-height;FSC-H:前向角散射-高度 forward scatter-height;FSC-A:前向角散射-面积 forward scatter-area;APC-H:APC染料-高度 APC dye-height;PerCP-H:PerCP染料-高度 PerCPdye-height。 Fig.2 Effects of baicalin on serum immune indexes and intestinal lymph node cell numbers of dogs |
2.3 黄芩苷对犬肠道巨噬细胞富集和TLR4蛋白表达的影响
3 讨论
在犬疾病的治疗方案中,使用抗生素等药物治疗会产生抗药性,长期使用不利于机体的健康生长。现阶段,通过天然药物成分增强机体抗氧化能力和免疫功能是犬饲养行业从根源途径预防或降低疾病发生的有效途径。因此,积极寻求预防或治疗效果显著且无副作用的天然药物成分来提高犬的整体性能具有重要意义。黄芩苷作为一种来源广泛、价格相对低廉且具有抗病毒、消炎、无耐药性作用的黄酮类化合物,在预防和治疗肠道炎症、提高免疫力等方面具有较好的药理特性[2-3,5-6]。柴守宏等[6]研究发现,饲粮中添加200~600 mg/kg的黄芩苷能够有效提高育肥猪的免疫功能和抗氧化能力。在肉仔鸡的研究中也呈现出类似的结果,饲粮中添加10 mg/kg的黄芩苷能够显著提高肉仔鸡免疫器官发育和免疫功能,并且能够有效地抑制肠道中大肠杆菌、沙门氏菌的繁殖[9]。因此,本研究选用黄芩苷作为研究对象,根据药物代谢原理及上述案例,以试验动物代谢体重为参考依据,将饲粮中黄芩苷的添加剂量设定为0~20 mg/kg,探讨其对犬抗氧能力和免疫功能等方面的调节作用。
机体内环境中活性氧的动态平衡状态与代谢健康有着密切联系。研究表明,免疫活性增强剂可以增强对虾的免疫功能和抗氧化能力,有效降低疾病的发生[10]。在机体防御体系中,T-AOC的作用主要是清除过高的活性氧,使机体的氧化还原处于相对稳定的状态[11],且SOD、抗超氧阴离子活性的高低可反映出机体内氧自由基的代谢情况及机体的抗氧化能力[12]。在本研究中,高剂量黄芩苷组的试验犬血清T-AOC、SOD活性分别是对照组的1.34、1.42倍,这表明饲粮中添加20 mg/kg的黄芩苷能够有效提高犬的抗氧化能力。其次,血清MDA是脂质过氧化作用的标志性产物之一,其含量的变化既可用作脂质过氧化程度的衡量指标,也可间接反映机体内活性氧的积累[13-14]。本研究中,饲粮中添加高剂量的黄芩苷显著降低了犬血清MDA含量,其降低幅度达到了30.1%。柴守宏等[6]和Jia等[15]也得到了类似的结果,黄芩苷可以提高生长育肥猪和罗非鱼体内T-AOC、SOD活性,降低MDA含量。这进一步表明黄芩苷在提高机体抗氧化能力方面具有明显的药理特性和动物普适性。
动物体内B淋巴细胞和T淋巴细胞共同组成了机体的免疫系统[16]。其中,B淋巴细胞分化产生免疫球蛋白,在致病菌或者病毒等抗原入侵时,可转化为抗体产生各类免疫反应抵抗抗原[17]。在一定范围内,体内免疫球蛋白含量越高,则表明机体抵抗抗原的能力越强。在本试验中,饲粮中添加黄芩苷提高了犬血清IgA、IgM含量,并且血清IgA、IgM含量与黄芩苷的添加剂量呈现出二次增加趋势。这与Hu等[18]研究结果一致,即黄芩苷显著提高了犊牛体内免疫球蛋白含量。T淋巴细胞作为调节机体免疫应答中适应性免疫的主要效应细胞[19],按表型不同可分为CD4细胞与CD8细胞两大亚群,CD4细胞可协助B细胞进行分化,参与细胞免疫,CD8细胞则对病原体具有杀伤和抑制作用。研究表明,在一定范围内,CD4/CD8与免疫功能呈正相关[20]。本研究利用流式细胞术标记了免疫细胞膜上的特异性受体,以此来区别淋巴细胞中CD4和CD8细胞数量,结果显示,黄芩苷能够促进犬T淋巴细胞的分化,且呈现出免疫细胞偏向CD4细胞分化的趋势。由此可见,黄芩苷在机体免疫调节方面具有明显的药理特性。此外,肠道作为机体与外界环境接触最为密切的部位,不仅是消化和吸收的主要部位,也是体内最大的免疫器官[21]。杨智仁等[22]研究发现,提高肠道免疫细胞数量和免疫球蛋白含量可以增加肠道的免疫功能,维护肠道健康。其中,巨噬细胞作为机体免疫细胞的重要组成部分,具有吞噬病原体、呈递抗原的作用[23]。TLR4广泛分布于肠道免疫细胞内,并在肠道固有免疫和适应性免疫系统中扮演着重要的角色,可在多种免疫细胞中表达[24]。本研究肠道切片结果显示,黄芩苷提高了肠道组织中巨噬细胞的富集以及促进了免疫细胞中TLR4蛋白的表达。这与Chen等[4]研究结果类似,黄芩苷与TLR4结合可直接抑制直肠癌细胞中的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路,降低肠道癌症转移性复发的几率。由此可见,黄芩苷在预防和治疗肠道炎症方面具有显著的免疫功能。
安全性高且副作用小是药物成分能够满足商业化推广的前提。本研究测定了犬的肝脏、肾脏功能指标,发现饲喂补充黄芩苷饲粮的犬血清反映肝脏(TP含量及ALT、AST活性)、肾脏功能的指标(Cr、UN、KIM-1含量)与对照组没有显著差异。由此可见,在本试验条件下,饲粮中添加20 mg/kg黄芩苷不会对犬的肝脏、肾脏代谢过程产生额外负担,这与近年来药理试验证明黄芩苷具有良好的生物活性和低不良反应结果[1,25]一致。此外,本研究结果表明犬血清中抗炎(T-AOC、SOD活性)、免疫功能(IgA、IgM含量和CD4/CD8)等指标均呈现出剂量依赖性趋势,但本文并未针对更高剂量(>20 mg/kg)的黄芩苷在犬的健康与免疫方面展开研究。从目前的研究结果推测,高剂量的黄芩苷在犬肠道炎症的治疗方面会有所帮助,但具体的添加剂量有待进一步研究。
4 结论
① 饲粮中添加20 mg/kg的黄芩苷能够提高犬血清T-AOC、SOD活性,抑制MDA的产生,从而提高犬的抗氧化能力,且不会对犬的肝脏、肾脏代谢产生额外负担。
② 饲粮中添加20 mg/kg的黄芩苷能够提高犬血清IgA、IgM含量,增加肠道淋巴结细胞中CD3、CD4、CD8数量和巨噬细胞富集以及TLR4蛋白表达,从而有效地增强犬的肠道免疫功能。
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