动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2475 - 2486

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.213

研究论文

不同比例发酵饲料桑替代基础饲粮对肉牛瘤胃发酵、瘤胃细菌与真菌菌群结构的影响

  • 樊启文 ,
  • 陈芳 ,
  • 杜恩存 ,
  • 陶文静 ,
  • 赵娜 ,
  • 黄少文 ,
  • 郭万正 ,
  • 黄静 ,
  • 金枫 ,
  • 魏金涛
展开
  • 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,武汉 430064
*魏金涛,副研究员,E-mail:

樊启文(1988—),男,湖北仙桃人,助理研究员,博士,主要从事动物分子营养学与饲料资源开发利用研究。E-mail:

Copy editor: 陈鑫

收稿日期: 2023-10-12

  网络出版日期: 2024-04-15

基金资助

湖北省技术创新专项(2022BEC039)

湖北省农业科技创新中心项目(2022-620-004-001)

湖北省农业科技成果转化资金项目(NZZ2023000065)

西藏自治区科技计划项目(XZ202301YD0013C)

湖北省农科院院青年科学基金(2024NKYJJ20)

收起

Effects of Basal Diet Replaced by Fermented Feed Mulberry with Different Proportions on Rumen Fermentation, Rumen Bacterial and Fungal Community Structure of Beef Cattle

  • FAN Qiwen ,
  • CHEN Fang ,
  • DU Encun ,
  • TAO Wenjing ,
  • ZHAO Na ,
  • HUANG Shaowen ,
  • GUO Wanzheng ,
  • HUANG Jing ,
  • JIN Feng ,
  • WEI Jintao
Expand
  • Hubei Key Laboratory of Animal Embroyo Engineering and Molecular Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2023-10-12

  Online published: 2024-04-15

Fold

摘要

本研究旨在探究不同比例发酵饲料桑替代基础饲粮对肉牛瘤胃发酵、瘤胃细菌与真菌菌群结构的影响。选取体重为(287.45±22.63) kg、日龄相近的西门塔尔杂交公牛30头,随机分为3组,分别为对照组、NT1和NT2组,每组10个重复。对照组给予基础饲粮,NT1和NT2组分别以10%和20%发酵饲料桑等量替代基础饲粮。试验预试期14 d,正试期116 d。结果表明:1)与对照组相比,NT1组和NT2组瘤胃液戊酸的含量显著提高(P<0.05)。2)与对照组相比,在门水平上,NT2组厚壁菌门与拟杆菌门比值(F/B)显著增加(P<0.05);在属水平上,NT2组普氏菌属(Prevotella)细菌相对丰度显著降低(P<0.05),未分类颤螺旋菌科(unclassified_Oscillospiraceae)和毛螺旋菌科UCG-008(Lachnospiraceae_UCG-008)细菌相对丰度显著提高(P<0.05)。此外,与对照组相比,NT2组中瘤胃细菌富集于环境信息处理途径、信号转导途径、双组分系统和耐药性:抗菌途径的相对丰度显著上升(P<0.05),而富集于其他次级代谢产物生物合成途径和抗生素生物合成途径的相对丰度显著降低(P<0.05)。3)NT1组真菌样本测序鉴定的物种数、ACE、Chao1及香农指数均显著高于对照组(P<0.05);此外,在属水平上,与对照组相比,NT1组中青霉菌属(Penicillium)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、丝衣霉菌属(Byssochlamys)、木霉菌属(Trichoderma)真菌相对丰度均显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),而红酵母属(Rhodotorula)、锥盖伞属(Conocybe)、未分类角担菌科(unclassified_Ceratobasidiaceae)真菌相对丰度均显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01);同时NT2组中红酵母属、锥盖伞属真菌相对丰度相较于对照组也显著下降(P<0.05),未分类角担菌科真菌相对丰度极显著下降(P<0.01)。综上所述,使用不同比例发酵饲料桑替代基础饲粮可提高瘤胃液中戊酸的含量,增加瘤胃真菌菌群的多样性,改变瘤胃细菌和真菌组成结构,从而调节改善瘤胃内环境。

关键词： 发酵饲料桑; 肉牛; 瘤胃发酵参数; 菌群结构

本文引用格式

樊启文 , 陈芳 , 杜恩存 , 陶文静 , 赵娜 , 黄少文 , 郭万正 , 黄静 , 金枫 , 魏金涛 . 不同比例发酵饲料桑替代基础饲粮对肉牛瘤胃发酵、瘤胃细菌与真菌菌群结构的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(4) : 2475 -2486 . DOI: 10.12418/CJAN2024.213

Abstract

This study was conducted to explore the effects of basal diet replaced by fermented feed mulberry with different proportions on rumen fermentation, rumen bacterial and fungal community structure of beef cattle. A total of 30 Simmental crossbred fattening beef cattle with similar body weight (287.45±22.63) kg were randomly divided into 3 group, namely the control group, the NT1 and NT2 groups, with 10 replicates per group. The control group was fed a basal diet, NT1 and NT2 groups were fed experimental diets which used 10% and 20% fermented feed mulberry to replace the basal diet. The pre-test lasted for 14 days, and the test lasted for 116 days. The results showed as follows: 1) the content of pentanoic acid in rumen fluid in NT1 and NT2 groups significantly increased compared with the control group (P<0.05). 2) Compared with the control group, the Firmicutes/Bacteroidetes ratio (F/B) in the NT2 group significantly increased (P<0.05), the relative abundance of Prevotella significantly reduced (P<0.05), the relative abundance of unclassified_Oscillospiraceae and Lachnospiraceae_UCG-008 significantly increased (P<0.05). Moreover, the rumen bacteria in NT2 group enriched in the pathways: environmental information processing, signal transduction, two-component system, drug resistance: antimicrobial significantly increased (P<0.05),and the pathways: global and overview maps, biosynthesis of other secondary metabolites, biosynthesis of antibiotics significantly decreased (P<0.05) compared with the control group. 3) The observed_species, ACE, Chao1, and Shannon indexes of fungal in the NT1 group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). In addition, compared with the control group, the relative abundance of Penicillium, Botryotinia, Byssochlamys, and Trichodermas in the NT1 group significantly upregulated (P<0.05 or P<0.01), while the relative abundance of Rhodotorula, Conoxybe and unclassified_Ceratobasidaceae significantly downregulated (P<0.05 or P<0.01). Simultaneously, the relative abundance of Rhodotorula, Conoxybe and unclassified_Ceratobasidaceae in the NT2 group also decreased compared wiht the control group (P<0.05). In summary, different proportions of diet replaced by fermented feed mulberry increase the content of pentanoic acid in rumen fluid, increase the diversity of rumen fungi flora, alter the composition and function of rumen bacteria and fungi, thus improve rumen internal environment.

Key words： fermented feed mulberry; beef cattle; rumen fermentation parameters; microbial community structure

瘤胃是反刍动物特有的类发酵罐式器官,其中瘤胃微生物发酵产生的蛋白质和挥发性脂肪酸是反刍动物重要的蛋白质和能量来源,也是反刍动物营养研究的重要靶器官。我国是桑叶原产国,至2022年底全国桑园总面积约78.42万hm2,且全国各地桑园散布,但相对集中于广西、四川、云南、贵州等。依照每公顷桑园年产桑叶45 t计算,全国每年桑叶总产量超3 500万t,加之桑叶的粗蛋白质含量丰富、氨基酸组成适宜、营养价值高于苜蓿,可作为特色饲草资源促进地区养殖业的发展。
除营养价值外,桑叶也是传统中药的一种,其含有的类固醇、皂苷、生物碱、糖苷、多糖和酚类化合物是其药用功效的主要生物活性物质[1],这些植物化学物质对消化道及其功能具有显著的调节作用。研究发现桑叶浸提物可改善断奶仔猪肠道屏障功能,调节结肠微生物结构[2]。水牛饲粮中添加桑叶黄酮可调节其瘤胃细菌及其功能[3]。另外,饲喂桑叶可改善湖羊瘤胃微生物区系,影响其脂肪沉积[4]。发酵饲料桑是利用植物乳酸菌、丁酸梭菌等处理饲料桑所得,在降低抗营养物质含量的同时可保留其生物活性成分。已有的研究显示,发酵桑叶可促进湖羊瘤胃产气发酵[5];青贮桑叶可调节羔羊、奶牛等瘤胃细菌结构,改善瘤胃健康状态[6-7]。探究发酵饲料桑对肉牛瘤胃发酵环境与微生物功能的影响,有助于揭示发酵饲料桑改善肉牛生长性能的机制。因此,本研究旨在探索不同比例发酵饲料桑替代基础饲粮对肉牛瘤胃发酵参数、瘤胃细菌与真菌菌群结构与功能的影响,揭示发酵饲料桑对肉牛瘤胃微生物的影响,为饲料桑在肉牛养殖中的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 发酵饲料桑制备

试验所用新鲜桑枝叶采割于湖北省荆门市屈家岭某桑叶种植基地,将新鲜桑枝叶、麸皮、玉米粉按照7∶2∶1的比例混合,加入由植物乳酸杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、纤维素酶和半纤维素酶构成(最终活菌数或活性分别为1.0×107 CFU/g、1.0×107 CFU/g、1.0×107 CFU/g、1.0×105 CFU/g、20 U/g、6 U/g)的菌酶协同型发酵剂,待混合均匀后装入呼吸袋中,在30 ℃恒温房中发酵72 h后取出待用。饲料桑及发酵饲料桑的营养成分如表1所示。
表1 饲料桑及发酵饲料桑的营养成分(干物质基础)

Table 1 Nutrient composition of feed mulberry and fermented feed mulberry (DM basis)%

项目
Items		 饲料桑
Feed
mulberry		 发酵饲料桑
Fermented feed
mulberry
粗蛋白质 CP 16.09 12.21
中性洗涤纤维 NDF 29.80 34.97
酸性洗涤纤维 ADF 13.42 17.72

1.2 试验设计与饲养管理

本试验在湖北省枣阳市某肉牛养殖场进行,试验时间为2022年5月14日至2022年9月21日。选取月龄、体重[(287.45±22.63) kg]相近的健康西门塔尔杂交公牛30头,随机分为对照组、NT1组和NT2组,每组10个重复,其中对照组饲喂基础饲粮,NT1组和NT2组分别以10%和20%发酵饲料桑等量替代基础饲粮。基础饲粮参照NRC(2000)肉牛饲养标准设计,其组成见表2,各组饲粮组成及营养水平见表3。粗蛋白质(CP)含量测定参考《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018);中性洗涤纤维(NDF)含量测定参考《饲料中中性洗涤纤维的测定》(GB/T 20806—2022);酸性洗涤纤维(ADF)含量测定参考《饲料中酸性洗涤纤维的测定》(NY/T 1459—2022)。试验牛采用单栏饲养,试验饲粮经饲料搅拌车充分搅拌配制成全混合日粮(TMR),并于每天07:00和18:00定时饲喂,自由饮水。试验期130 d,其中预试期14 d,正试期为116 d。预试期内逐步提高TMR中发酵饲料桑的添加量,并进行驱虫、打耳标等。正试期内,将NT1组和NT2组分别替换对应的TMR,保证自由采食与饮水。
表2 基础饲粮组成(干物质基础)

Table 2 Composition of the basal diet (DM basis)%

原料 Ingredients 含量 Content
稻草干草 Straw hay 5.90
玉米秸秆黄贮 Corn straw yellow silage 38.30
酒糟 Distillers’grains 29.45
精料补充料 Concentrate supplement 18.85
豆粕 Soybean meal 0.45
玉米 Corn 4.50
大麦 Barley 1.00
小苏打 NaHCO3 0.15
预混料 Premix 1.40
合计 Total 100.00

每千克预混料含有 One kg of the premix contained the following:Cu 2 g,Fe 15 g,Zn 10 g,Mn 7 g,I 150 mg,Co 50 mg,Se 30 mg,VA 750 000 IU,VD 200 000 IU,VE 4 600 IU。

表3 各组饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 3 Composition and nutrient levels of diets in groups (DM basis)%

项目 Items 对照组 Control group NT1组 NT1 group NT2组 NT2 group
组成 Composition
基础饲粮 Basal diet 100 90 80
发酵饲料桑 Fermented feed mulberry 10 20
合计 Total 100 100 100
营养水平 Nutrient levels
综合净能 NEmf/(MJ/kg) 5.57 5.65 5.74
粗蛋白质 CP 11.54 11.73 11.79
中性洗涤纤维 NDF 41.41 40.64 39.93
酸性洗涤纤维 ADF 21.78 21.23 20.28

综合净能是依据NRC(2000)得到的计算值,其余为实测值。

NEmf was a calculated value according to NRC (2000), while the others were measured values.

1.3 测定指标与方法

1.3.1 瘤胃发酵参数检测

利用胃管吸引法,由口经由食道将胃管插入瘤胃,使用大号注射器吸出瘤胃液100~200 mL,立即测定pH。新鲜采集的瘤胃液以4层纱布过滤,立即放入-20 ℃冰箱保存。
瘤胃液氨态氮(NH3-N)含量的测定采用《瘤胃液中氨态氮浓度的测定》(T/NAIA 004—2020)相关标准所示方案进行;瘤胃液挥发性脂肪酸乙酸、丙酸、异戊酸、戊酸、异丁酸、丁酸含量依照《瘤胃液中挥发性脂肪酸的测定》(T/NAIA 005—2020)相关标准进行检测。

1.3.2 瘤胃液微生物16S及中文ITS检测

瘤胃液样品中总基因组DNA的提取使用TGuide S96磁性土壤/粪便DNA试剂盒(北京天根生物科技有限公司)。细菌16S rRNA基因的高可变区V3~V4利用引物对5'-ACTCCTACGAGGCAGCAG-3'(F)和5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'(R);真菌ITS1使用引物对:5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'(F)和5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'(R),分别扩增所得PCR产物在琼脂糖凝胶上检查,并通过Omega DNA纯化试剂盒(美国Omega公司)进行纯化。收集纯化的PCR产物,并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双末端测序。
测序所得序列使用USEARCH(10.0版)软件将相似度阈值超过97%的合格序列分配至1个操作分类单元(OTU)。OTU的分类注释利用QIME2软件中的Naive Bayes分类器进行,分类基于SILVA数据库(138.1版)其置信阈值为70%。α多样性检测使用QIME2软件进行。此外,使用单因素方差分析来比较微生物的相对丰度和多样性差异,应用线性判别分析(LDA)和线性判别分析(LEfSe)对差异丰富的微生物进行评估。

1.4 统计分析

统计分析利用Graphpad prism 5软件进行,组间比较采用one-way ANOVA检验处理。瘤胃发酵参数数据均来自至少3次独立重复试验。试验数据以平均值±均值标准误(SEM)表示,0.05<P<0.10为有趋势,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。利用Origin 2021软件进行Spearman相关性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵饲料桑对肉牛瘤胃发酵参数的影响

由表4所示,对照组瘤胃液中戊酸的含量显著低于NT1组和NT2组(P<0.05),其余瘤胃发酵参数各组之间均无显著差异(P>0.05)。
表4 发酵饲料桑对肉牛瘤胃发酵参数的影响

Table 4 Effects of fermented feed mulberry on rumen fermentation parameters of beef cattle

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
pH 6.82±0.19 6.71±0.11 6.63±0.16 0.832
乙酸 Acetic acid/(mmol/L) 34.68±7.29 43.55±4.13 34.18±7.39 0.123
丙酸 Propionic acid/(mmol/L) 12.01±5.52 12.66±3.25 7.73±1.37 0.190
异丁酸 Isobutyric acid/(mmol/L) 0.12±0.07 0.13±0.12 0.14±0.09 0.962
丁酸 Butyric acid/(mmol/L) 5.54±3.46 7.89±1.67 6.68±1.85 0.438
异戊酸 Isovaleric acid/(mmol/L) 0.51±0.19 0.60±0.13 0.46±0.23 0.603
戊酸 Pentanoic acid/(mmol/L) 0.36±0.06b 0.76±0.23a 0.68±0.13a 0.014
氨态氮 NH3-N/(mg/dL) 1.92±0.72 3.45±1.87 3.31±1.66 0.143
总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 53.23±15.21 65.57±4.88 49.87±9.50 0.329
乙酸/丙酸 Acetic acid/propionic acid 3.18±0.87 3.60±0.90 4.50±0.99 0.174

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌组的影响

细菌测序基于16S rRNA测序,对每组5个瘤胃液,共计15个样品测序,获得1 151 806对Reads,双端Reads质控、拼接后共产生1 145 153条Clean Reads,每个样品至少产生61 404条Clean Reads,平均产生76 344条Clean Reads。

2.2.1 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌α多样性的影响

如表5所示,各组鉴定的物种数、ACE指数、Chao1指数、香农指数及辛普森指数均无显著差异(P>0.05),表明发酵饲料桑的添加未对肉牛瘤胃中细菌α多样性造成显著影响。
表5 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌α多样性的影响

Table 5 Effects of fermented feed mulberry on rumen bacteria alpha diversity of beef cattle

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
鉴定的物种数 Observed_species 1 205.00±209.56 1 072.20±89.99 1 267.40±175.81 0.208
ACE指数 ACE index 1 209.39±209.61 1 076.71±91.16 1 272.33±174.72 0.206
Chao1指数 Chao1 index 1 205.63±209.52 1 073.06±90.31 1 268.41±175.36 0.207
香农指数 Shannon index 8.64±0.55 8.22±0.63 8.89±0.31 0.165
辛普森指数 Simpson index 0.993±0.005 0.988±0.008 0.995±0.002 0.163
系统发育多样性 PD_whole_tree 102.57±23.97 91.12±13.18 113.30±25.46 0.303

2.2.2 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌相对丰度的影响

如表6所示,在门水平上,相比于对照组,NT2组厚壁菌门(Firmicutes)细菌相对丰度呈增加趋势(0.05<P<0.10),而厚壁菌门与拟杆菌门比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)显著提高(P<0.05),这一比值与代谢尤其是脂质代谢密切相关,其升高可能促进脂质沉积。
表6 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌在门水平上相对丰度的影响

Table 6 Effects of fermented feed mulberry on relative abundance of rumen bacteria at phylum level of beef cattle

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
厚壁菌门 Firmicutes/% 42.00±6.33 49.08±7.85 51.13±2.11 0.075
拟杆菌门 Bacteroidota/% 37.82±2.22 35.48±7.47 30.94±6.59 0.213
变形菌门 Proteobacteria/% 6.62±6.44 5.87±7.90 6.64±5.44 0.977
髌骨细菌门 Patescibacteria/% 4.95±1.41 4.41±1.77 4.09±0.94 0.637
放线菌门 Actinobacteriota/% 2.61±1.69 1.45±1.34 2.35±2.00 0.541
酸杆菌门 Acidobacteriota/% 0.76±0.74 0.42±0.37 1.00±0.92 0.452
脱硫杆菌门 Desulfobacterota/% 0.67±0.22 0.56±0.20 0.85±0.30 0.211
蓝菌门 Cyanobacteria/% 0.64±0.27 0.64±0.36 0.42±0.31 0.466
疣微菌门 Verrucomicrobiota/% 0.50±0.17 0.56±0.39 0.57±0.27 0.924
纤维杆菌门 Fibrobacterota/% 0.62±0.35 0.46±0.28 0.28±0.28 0.239
厚壁菌门与拟杆菌门比值 F/B ratio 1.12±0.23b 1.45±0.43ab 1.70±0.28a 0.049
如表7所示,在属水平差异显著的细菌中,普氏菌属(Prevotella)、未分类颤螺旋菌科(unclassified_Oscillospiraceae)、毛螺旋菌科UCG-008(Lachnospiraceae_UCG-008)细菌是各组之间主要差异细菌。与对照组相比,NT2组中普氏菌属细菌相对丰度显著降低(P<0.05),而未分类颤螺旋菌科和毛螺旋菌科UCG-008细菌相对丰度显著上升(P<0.05)。
表7 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌在属水平上相对丰度的影响(差异显著细菌)

Table 7 Effects of fermented feed mulberry on relative abundance of rumen bacteria at genus level of beef cattle (significantly different bacteria)%

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
普氏菌属 Prevotella 18.51±2.68a 20.32±2.92a 10.78±1.08b 0.034
未分类颤螺旋菌科 Unclassified_Oscillospiraceae 0.11±0.04ABb 0.07±0.02Bb 0.34±0.08Aa 0.008
毛螺旋菌科UCG-008 Lachnospiraceae_UCG-008 0.11±0.02b 0.08±0.03b 0.24±0.06a 0.030
嗜木聚糖优杆菌群
Eubacterium_xylanophilum_group		 0b 0.029±0.014a 0b 0.035
藏匿优杆菌群 Eubacterium_saphenum_group 0.001±0.001b 0b 0.019±0.008a 0.022
陶厄氏菌属 Thauera 0.013±0.005a 0.003±0.002ab 0.002±0.002b 0.049
萨顿氏菌属 Suttonella 0b 0.002±0.002ab 0.011±0.004a 0.022
Sediminispirochaeta 0.008±0.003a 0b 0.002±0.002ab 0.025
未分类肠杆菌科 Unclassified_Entotheonellaceae 0.004±0.002a 0b 0b 0.022
未分类脱硫杆菌科 Unclassified_Desulfobacterota 0.002±0.000a 0b 0b 0.016

2.2.3 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌功能的影响

基于TAX4FUN软件可对微生物的功能进行预测,其结果如表8所示。与对照组相比,NT2组中细菌富集于环境信息处理途径、信号转导途径、双组分系统、耐药性:抗菌途径的相对丰度显著上升(P<0.05),而富集于全局和概述图谱途径、其他次级代谢产物生物合成途径和抗生素生物合成途径相对丰度显著降低(P<0.05);NT1组中信号转导途径、双组分系统相对丰度显著上升(P<0.05)。上述结果显示发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌功能具有显著影响。
表8 肉牛瘤胃细菌功能预测分析

Table 8 Prediction analysis of rumen bacterial function of beef cattle%

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
环境信息处理
Environmental information processing		 10.90±0.55b 11.33±0.58ab 12.09±1.05a 0.031
全局和概述图谱 Global and overview maps 37.18±0.71a 37.18±0.55a 36.16±0.63b 0.014
信号转导 Signal transduction 4.29±0.31b 4.64±0.23a 4.70±0.19a 0.014
其他次级代谢产物生物合成
Biosynthesis of other secondary metabolites		 1.40±0.08a 1.38±0.04ab 1.30±0.26b 0.021
耐药性:抗菌 Drug resistance: antimicrobial 1.09±0.04b 1.12±0.03ab 1.18±0.06a 0.011
抗生素生物合成 Biosynthesis of antibiotics 4.92±0.12ABa 4.92±0.08Aa 4.75±0.06Bb 0.009
双组分系统 Two-component system 3.94±0.30b 4.28±0.23a 4.35±0.22a 0.013

2.3 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌组的影响

真菌鉴定基于ITS序列测序,对每组5个瘤胃液,共计15个样品测序获得1 200 052对Reads,双端Reads质控、拼接后共产生1 196 590条Clean Reads,每个样品至少产生79 263条Clean Reads,平均产生79 773条Clean Reads。

2.3.1 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌α多样性的影响

表9为真菌α多样性分析结果,NT1组真菌样本测序鉴定的物种数、ACE、Chao1及香农指数均显著高于对照组(P<0.05),表明10%发酵饲料桑的添加可显著增加肉牛瘤胃中真菌微生物的多样性。
表9 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌α多样性的影响

Table 9 Effects of fermented feed mulberry on rumen fungal alpha diversity of beef cattle

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
鉴定的物种数 Observed_species 163.40±12.92b 184.00±11.22a 179.60±25.41ab 0.035
ACE指数 ACE index 163.40±12.92b 184.00±11.22a 179.60±25.41ab 0.035
Chao1指数 Chao1 index 163.40±12.92b 184.00±11.22a 179.60±25.41ab 0.035
香农指数 Shannon index 6.27±0.35b 6.75±0.21a 6.36±0.39ab 0.047
辛普森指数 Simpson index 0.97±0.01 0.98±0.01 0.96±0.03 0.203
系统发育多样性 PD_whole_tree 64.44±5.03 68.56±3.57 60.55±10.99 0.259

2.3.2 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌相对丰度的影响

++++表10显示出在门水平上各组中相对丰度居于前10的真菌类别,各组真菌在门水平上的相对丰度无显著差异(P>0.05)。
表10 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌在门水平上相对丰度的影响

Table 10 Effects of fermented feed mulberry on relative abundance of rumen fungi at phylum level of beef cattle%

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
子囊菌门 Ascomycota 62.39±10.17 68.02±8.05 66.96±5.80 0.533
担子菌门 Basidiomycota 16.44±6.62 16.19±4.63 16.54±3.13 0.993
新美鞭菌门 Neocallimastigomycota 12.27±15.42 4.19±2.87 4.94±5.70 0.373
未分类真菌 Unclassified_fungi 3.95±1.52 5.89±2.85 4.80±0.78 0.311
罗兹菌门 Rozellomycota 2.36±1.27 2.74±1.29 2.69±1.43 0.886
被孢霉门 Mortierellomycota 0.90±0.56 1.06±0.56 2.33±1.85 0.144
壶菌门 Chytridiomycota 0.42±0.49 0.81±0.52 1.22±1.12 0.314
毛霉菌门Mucoromycota 0.37±0.67 0.58±0.56 0.42±0.44 0.828
球囊菌门 Glomeromycota 0.32±0.22 0.51±0.32 0.10±0.14 0.059
单毛壶菌门 Monoblepharomycota 0.26±0.59 0 0 0.397
如表11所示,与对照组相比,NT1组中青霉菌属(Penicillium)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、丝衣霉菌属(Byssochlamys)真菌相对丰度均显著上调(P<0.05),木霉菌属(Trichoderma)真菌相对丰度极显著上调(P<0.01),而红酵母属(Rhodotorula)、锥盖伞属(Conocybe)真菌相对丰度均显著下调(P<0.05),未分类角担菌科(unclassified_Ceratobasidiaceae)真菌相对丰度极显著下调(P<0.01);同时NT2组中红酵母属、锥盖伞属真菌相对丰度相较于对照组也显著下降(P<0.05),未分类角担菌科真菌相对丰度极显著下降(P<0.01)。
表11 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌在属水平上相对丰度的影响(差异显著真菌)

Table 11 Effects of fermented feed mulberry on relative abundance of rumen fungi at genus level of beef cattle (significantly different fungi)%

项目
Items		 对照组
Control group		 NT1组
NT1 group		 NT2组
NT2 group		 P值
P-value
青霉菌属 Penicillium 0.90±0.17b 2.68±0.46a 1.77±0.60ab 0.048
葡萄孢盘菌属 Botryotinia 0.18±0.11b 0.93±0.31a 0.06±0.06b 0.014
红酵母属 Rhodotorula 0.97±0.38a 0.06±0.06b 0b 0.012
丝衣霉菌属 Byssochlamys 0.07±0.07b 0.66±0.18a 0.20±0.11ab 0.016
木霉菌属 Trichoderma 0Bb 0.83±0.25Aa 0.06±0.06Bb 0.003
锥盖伞属 Conocybe 0.41±0.15a 0b 0.09±0.06b 0.020
未分类角担菌科 Unclassified_Ceratobasidiaceae 0.50±0.16Aa 0Bb 0.06±0.06Bb 0.003

2.3.3 发酵饲料桑对肉牛瘤胃特征真菌的影响

ITS测序数据基于LEfse软件分析可用于探究各组微生物中的特征微生物。LEfse分析结果如图1所示,交枝顶孢霉菌(Sarocladium_implicatum)、未分类角担菌科(unclassifed_Ceratobasidiaceae)、红酵母属、锁掷酵母科(Sporidiobolaceae)是对照组中的特征真菌,丝衣霉菌属、葡萄孢盘菌属、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、木霉菌属、肉座菌科(Hypocreaceae)、丛赤壳科(Ncctriaceae)为NT1组的特征真菌,而球型马拉色菌(Malassezia_globosa)为NT2组的特征真菌。
图1 各组肉牛瘤胃液特征真菌分析

Fig.1 Characteristic fungi analysis on rumen fluid of beef cattle in each group

2.4 相关性分析

相关性分析的结果如图2所示,瘤胃中普氏菌属细菌的相对丰度与葡萄孢盘菌属真菌相对丰度呈显著正相关(P<0.05),与球型马拉色菌真菌相对丰度呈极显著负相关(P<0.01);未分类颤螺旋菌科和毛螺旋菌科UCG-008细菌的相对丰度与球型马拉色菌真菌相对丰度分别呈极显著正相关(P<0.01)和显著正相关(P<0.05);嗜木聚糖优杆菌群细菌的相对丰度与木霉菌属和葡萄孢盘菌属真菌相对丰度分别呈极显著正相关(P<0.01);萨顿氏菌属细菌相对丰度与球型马拉色菌真菌相对丰度呈显著正相关(P<0.05),与锁掷酵母科真菌相对丰度呈显著负相关(P<0.05);Sediminispirochaeta、未分类脱硫杆菌科细菌相对丰度与锁掷酵母科、红酵母属、交枝顶孢霉菌真菌相对丰度菌;未分类肠杆菌科细菌相对丰度与丝衣霉属真菌相对丰度呈显著负相关(P<0.05)。此外,瘤胃液中戊酸的含量与毛螺旋菌科UCG-008、萨顿氏菌属细菌相对丰度呈显著负相关(P<0.05),与嗜木聚糖优杆菌群细菌相对丰度呈极显著正相关(P<0.01)。
图2 瘤胃液差异显著细菌、特征真菌与戊酸含量的相关性分析

*表示显著相关(P<0.05),**表示极显著相关(P<0.01),***表示极极显著相关(P<0.001)。

Fig.2 Correlation analysis of significantly different bacteria, characteristic fungi, and pentanoic acid content in rumen fluid

* mean significant correlation (P<0.05), ** mean extremely significant correlation (P<0.01) and *** mean the most significant correlation (P<0.001).

3 讨论

3.1 发酵饲料桑对肉牛瘤胃发酵参数的影响

瘤胃发酵环境易受饲粮影响,反刍动物饲粮中牧草包含率提高可增加乙酸含量,降低丙酸含量[8]。罗阳等[5]在成年湖羊上的研究显示,相比于羊草,发酵桑叶可显著提高瘤胃液中各种挥发性脂肪酸的含量,提高氨态氮的含量;相比于苜蓿,发酵桑叶可显著增加瘤胃液中丁酸和戊酸的含量。王嘉琦[7]研究显示,泌乳奶牛瘤胃中丙酸含量随饲粮中桑枝叶替代量提高而提高。而李建波等[9]则发现,泌乳奶牛饲粮中发酵蛋白桑替代比例的提高,使瘤胃中乙酸含量和乙丙比呈下降趋势。这些研究显示出发酵桑叶具有改善反刍动物瘤胃发酵环境的功效。在本研究中,发酵饲料桑在肉牛中的应用可显著增加瘤胃液中戊酸的含量,这种提高对瘤胃发酵功能的影响未知,但对挥发性脂肪酸的产生具有一定的影响。此外,有研究显示戊酸能够激活奶牛瘤胃上皮细胞的炎症反应[10],显示出戊酸对免疫功能具有潜在的调节作用。

3.2 发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌组的影响

发酵饲料桑对肉牛瘤胃细菌组的影响来自于发酵菌和桑枝叶中的活性成分。有研究显示奶牛饲用10%青贮桑枝叶可使瘤胃中拟杆菌门细菌相对丰度降低,并上调厚壁菌门细菌相对丰度;在属水平上,10%青贮桑枝叶可使普氏菌属细菌相对丰度显著降低,而毛螺菌属细菌相对丰度显著上升[7]。这一结果与本研究中利用发酵饲料桑所得结果高度相似,20%发酵饲料桑等量替代基础饲粮使肉牛瘤胃中拟杆菌门细菌相对丰度降低,厚壁菌门细菌相对丰度呈上升趋势,同时普氏菌属细菌相对丰度显著降低,而毛螺旋菌科UCG-008细菌相对丰度显著升高。上述结果表明,青贮和发酵等微生物处理技术处理桑枝叶可使牛瘤胃趋向于相似的细菌群落结构,而处理方式的改进有助于提高饲料桑的可利用量;同时,也提示处理后桑枝叶中活性成分可能是影响瘤胃菌群结构的主要因素。
脱氧野尻霉素(DNJ)是桑枝叶中独特的生物活性成分之一,具有显著的葡萄糖苷酶抑制活性,可发挥降血糖功效。DNJ同样具有微生物调节功能。Hou等[11]研究显示在基础饲粮中加入0.15 mg/g DNJ可显著上调鹅盲肠拟杆菌属、志贺氏杆菌属和丁酸球菌属细菌相对丰度,而降低未分类瘤胃球菌科细菌相对丰度。小鼠高脂饲粮中添加桑叶可使其粪便中艾克曼菌相对丰度上调,变形菌门细菌相对丰度及厚壁菌门/拟杆菌门比值降低[12]。家兔饲用含2 g/kg DNJ的饲粮可改变肠道菌群结构,抑制其生长和有机物质的消化利用,不利于动物快速育肥[13]。这些试验显示出桑叶及其活性成分对动物肠道有益微生物的促进作用,但也展示出其对动物快速脂肪沉积的抑制作用。本研究中,发酵饲料桑显著促进信号转导、双组分系统相关功能系统,而20%发酵饲料桑处理可提高耐药性相关信号通路相对丰度,并降低抗生素生物合成相关通路相对丰度,表明发酵饲料桑具有抗生素类似功效。另外,发酵饲料桑可使瘤胃中未分类肠杆菌科、未分类脱硫杆菌科细菌相对丰度降低至0,这一结果与断奶仔猪试验的结果一致,桑叶提取物添加可提高粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌数量,降低大肠杆菌数量[14]。上述研究结果表明发酵饲料桑具有良好的有害菌抑制功效。

3.3 发酵饲料桑对肉牛瘤胃真菌组的影响

真菌是瘤胃中发酵作用重要的承担者,是影响瘤胃环境的关键因素。相关研究表明,反刍动物的瘤胃真菌中以子囊菌门、担子菌门和新美鞭菌门为优势菌门[15-16]。本研究也显示出相似的结果,肉牛瘤胃中子囊菌门、担子菌门和新美鞭菌门真菌占瘤胃真菌总量的比例达88%以上。不同真菌的代谢功能差异使其对动物具有不同的影响。红酵母属真菌可产生多种对动物有益的天然色素,如类胡萝卜素、虾青素等[17],有助于调节机体抗氧化、抗炎能力[18]。木霉菌属真菌具有降解木质素、纤维素等能力[19],有助于提高饲料的利用率,同时调节瘤胃环境。锥盖伞属真菌可生成阿马毒素,该毒素易引起肝脏损伤,是有毒菌菇的重要来源[20]。本研究中,NT1组发酵饲料桑添加可使肉牛木霉菌属真菌相对丰度显著上升,提示发酵饲料桑添加有助于纤维的消化;同时,对锥盖伞属真菌生长的抑制,显示出发酵饲料桑具有一定的解毒功效。此外,由于肉牛饲粮中相对较高的维生素添加量,单一补充的类胡萝卜素的功效不显著,红酵母属真菌在瘤胃中的竞争优势不明显,这可能解释了发酵饲料桑添加引起瘤胃中红酵母属真菌相对丰度的降低。
瘤胃中真菌和细菌存在复杂的互作关系,既有协同也有竞争,这种跨界交流依赖于对营养底物和代谢产物的调节。马拉色菌属真菌多数都是嗜脂性的,通过自身分泌的脂酶分解甘油三酯,产生饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,其中饱和脂肪酸可用于自身代谢[21]。普氏菌属细菌可快速地从阿拉伯木聚糖和低聚果糖中提取丙酸,具备优越的纤维利用能力[22]。有研究表明,普氏菌属细菌的相对丰度与脂质含量有关,高脂环境不利于普氏菌的生长和多样性的形成[23-24]。本研究中,添加20%发酵饲料桑使球型马拉色菌呈特征性变化,普氏菌属细菌相对丰度显著降低,且两者呈显著负相关,其原因可能是马拉色菌代谢引起瘤胃中不饱和脂肪酸含量的上调,影响普氏菌属细菌的表达。此外,本研究中,球型马拉色菌和毛螺旋菌科UCG-008、萨顿氏菌属相对丰度均表现出显著正相关。其中,毛螺菌科参与多种碳水化合物的代谢,发酵导致乙酸和丁酸的产生可为反刍动物提供能量。木聚糖作为植物细胞的主要成分,可作为嗜木聚糖真杆菌群和木霉菌属的代谢原料,生成短链脂肪酸和菌体蛋白为反刍动物提供营养。在本研究中,嗜木聚糖真杆菌群和木霉菌属相对丰度呈显著的正相关,其原因可能在于植物性饲料可提供足够的木聚糖来源,使嗜木聚糖真杆菌群和木霉菌属呈协同共生状态。另外,本研究中,红酵母属与未分类脱硫杆菌科相对丰度呈显著正相关,可能是由于其共同参与瘤胃环境硫代谢。

4 结论

本研究中,以发酵饲料桑代替基础饲粮可改变瘤胃细菌和真菌的组成,促进有益菌的定植,抑制致病菌的生长,并通过真菌与细菌的复杂交互共同构建有益的瘤胃微生物环境。

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