动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2648 - 2659

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.228

研究论文

刺五加多酚合成纳米氧化锌及其抗氧化和抗菌性能研究

  • 李莹 ,
  • 褚秀玲 ,
  • 李晓丽 ,
  • 丁一 ,
  • 冯艺超 ,
  • 苏建青
展开
  • 聊城大学农学与农业工程学院,聊城 252000
*褚秀玲,教授,硕士生导师,E-mail: ;
苏建青,副教授,硕士生导师,E-mail:

李 莹(1998—),女,山东德州人,硕士研究生,研究方向为动物学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-11-01

  网络出版日期: 2024-04-15

基金资助

国家自然科学基金项目(32172901)

收起

Synthesis of Zinc Oxide Nanoparticles Using Polyphenols from Acanthopanax senticosus and Its Antioxidant and Antibacterial Properties

  • LI Ying ,
  • CHU Xiuling ,
  • LI Xiaoli ,
  • DING Yi ,
  • FENG Yichao ,
  • SU Jianqing
Expand
  • Agricultural Science and Engineering School, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China
*CHU Xiuling, professor, E-mail: ;
SU Jianqing, associate professor, E-mail:

Received date: 2023-11-01

  Online published: 2024-04-15

Fold

摘要

本试验旨在绿色合成纳米氧化锌并探究该纳米氧化锌的活性。以刺五加多酚为原料,绿色合成纳米氧化锌(ZnO NPs),通过紫外-可见分光光度计、X-射线衍射仪(XRD)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、热重分析(TG)和粒径分析对所制得的样品进行表征,通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除试验评价其抗氧化性能,通过沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌试验评价其抗菌性能。结果表明:本试验成功合成ZnO NPs,其在361 nm处有吸收峰,形态为六方晶系纤锌矿结构,晶体平均粒径为77.45 nm;当ZnO NPs质量浓度达到6 g/L时,对DPPH自由基的清除率达到93.28%;当ZnO NPs质量浓度达到9 g/L时,对ABTS自由基的清除率达到73.83%;ZnO NPs对沙门氏菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度为64 g/L,最小杀菌浓度为80 g/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为80 g/L,最小杀菌浓度为88 g/L,且ZnO NPs对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性均高于氧化锌(ZnO)。本试验以刺五加多酚为原料成功合成ZnO NPs,该ZnO NPs具有良好的抗氧化和抗菌性能,为其进一步开发为饲料添加剂奠定了基础。

关键词： 纳米氧化锌; 刺五加多酚; 抗氧化性能; 抗菌性能

本文引用格式

李莹 , 褚秀玲 , 李晓丽 , 丁一 , 冯艺超 , 苏建青 . 刺五加多酚合成纳米氧化锌及其抗氧化和抗菌性能研究[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(4) : 2648 -2659 . DOI: 10.12418/CJAN2024.228

Abstract

This experiment aimed to study the green synthesis of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) and explore its activity. ZnO NPs were synthesized by the green synthesis method with polyphenols from Acanthopanax senticosus as raw materials, and the samples were characterized by UV-visible spectrophotometer, X-ray diffractometer (XRD), Fourier transform infrared spectrometer (FTIR), scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM), thermogravimetric analysis (TG) and particle size analysis, antioxidant property was evaluated by the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging tests, and the antibacterial property was evaluated by antibacterial tests of Salmonella, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The results showed that ZnO NPs were successfully synthesized in this experiment, with an absorption peak at 361 nm. Its morphology was observed as a hexagonal wurtzite structure with an average grain size of 77.45 nm. When the mass concentration of ZnO NPs was 6 g/L, the scavenging rate of DPPH radical reached 93.28%. When the mass concentration of ZnO NPs was 9 g/L, the scavenging rate of ABTS radical reached 73.83%. The minimum inhibitory concentration of ZnO NPs against Salmonella and Escherichia coli was 64 g/L, and the minimum bactericidal concentration was 80 g/L; the minimum inhibitory concentration of ZnO NPs against Staphylococcus aureus was 80 g/L, and the minimum bactericidal concentration was 88 g/L. The antibacterial activity of ZnO NPs against Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureus was higher than that of zinc oxide (ZnO). In conclusion, this experiment successfully synthesizes ZnO NPs with polyphenols from Acanthopanax senticosus as raw materials, and they have good antioxidant and antibacterial properties, which lays a foundation for their further development as feed additives.

Key words： zinc oxide nanoparticles; Acanthopanax senticosus polyphenols; antioxidant property; antibacterial property

氧化锌(zinc oxide,ZnO)作为饲料添加剂被广泛应用,早期国外有研究表明,在饲粮中添加氧化锌可以减少下痢的发生率,促进畜禽生长等[1]。氧化锌中的锌含量较高,且其为锌的氧化物形式,具有较高的稳定性,是畜禽饲粮中锌的主要来源之一[2]。在饲粮中添加氧化锌可以有效防治仔猪腹泻[3];可以促进肉兔[4]、断奶仔猪[5]、蛋鸡[6]、犊牛[7]等畜禽的生长和提高生产性能。氧化锌来源的锌可以促进畜禽的生长,这可能与其弱抗菌性和收敛作用有关[8]。有报道称,锌可以促进舌黏膜味蕾细胞的生长,从而提高仔猪的食欲,增加其采食量,促进生长[9]。锌离子(Zn2+)可以减少肠道内有害菌的黏附,抑制有害菌的数量,从而改善家禽的肠道健康,起到抗腹泻作用[10]。
氧化锌虽然具有良好的促生长和抗腹泻作用,但随着对氧化锌的深入研究,发现仔猪会对氧化锌产生依赖性腹泻,而且仔猪对氧化锌的利用率较低,长期高剂量的使用氧化锌会使其通过粪便排入环境中,造成环境污染[11]。且《饲料添加剂安全使用规范》规定:饲粮中氧化锌添加量肉兔≤120 mg/kg、蛋鸡≤60 mg/kg、犊牛≤180 mg/kg、其他动物≤120 mg/kg(均以锌元素计)。农业农村部2625号公告规定,仔猪(≤25 kg)配合饲料中锌元素的最高限量为110 mg/kg,但在仔猪断奶后前2周特定阶段,允许在此基础上使用氧化锌或碱式氯化锌至1 600 mg/kg(以锌元素计)。但从2003年开始,欧盟禁止在动物饲料中使用药理剂量的氧化锌,因此急需寻找一种高剂量氧化锌的可行性替代品。
纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)是一种新型的无机锌产品,其粒径范围在1~100 nm。纳米氧化锌具有独特的物理和化学性质,与氧化锌相比,其独特性主要表现在体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应[12],此外,纳米氧化锌的化学活性更强,可以与多种有机化合物发生反应。纳米氧化锌作为添加剂添加到家禽饲粮中可以提高锌在家禽体内的生物利用度[13],减轻环境污染。有报道称,纳米氧化锌的穿透力可以避免引起肠胃不适反应,使其扩散到整个肠黏膜下层,从而提高锌的吸收率[14]。已有研究证实,在饲粮中添加纳米氧化锌可以提高肉仔鸡的增重、饲料转化率以及抗氧化能力[15];可以提高育肥猪的生长性能、免疫性能及瘦肉率[16];能够有效防治鸡球虫病[17]。纳米氧化锌还表现出良好的抗菌性能,其可以破坏细菌的细胞膜[18],从而起到抗菌的作用。此外,有研究表明纳米氧化锌可以调控家禽的肠道菌群[19],表明其具有部分代替抗生素的潜力。
纳米氧化锌的制作方法包括物理法、化学法、生物合成法[20]。与传统的化学法相比,生物合成法具有成本小,操作条件温和、对环境的污染小等优点。植物提取物中有大量的活性成分可以在纳米氧化锌的合成过程中作为还原剂和稳定剂来还原纳米氧化锌[21],且不需要再额外添加化学稳定剂,只需要将植物提取液和相应的锌盐混合即可,符合绿色化学的前景。已有研究显示,水花生提取液绿色合成的纳米氧化锌对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有良好的抗病毒效果[22];藤茶黄酮合成的纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌效果[23]。上述研究结果表明纳米氧化锌具有良好的发展与应用前景。鉴于此,本试验以刺五加多酚为原料生物合成纳米氧化锌,并用紫外-可见分光光度计(UV-visible spectrophotometer)、X-射线衍射仪(XRD)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、热重分析(TG)、粒径分析对合成的纳米氧化锌进行表征,同时评价其体外抗氧化能力以及对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果,以期为其进一步开发为饲料添加剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

刺五加购自聊城利民大药房;七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O),分析纯(AR),购自上海麦克林生化科技股份有限公司;氧化锌标准品,优级纯(GR),购自上海麦克林生化科技股份有限公司;LB肉汤培养基、琼脂,生物试剂(BR),均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

1.2 纳米氧化锌的生物合成方法

1.2.1 刺五加多酚提取液的制备

取1 g刺五加粉末于100 mL锥形瓶中,按1∶40(g∶mL)的料液比加入去离子水,置于超声锅中在50 ℃、420 W条件下超声振荡40 min。超声振荡完成后,以8 000 r/min离心5 min,取上清液,放置在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 纳米氧化锌的制备

将50 mL刺五加多酚提取液(多酚含量为30 mg/mL)和50 mL 0.5 mol/L的ZnSO4·7H2O溶液混合,用氢氧化钠调节pH到12。用磁力搅拌器在60 ℃下连续搅拌2 h。反应结束后室温下放置10 h,将凝集物10 000 r/min离心20 min取沉淀,用去离子水和乙醇多次洗涤,80 ℃干燥8 h,得到纳米氧化锌粉末,储存备用。

1.3 纳米氧化锌的结构表征

用紫外-可见分光光度计测定纳米氧化锌样品的紫外吸收峰,扫描范围为180~500 nm;以傅里叶变换红外光谱仪采集450~4 000 m-1范围内样品的红外吸收光谱图,表征样品的化学键合状态;以X-射线衍射仪表征样品的晶体结构,扫描范围为10°~80°;以扫描电镜和透射电镜分析样品的形貌及元素分布;以热重分析样品的热稳定性和组分;以粒度分析仪测定样品的粒径。

1.4 纳米氧化锌的抗氧化性能评价

1.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力测定

采用Brand-Williams等[24]改良的方法测定纳米氧化锌对DPPH自由基的清除能力。取2 mL一定浓度梯度的纳米氧化锌溶液,与4 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液混合,室温下避光静置30 min,在517 nm处测定其吸光度值,计算DPPH自由基清除率和半数抑制浓度(IC50)值。以无水乙醇为空白对照,平行试验3次,取其平均值。
D P P H 自 由 基 清 除 率 ( % ) = A 1 - ( A 2 - A 3 ) A 1 × 100。
式中:A1为空白对照无水乙醇吸光度值;A2为纳米氧化锌溶液吸光度值;A3为背景吸光度值。

1.4.2 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力测定

参照昌秦湘等[25]的方法并稍加改动,测定纳米氧化锌对ABTS自由基的清除能力。将7 mmol/L的ABTS溶液和2.5 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合,在室温下避光静置14 h。使用之前稀释,使其在734 nm处的吸光度值为0.70±0.05,即为ABTS储备液。取0.2 mL一系列浓度梯度的纳米氧化锌溶液,加入5.8 mL的ABTS储备液,混合均匀避光反应10 min,测定734 nm处的吸光度值,计算ABTS自由基清除率和IC50。以无水乙醇为空白对照,平行试验3次,取其平均值。
A B T S 自 由 基 清 除 率 ( % ) = B 1 - ( B 2 - B 3 ) B 1 × 100。
式中:B1为空白对照无水乙醇吸光度值;B2为纳米氧化锌溶液吸光度值;B3为背景吸光度值。

1.5 纳米氧化锌的抗菌性能评价

1.5.1 抑菌活性测定

采用琼脂打孔扩散法测定本试验绿色合成的纳米氧化锌及化学合成的氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。在超净台内,将灭菌的琼脂培养基倒入无菌平板,待冷凝后,吸取100 μL的菌悬液均匀涂布于平板上;使用打孔器在平板上打孔,另取100 μL纳米氧化锌和氧化锌溶液分别加于对应孔内,平板置于37 ℃培养箱过夜孵育,用游标卡尺测量抑菌圈直径,每组试验平行进行3次,取平均值。

1.5.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

采用液体培养基稀释法测定纳米氧化锌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。在一系列试管中,用液体培养基将纳米氧化锌溶液稀释成不同质量浓度(0、40、48、56、64、72、80、88、96 g/L),按1%(体积分数)接种沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌悬液,并测定其在600 nm处的吸光度值(OD600值,沙门氏菌OD600值=0.618±0.007、金黄色葡萄球菌OD600值=0.779±0.003、大肠杆菌OD600值=0.767±0.003),菌体浓度约为1×107 CFU/mL,在35 ℃、150 r/min条件下培养24 h,肉眼观察各试管的浑浊情况并测定OD600值,记录能抑制细菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度,且OD600值与初始值相比较变化应小于5%,其中不含纳米氧化锌的组为对照组。将最小抑菌浓度试管内的液体培养基取100 μL移种到新鲜的琼脂培养基上,于37 ℃培养24 h后,与对照组相比菌落总数降低3个数量级的纳米氧化锌质量浓度即为最小杀菌浓度。

1.6 数据统计分析

试验数据用WPS Office整理后,采用SPSS 21.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著,结果以平均值±标准差表示,并使用Origin 2019b进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 纳米氧化锌的生物合成

刺五加多酚提取液ZnSO4·7H2O溶液混合,反应混合物中出现黄白色凝集物,离心后将沉淀物用去离子水和乙醇多次洗涤后干燥,得到棕褐色纳米氧化锌粉末,如图1所示。
图1 纳米氧化锌合成

Fig.1 Synthesis of ZnO NPs

2.2 纳米氧化锌的结构表征

2.2.1 紫外-可见吸收光谱

图2为纳米氧化锌和氧化锌在200~400 nm波长处的紫外-可见吸收光谱,从图中可以看出,纳米氧化锌具有较宽的吸收范围,在361 nm处有较强的吸收峰,而氧化锌在此范围内无任何特征吸收峰。
图2 纳米氧化锌和氧化锌的紫外-可见吸收光谱

ZnO NPs:纳米氧化锌 zinc oxide nanoparticles;ZnO:氧化锌 zinc oxide。下图同 the same as below。

Fig.2 UV-visible absorption spectra of ZnO NPs and ZnO

2.2.2 红外吸收光谱

图3为纳米氧化锌和氧化锌的红外吸收光谱。从图中可以看出,刺五加多酚提取液制备的纳米氧化锌与氧化锌标准品的红外吸收光谱相似,在3 350~3 450 cm-1之间的宽峰是由于氧化锌表面羟基(-OH)的伸缩振动导致的。在曲线a中,1 631.45 cm-1处的尖峰是酚类物质中的羰基(C=O)进行非对称性振动产生的[26];由于硫酸根离子(SO42-)的非对称伸缩振动使其在1 016.21 cm-1处产生了1个吸收峰[27];而556.01 cm-1处的吸收峰属于纳米氧化锌的特征吸收峰[28]。在曲线b中,1 638.05 cm-1处的吸收峰是由于水结构基团(H-O-H)弯曲振动产生的,说明氧化锌分子内存在结晶水或者游离水[29];在493.30 cm-1处的峰属于氧化锌的特征吸收峰[30]。
图3 纳米氧化锌和氧化锌的红外吸收光谱

Fig.3 Infrared absorption spectra of ZnO NPs and ZnO

2.2.3 晶体结构

从图4中可以看出,XRD衍射峰分别出现在31.67°(100)、34.47°(002)、36.18°(101)、47.46°(102)、56.56°(110)、62.86°(103)、66.44°(200)、67.84°(112)、69.08°(201)、72.66°(004)、77.09°(202)处,所有的衍射峰均与JCPDS卡(No.36-1451)中报道的氧化锌标准卡片相吻合。
图4 纳米氧化锌和氧化锌的X-射线衍射图

Fig.4 X-ray diffraction pattern of ZnO NPs and ZnO

2.2.4 表面形貌

利用扫描电镜对生物合成的纳米氧化锌和氧化锌标准品的表面形貌进行表征,如图5所示。从图5-A和图5-B可以观察到纳米氧化锌表面的形貌并不规则,且其形貌是不定形;从图5-E可以看出氧化锌的形貌规整;此外,从图5-C和图5-D可以看出纳米氧化锌呈微团聚状;从图5-F可以看出化学方法合成的氧化锌表现为中等聚集。
图5 纳米氧化锌(A、B、C和D)和氧化锌(E和F)的扫描电镜图像

Fig.5 SEM images of ZnO NPs (A, B, C and D) and ZnO (E and F)

2.2.5 形态和粒度分布

通过透射电镜研究了纳米氧化锌的形态和粒度分布,如图6所示。根据透射电镜结果,可以推断出纳米氧化锌颗粒的形状是不规则的和球形的。在透射电镜显微照片中,纳米颗粒几乎不分散,单个的纳米颗粒被识别为块状点,在对透射电镜图像进行数字化后,计算了粒径分布,发现结果与X-射线衍射研究所得结果一致。
图6 纳米氧化锌的透射电镜图像

Fig.6 TEM images of ZnO NPs

2.2.6 热稳定性

本试验通过热重-微商热重分析(TG-DTG)和热重-差热分析(DTA)研究了绿色合成的纳米氧化锌在29~800 ℃温度范围内不同升温速率下的热稳定性。图7显示的是纳米氧化锌的TG-DTG和TG-DTA曲线,从图中可以看出,纳米氧化锌质量损失快速变化的起始温度为160 ℃左右,终止温度为244 ℃左右;差热分析(DTA)和微商热重(DTG)曲线均在200 ℃左右有1个热吸收峰,表明此时物质在热分解下发生了焓变和活化能的变化,其中包含有机物脱水、发生热分解以及一些相变等[31]。
图7 纳米氧化锌的TG-DTG(A)和TG-DTA曲线(B)

TG:热重分析 thermogravimetric analysis;DTG:微商热重分析 derivative thermogravimetry;DTA:差热分析 differential thermal analysis。

Fig.7 Curves of TG-DTG (A) and TG-DTA (B) of ZnO NPs

2.2.7 粒径分布

纳米氧化锌和氧化锌的粒径分布如图8所示。从图中可以看出,纳米氧化锌的粒径主要分布在40~130 nm,而氧化锌的粒径主要分布在240~620 nm,其平均粒径分别为77.45和413.33 nm。
图8 纳米氧化锌和氧化锌的粒径分布

Fig.8 Size distribution of ZnO NPs and ZnO

2.3 纳米氧化锌的抗氧化性能

2.3.1 DPPH自由基清除能力

图9所示的是纳米氧化锌对DPPH自由基的清除能力,从图中可以看出,在质量浓度为6 g/L时,纳米氧化锌对DPPH自由基的清除率达到93.28%,与维生素C接近;纳米氧化锌对DPPH自由基的IC50为1.3 g/L。
图9 纳米氧化锌对DPPH自由基的清除能力

Fig.9 Scavenging capacity of ZnO NPs to DPPH radical

2.3.2 ABTS自由基清除能力

图10所示的是纳米氧化锌对ABTS自由基的清除能力,从图中可以看出,纳米氧化锌对ABTS自由基的清除率与其质量浓度呈正相关,在质量浓度为9 g/L时,纳米氧化锌对ABTS自由基的清除率达到73.83%;纳米氧化锌对ABTS自由基的IC50为5.177 g/L。
图10 ZnO NPs对ABTS自由基的清除能力

Fig.10 Scavenging capacity of ZnO NPs to ABTS radical

2.4 纳米氧化锌的抗菌性能

2.4.1 抑菌活性

绿色合成的纳米氧化锌和化学合成的氧化锌的抑菌活性如图11所示,从图中可以看出,在添加了纳米氧化锌的培养基上出现了抑菌圈,说明绿色合成的纳米氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。表1列出了纳米氧化锌和氧化锌对3种指示菌的抑菌圈直径,纳米氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(26.37±0.02) mm、(20.56±0.02) mm、(22.26±0.05) mm,氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(17.79±0.06) mm、(12.99±0.04) mm、(16.65±0.03) mm。
图11 纳米氧化锌和氧化锌对沙门氏菌(A)、大肠杆菌(B)和金黄色葡萄球菌(C)的抑菌圈

Fig.11 Inhibition zones of ZnO NPs and ZnO against Salmonella (A), Escherichia coli (B) and Staphylococcus aureus (C)

表1 纳米氧化锌和氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

Table 1 Inhibition zone diameters of ZnO NPs and ZnO against Salmonella, Escherichia coli and Staphylococcus aureusmm

菌株
Strains		 抑菌圈直径 Inhibition zone diameter
纳米氧化锌 ZnO NPs 氧化锌 ZnO
沙门氏菌 Salmonella 26.37±0.02 17.79±0.06
大肠杆菌 Escherichia coli 20.56±0.02 12.99±0.04
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 22.26±0.05 16.65±0.03

2.4.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

从图12中可以看出,培养24 h后,随着纳米氧化锌质量浓度的增加,OD600值先迅速降低后趋于稳定;当纳米氧化锌的质量浓度≥64 g/L时,沙门氏菌、大肠杆菌培养24 h后OD600值与初始OD600值无显著改变(P>0.05);当纳米氧化锌的质量浓度≥80 g/L时,金黄色葡萄球菌培养24 h后OD600值与初始OD600值无显著改变(P>0.05)。上述结果表明纳米氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度均为64 g/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为80 g/L。
图12 纳米氧化锌对沙门氏菌(A)、大肠杆菌(B)、金黄色葡萄球菌(C)的最小抑菌浓度

数据柱标注“*”和“**”分别表示培养24 h后OD600值与初始OD600值之间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

Fig.12 Minimal inhibitory concentrations of ZnO NPs against Salmonella (A), Escherichia coli (B) and Staphylococcus aureus (C)

Data columns with “*” and “**” indicated significant (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) between the OD600 value after 24 h of incubation and the initial OD600 value, respectively.

在含不同浓度梯度纳米氧化锌的培养基中培养24 h后的菌液平板计数结果见表2。未添加纳米氧化锌的对照组的沙门氏菌的菌落总数为(7.32±0.01) lg (CFU/mL),大肠杆菌的菌落总数为(7.48±0.01) lg(CFU/mL),金黄色葡萄球菌的菌落总数为(7.91±0.00) lg (CFU/mL)。当纳米氧化锌质量浓度为80 g/L时,沙门氏菌和大肠杆菌的菌落总数均降低3个数量级,此浓度即为纳米氧化锌对沙门氏菌和大肠杆菌的最小杀菌浓度;当纳米氧化锌质量浓度为88 g/L时,金黄色葡萄球菌的菌落总数降低了3个数量级,此浓度即为纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度。因此,纳米氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度分别为80、80、88 g/L。
表2 纳米氧化锌对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的杀菌效果

Table 2 Bactericidal effect of ZnO NPs on Salmonella, Escherichia coli and Staphylococcus aureus

纳米氧化锌质量浓度
Mass concentrations of
ZnO NPs/(g/L)		 菌落总数 Colony count/[lg(CFU/mL)]
沙门氏菌
Salmonella		 大肠杆菌
Escherichia coli		 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
0 7.32±0.01 7.48±0.01 7.91±0.00
40 6.86±0.01 6.92±0.01 6.95±0.00
48 5.40±0.01 6.57±0.03 6.73±0.02
56 5.26±0.01 4.31±0.01 6.26±0.02
64 5.15±0.01 4.24±0.02 5.88±0.02
72 4.59±0.02 3.90±0.00 5.56±0.05
80 3.24±0.05 2.95±0.01 4.99±0.04
88 0.00±0.00 1.93±0.03 2.97±0.02
96 0.00±0.00 0.00±0.00 1.71±0.03

3 讨论

紫外-可见光谱学分析是研究和评价纳米粒子光学性质的一种简单而又重要的方法。本试验所得纳米氧化锌紫外吸收峰在361 nm处,有报道称纳米氧化锌的吸收光谱在330~368 nm[32],本试验所的结果与此报道相符。植物中次生代谢物可以将溶液中的锌离子还原为氧化锌,植物提取物在该氧化还原反应中既有还原剂的作用,还有稳定剂的作用。
为了验证刺五加多酚提取液对纳米氧化锌晶体结构的影响,将绿色合成的纳米氧化锌与氧化锌标准品进行比对,从图4可以看出,绿色合成的纳米氧化锌的特征峰与标准品氧化锌的特征峰基本一致,说明刺五加多酚的嵌入并没有改变纳米氧化锌的晶体结构。在(100)、(002)和(101)处出现衍射峰,表明纳米氧化锌具有纤锌矿结构(又叫hcp结构);位于(101)处的衍射峰表明纳米氧化锌沿着氧化锌容易结晶的方向生长[33];(002)衍射峰值的增加表明纳米氧化锌呈各向异性形态,且纳米氧化锌沿轴向是其优势生长方向,这与前人的报道[34]相一致。
从图5-C和图5-D可以看出纳米氧化锌呈微团聚状,这是植物提取物绿色合成纳米颗粒的典型特征[35]。这是由于通过生物合成法合成的纳米颗粒具有更高的表面积,并且纳米粒子之间的亲和力更加持久从而使纳米颗粒发生聚集[36];而化学合成的氧化锌表现出中等聚集(图5-F),这可能是由于合成过程中有杂质存在导致的[37]。二者对比可以看出,植物提取物在很大程度上影响着纳米离子的稳定性和聚集性。
与氧化锌相比,纳米氧化锌的粒径更小,这从X-射线衍射图得到的结晶峰上也可以看出。多分散系数(polydispersity index,PDI)的值越小,表明颗粒分散性越好。纳米氧化锌的PDI=0.144、氧化锌的PDI=0.799,从PDI可以看出纳米氧化锌的分散性要远高于氧化锌,表明绿色合成的纳米氧化锌粒径较小并且分散均匀,这与X-射线衍射、扫描电镜、透射电镜的结果一致。
DPPH自由基是一种稳定的自由基,在517~520 nm处有特征吸收,常被用来研究抗氧化剂的构效关系[38]。本试验结果显示,在质量浓度为6 g/L时,纳米氧化锌对DPPH自由基的清除率达到93.28%,与维生素C接近,表明绿色合成的纳米氧化锌具有良好的抗氧化活性。本试验绿色合成的纳米氧化锌的抗氧化活性要优于Suresh等[39]用决明子植物提取物制作的纳米氧化锌(IC50=8.00 g/L)。罗帆等[23]以藤茶黄酮为原料,采用溶液燃烧法绿色制备纳米氧化锌粉末,使用布兰德-威廉姆斯法考察绿色合成的纳米氧化锌的抗氧化性能,结果表明,2.5 g/L的纳米氧化锌溶液对DPPH自由基的清除率为98.24%。上述结果表明通过生物模板法绿色合成的纳米氧化锌具有良好的抗氧化性能。
ABTS常用于评估药物和天然产物对活性氧的抵抗能力和防止氧化反应的效果,ABTS经氧化后生成较稳定的蓝绿色ABTS自由基,在可见光区734 nm处有最大吸收峰。对ABTS的清除能力可以用来评价纳米氧化锌的抗氧化活性。清除自由基主要是通过抗氧化剂转移电子或转移氢给自由基。DPPH自由基的消除途径主要是由抗氧化剂转移氢给自由基,而ABTS自由基的清除途径既可以通过转移电子也可以通过转移氢给自由基。比较图9和图10可发现,纳米氧化锌对ABTS自由基的清除能力要低于对DPPH自由基的清除能力,这是由于本试验所制备的纳米氧化锌清除自由基的途径主要是通过转移氢给自由基,其转移电子的能力较弱。
琼脂打孔扩散法是衡量细菌对药物敏感性的最常使用的方法,其具有成本低、操作简便、结果准确、可直观准确判定药物的抑菌活性等优点。从抑菌圈直径看,纳米氧化锌的抑菌效果要优于氧化锌,说明本试验所得的纳米氧化锌对固体培养基上生长的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性。有研究称,由于纳米颗粒的粒径尺寸减小和比表面积增大,使得其活性大大增强[33],其抗菌活性也大大增强。由于绿色合成的纳米氧化锌对细菌细胞膜的亲和力增强,使得纳米氧化锌的穿透力增强,从而破坏细胞形态,使其内容物外漏,起到抑菌效果。程忠等[20]以槐米提取物为原料,采用绿色合成法制备氧化锌纳米粒子,绿色合成法制得的不规则颗粒状的纳米氧化锌粒径约为235 nm,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.250 g/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.125 g/L,证明其抗菌性能良好。
通过最小抑菌浓度可知,纳米氧化锌对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果要好于金黄色葡萄球菌。有文献表明,纳米氧化锌对革兰氏阴性菌的抑制作用更加明显,这是因为革兰氏阳性菌细胞壁外周存在多层肽聚糖,而革兰氏阴性菌细胞壁外的肽聚糖较薄、容易被损坏,且内外膜之间的周质区屏障容易溶解[32]。罗帆等[23]以藤茶黄酮为原料,成功合成平均粒径约为32.7 nm的六方晶系纤锌矿结构的纳米氧化锌,使用透明抑菌圈法考察绿色合成的纳米氧化锌的抑菌性能,结果表明,绿色合成的纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.00 g/L,表明绿色合成的纳米氧化锌具有良好的抗菌性能。
本试验以刺五加多酚为原料成功绿色合成纳米氧化锌,该纳米氧化锌平均粒径为77.45 nm,其形态为六方晶系纤锌矿结构,结晶度良好,具有良好的抗氧化和抗菌性能。封琦等[22]以水花生提取物为原料合成绿色合成纳米氧化锌,并评价了该绿色合成的纳米氧化锌对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的体外抗病毒效果,结果表明,水花生提取物成功合成平均粒径为43.8 nm的六棱柱形的纳米氧化锌,且在细胞安全质量浓度(0.12 mg/mL)下该纳米氧化锌对PRRSV的直接灭活作用要显著优于阻断作用和预防作用。
综上可知,以植物提取物为原料,采用绿色合成的方法制备纳米氧化锌,是一种切实可行的方法,通过绿色合成方法制备的纳米氧化锌具有良好的抗氧化和抗菌性能,且该方法具有操作条件温和、价格低廉等优点,可为纳米氧化锌作为饲料添加剂应用于畜禽生产中奠定基础。

4 结论

本试验以刺五加多酚为原料,采用绿色合成的方法成功制得平均粒径为77.45 nm的纳米氧化锌,该纳米氧化锌形态为六方晶系纤锌矿结构,结晶度良好,具有良好的抗氧化和抗菌性能。

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