庆大霉素(gentamicin,GM)是一种多组分氨基糖苷类抗生素,由庆大霉素C1、C1a、C2、C2a等构成,分子质量分别为477.6(C1)、449.5(C1a)、463.6(C2+C2a)[1⇓-3];其结构中含有氨基糖和氨基环醇,通过穿透细菌细胞,改变其整体渗透性并导致细胞裂解而起作用[4],结构式如图1所示。庆大霉素是广谱抗生素,对葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、炭疸杆菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌等革兰氏阴性菌均有良好抑杀作用[5],对结核杆菌的杀菌力也较强,是目前我国畜牧业和水产业中常用的兽药之一,主要用于敏感菌引起的消化道、呼吸道、泌尿生殖系统感染及败血症等。对猪、牛、羊的治疗,如肺炎、鼻炎等,可抑制引起呼吸道感染的细菌的生长,减轻炎症症状,并帮助恢复呼吸系统的正常功能,修复肠道功能,减轻腹泻症状,并促进消化道健康[6-7]。在水产领域,庆大霉素用于治疗鱼类的许多细菌性感染疾病,包括细菌性鳃炎、皮肤溃疡、细菌性肝胰脏炎等,浸泡和清洗鱼卵可预防松鳞病[8]。庆大霉素以饮水使用或注射使用为主,还可以80~100 g/t的含量加入饲料中用于预防和治疗,由于具有效果明显、使用方便、群体治疗、均匀分布等优势,得到了养殖行业的青睐。庆大霉素具有耳毒性及肾毒性,可能造成内耳平衡觉或是听觉丧失,且问题可能伴随终身[9]。同时饲料中添加的庆大霉素被动物机体吸收,产生动物蓄积,使人食用含有庆大霉素的动物性食品后在人体内产生耐药性和一定的毒性[10-11]。因此,饲料中庆大霉素的残留和抗生素污染已成为国内外的关注热点之一。农业部出台了一系列公告禁止抗生素在饲料中的使用,并于2019年发布194号公告,规定自2020年起,饲料生产商停止生产含有促进生长类饲料添加剂的商用饲料,随着抗生素在饲料中的禁用[12⇓-14],庆大霉素也正式在饲料中禁用。然而,庆大霉素在饲料中非法添加和外源污染问题时有发生,对饲料工业发展、环境安全和生命健康都有一定的影响。因此,对饲料中庆大霉素的残留情况进行研究具有重要意义。
目前关于庆大霉素含量检测主要以动物性食品以及尿液为主[15⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓-25],检测方法多样。如Heller等[23]开发并验证了几种牛组织中庆大霉素含量的测量方法,该方法的范围为10~50 ng/g,定量限(LOQ)为26 ng/g。刘雪红等[24]用液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定牛乳中庆大霉素的含量,其含量测定下限为10 μg/kg。吕芳等[25]对鲟中庆大霉素含量测定方法进行确立,10和25 μg/kg分别为方法的检出限和LOQ。目前,大多数检测方法的分析都是采用筛选与半定量分析法,对庆大霉素C1、C1a、C2、C2a的成分的区分以及准确的测定它们的含量效果不理想。然而,液相色谱-串联质谱法具有多组分分析、灵敏度高等优点,适用范围广等特点。
因此,本研究旨在建立1种适用于饲料中庆大霉素含量检测的方法,使用固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱检测,达到适用于饲料中检测其目标物的目的,旨在为我国饲料中庆大霉素的监测提供一种简便、准确、灵敏的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
AB SCIEX QTRAP® 6500+型超高效液相色谱-串联质谱仪(美国SCIEX公司):配备电喷雾电离源;庆大霉素标准品(纯度>89.8%,其中C1 29.5%、C1a 19.8%、C2+C2a 50.7%,德国Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸(德国Sigma公司,色谱纯);乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher ChenAlert Guide公司);三氯乙酸(上海麦克林生物化学技术有限公司);甲酸铵(美国MREDA公司,色谱纯);乙二胺四乙酸二钠(广东西陇科技公司);磷酸氢二铵(北京百灵威技术有限公司);七氟丁酸酐(上海安谱实验技术有限公司,色谱纯);其余的试剂均从国药化工股份有限公司购买。试验用水为经Milli-Q纯化制备的一级水(>18.2 Ω);0.22 μm有机尼龙滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司);Cleanert PCX固相萃取柱(60 mg/3 mL,天津博纳艾杰尔技术有限公司);200 mg/6 mL的Oasis HLB固相萃取柱、60 mg/3 mL的Oasis MCX固相萃取柱(美国Waters公司);C18固相提取柱(500 mg/6 mL)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。根据试验设计,选用了国家饲料质量监督检验中心(北京)的不同基质的饲料样品,并保证其代表性。
1.2 试验方法
1.2.1 提取溶液的配制
精确称取磷酸二氢钾1.36 g,用980 mL水溶解,再添加0.15 g乙二胺四乙酸二钠及50 g三氯乙酸,使其溶解,均匀,定容体积为1 000 mL,于4 ℃贮存,有效期1个月。
1.2.2 复溶液的配制
1%七氟丁酸酐醋酸溶液:精确量取七氟丁酸酐0.5 mL,加入0.3 mL乙酸,水定容至50 mL,于4 ℃贮存,有效期1个月。
2 mol/L的甲酸铵溶液:称取甲酸铵12.6 g,水定容至100 mL,于4 ℃贮存,有效期1个月。
1%七氟丁酸酐醋酸:2 mol/L的甲酸铵溶液(90∶10,v/v):精确量取1%七氟丁酸酐醋酸溶液9 mL,2 mol/L的甲酸铵溶液1 mL,随用随配。
1.2.3 标准溶液的配制
1) 庆大霉素标准储备液:准确称取庆大霉素标准品5.5 mg(精确到0.1 mg),用水溶解并定容到10 mL,即为500 μg/mL标准品储备液,可在-20 ℃避光条件下存放6个月。
2) 标准中间液:吸取上述储备液1.0 mL于10 mL容量瓶中,用水稀释并定容到10 mL,配制成50 μg/mL。存放于4 ℃冷藏柜,现用现配。
3) 标准工作液:精确量取标准中间溶液,配制不同浓度标准工作液的空白基质,以备使用。
1.2.4 样品前处理
准确称量5 g饲料样品,并添加20 mL三氯乙酸萃取液。超声提取30 min,10 000 r/min离心5 min,收集上清液,待用。PCX固相萃取柱以甲醇3 mL、水3 mL顺序活化,精密吸取5 mL上清液,再加3 mL水、3 mL甲醇洗涤,再用3 mL 10%氨水-甲醇溶液进行洗脱,40 ℃氮气吹干,准确加入1 mL 1%七氟丁酸酐醋酸:2 mol/L的甲酸铵溶液(90∶10,v/v)将残留物溶解,混匀后过0.22 μm滤膜,用LC-MS/MS测定。
1.2.5 色谱和质谱条件
色谱柱:SB-Aq色谱柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱温:40 ℃;进样量:5 μL;流动相流速:0.4 mL/min,流动相梯度洗脱条件见表1。
表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions% |
| 时间 Time/min | 2 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸溶液 2 mmol/L ammonium formate-0.1% formic acid solution | 乙腈 Acetonitrile |
|---|---|---|
| 0 | 90 | 10 |
| 1.0 | 90 | 10 |
| 4.0 | 70 | 30 |
| 4.1 | 5 | 95 |
| 5.0 | 5 | 95 |
| 5.1 | 90 | 10 |
| 8.0 | 90 | 10 |
质谱采用电喷雾电离源、多反应监测监控(MRM)模式;喷雾电压为3.2 kV;离子源的温度在350 ℃;采用空气作为气帘,以氮气作为碰撞气体,在使用之前,调整各个气流的流速,使得质谱的灵敏度满足测定的需要,进行分段收集。表2为庆大霉素质谱条件。
表2 庆大霉素质谱条件Table 2 Mass spectrometry conditions of gentamicin |
| 药物名称 Drug name | 出峰时间 Peak time/min | 离子对 Ion pairs/(m/z) | 去簇电压 DP/V | 碰撞能 CE/eV | |
|---|---|---|---|---|---|
| C1a | 3.74 | 450.0>322.2* 450.0>274.0 | 70 | 20 | |
| 30 | |||||
| 30 | |||||
| 庆大霉素Gentamicin | C2+C2a | 3.78 | 464.0>322.2* 464.0>288.0 | 70 | 20 |
| 35 | |||||
| 35 | |||||
| C1 | 3.82 | 478.2>322.2* 478.2>157.2 | 70 | 20 | |
| 30 | |||||
| 35 | |||||
*为定量离子。 | |
* for quantitative ions. |
2 结果与分析
2.1 质谱条件优化
配制10 μg/mL庆大霉素标准溶液,采用微流率泵直接进样,并对质谱条件进行优化。因正负离子的感应强度高于负离子,故使用ESI+模式进行测量。用一级全扫描质谱法鉴定庆大霉素母离子[M+H]+质荷比(m/z)分别为450.0、464.0、478.2;采用子离子扫描法获得次级质谱,获得3个具有较大m/z和较稳定的3个组:322.2、274.0,322.2、288.0以及322.2、157.2;在这些样品中,反应强度最大、本底干扰较少的是450.0/322.2、464.0/322.2、478.2/322.2,因此被选择作为定量离子对;另外2个作为定性质量对450.0/274.0、478.2/157.2。在MRM模型中,试验对这2种离子的去簇电压和碰撞电压进行优化,得到的数据如表2所示。
2.2 色谱条件优化
本试验采用SB-Aq色谱柱。SB-Aq是一款极性封尾C18键合硅胶色谱柱,能提高分离难度较大的酸、碱、极性物质的保留,且保留效果优于常规C18柱,由于它亲水性的表面,可以在100%水溶液的流动相中进行使用,从而避免了固定相塌缩现象。因此,SB-Aq色谱柱对极性化合物仍然具有较好的重现性和较好的峰形[26]。SB-Aq色谱柱最低可以用到pH=1,最高可以用到80 ℃的条件,为本试验中强酸性七氟丁酸酐的使用提供了良好的条件。以0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),2 mmol/L甲酸铵溶液-0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),水(A)-乙腈(B),2 mmol/L甲酸铵溶液(A)-乙腈(B),以及2 mmol/L甲酸铵溶液(A)-乙腈(B)为流动相[27],考察出峰时间、分离效果、峰形等,如图2所示。
图2 不同流动相的庆大霉素MRM色谱图A:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B);B:2 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B);C:水(A)-乙腈(B);D:2 mmol/L甲酸铵溶液(A)-乙腈(B)。 Fig.2 MRM chromatogram of gentamicin in different mobile phases A: 0.1% formic acid solution (A) -acetonitrile (B); B: 2 mmol/L ammonium formate-0.1% formic acid solution (A) -acetonitrile (B); C: water (A) - acetonitrile (B); D: 2 mmol/L ammonium formate solution (A) -acetonitrile (B). |
2.3 不同浓度七氟丁酸酐醋酸溶液的比较
由于1%七氟丁酸酐醋酸溶液呈强酸性,故试验设置了不同浓度的七氟丁酸酐醋酸溶液进行比较。本试验以0.05%、0.50%、1.00%七氟丁酸酐醋酸溶液为试验对象,考察了其出峰时间、分离效果和色谱柱的使用寿命等,如图4所示。结果显示,0.05%、0.50%、1.00%的七氟丁酸酐醋酸溶液的出峰时间分别为0.85、0.81、0.81 min;在0.82、0.81、0.81 min分离度较差。而1%七氟丁酸酐醋酸溶液的出峰时间分别为3.74、3.78、3.82 min,明显分离度较好。
图4 不同浓度七氟丁酸酐醋酸溶液MRM色谱图A:0.05%七氟丁酸酐醋酸溶液;B:0.5%七氟丁酸酐醋酸溶液;C:1%七氟丁酸酐醋酸溶液。 Fig.4 MRM chromatogram of acetic acid solution of heptafluorobutyric anhydride at different concentrations A: 0.05% heptafluorobutyric anhydride acetic acid solution; B: 0.5% heptafluorobutyric anhydride acetic acid solution; C: 1% heptafluorobutyric anhydride acetic acid solution. |
2.4 提取试剂选择
在配合饲料中,用2%、3%、5%、10%三氯乙酸溶液为溶剂,对其进行提取试验,测定了10份饲料试样,分别用20 mL 4种不同浓度的提取液,按照1.2.2方法进行试验,得到了如下的结果,根据图5可知,2%~3%三氯乙酸的回收率在30%~90%,5%三氯乙酸的回收率在70%~95%。
2.5 固相萃取柱的优化
2.5.1 固相萃取柱的选择
本试验以PCX、MCX、HLB、C18为固相萃取柱,对其进行了分离纯化。在4种不同的固相萃取柱中分别添加甲醇3 mL,待甲醇排出后,加3 mL水,再加样品提取液5 mL,向PCX、MCX柱中加入3 mL水和甲醇淋洗,最后,用3 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脱PCX和MCX柱,同时C18、HLB固相萃取柱用3 mL甲醇洗脱,将收集到的分离液氮气吹至近乎干燥,分别用1 mL七氟丁酸酐乙酸:2 mol/L甲酸铵溶液(90∶10,v/v)溶解残渣,上机测定,得到结果如图6所示。
由图6可见,PCX固相萃取柱纯化后,其对饲料中庆大霉素的回收率达100%,而MCX、HLB、C18固相萃取柱的回收率相对不高。
2.5.2 洗脱试剂的优化
通过试验,考察了不同配比的氨水-甲醇溶液对庆大霉素的洗脱作用,并按此方法将其加入不同的氨水-甲醇溶液洗脱,最后在计算机上进行测定,得到的结果如图7所示,用10%氨水-甲醇溶液进行洗脱,其在饲料中的回收率最高。其他配比的氨水-甲醇溶液虽有较好的回收率,但没有10%氨水-甲醇溶液的效果好。
2.5.3 洗脱溶液用量的优化
2.6 基质效应
然而,饲料中各种成分复杂,基质干扰严重,因此必须对其进行校正。采用1.2.2方法对不同的饲料样本进行预处理,用该基质提取物作为稀释液,配制1、5、10、20、50、100 mg/L基质标准液,与直接用1%七氟丁酸酐醋酸溶液∶2 mol/L的甲酸铵溶液(90∶10,v/v)配制作对比,结果见图9。庆大霉素表现为基质增强,增强0~20%。
2.7 标准曲线线性方程、方法检出限和定量限
根据以上条件的确定,用空白基质溶液制备庆大霉素,使之含有定量限的从低到高5个浓度,分别为1、5、10、20、50、100 mg/L,经LC-MS/MS测定分析,用该方法测定的离子色谱的峰面积与基质加入的标准液的浓度进行了比较。通过对定量离子色谱峰信噪比为S/N等于3和10,求出了检出限及定量限,如表3所示。基质中加入标样的浓度范围为1.0~100.0 mg/L,其线性关系较好;方法检测限0.03 mg/kg,定量限0.1 mg/kg。
表3 基质添加标准曲线的线性方程和相关系数Table 3 Linear equations and regression coefficients of matrix-matched standard calibration curves |
| 饲料基质 Feed matrix | 线性方程 Linear equation | 相关系数 R2 | 检出限 LOD/(mg/kg) | 定量限 LOQ/(mg/kg) |
|---|---|---|---|---|
| 配合饲料 Compound feed | y=36 915x-36 476 | 0.998 2 | 0.03 | 0.1 |
| 浓缩饲料 Concentrated feed | y=34 964x-41 256 | 0.998 6 | 0.03 | 0.1 |
| 预混料 Premix | y=34 921x-44 127 | 0.995 2 | 0.03 | 0.1 |
2.8 回收率试验和精密度考察
准确称重5 g配合饲料、预混料、浓缩饲料,分别添加不同浓度的庆大霉素标准品,配制成1、10、100 mg/kg浓度的标准品,按照以上方法测定,在每个样品做6个平行的条件下连续3 d检测平均回收率、批间变异差异系数。根据表4,其平均回收率为81.5%~123.6%,相对标准偏差<15%。
表4 不同饲料中添加庆大霉素的回收率及精密度Table 4 Recovery rate and precision of gentamicin added to different feeds (n=6) |
| 项目 Item | 含量 Content/ (mg/kg) | 配合饲料 Compound feed | 浓缩饲料 Concentrated feed | 预混料 Premix | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 平均回收 率±相对标 准偏差 Average recovery rate±RSD/% | 批间变 异系数 Inter coefficient of variation | 平均回收 率±相对标 准偏差 Average recovery rate±RSD/% | 批间变 异系数 Inter coefficient of variation | 平均回收 率±相对 标准偏差 Average recovery rate±RSD/% | 批间变 异系数 Inter coefficient of variation | ||
| 庆大霉素 Gentamicin | 1 | 90.5±12.3 | 13.6 | 81.5±5.1 | 6.3 | 83.9±8.0 | 9.6 |
| 10 | 122.3±6.2 | 5.1 | 116.5±8.3 | 7.1 | 101.8±8.1 | 8.0 | |
| 100 | 123.6±3.6 | 2.9 | 119.2±2.0 | 1.6 | 105.5±3.5 | 3.4 | |
3 讨论
3.1 七氟丁酸酐的使用
庆大霉素化合物是亲水性的,通常较难保留在色谱柱上,采用离子对试剂的添加,可以有效地提高其保留率。常用的离子配对试剂有:己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠以及七氟丁酸等。在这些化合物中,磺酸盐的挥发性较差,很难用质谱法进行测定[28]。而七氟丁酸的沸点较低,容易挥发,而且比其他离子配对试剂更能改善电喷雾过程,因此,七氟丁酸常被用作液-质联用方法中的离子对试剂。但七氟丁酸可引起柱效不可逆性破坏,使柱效时间变短。因此,在本试验中,为了减少对仪器的干扰和色谱柱的损伤,采用了将七氟丁酸酐醋酸溶液作为复溶液而不加入流动相的方式。
经试验证实,用1%七氟丁酸酐醋酸溶液作复溶液,在不会对电喷雾中负离子模式产生不利的前提下,庆大霉素能获得良好的电离度、峰形。然而,1%七氟丁酸酐醋酸溶液pH在1左右,偏酸,在一定程度上减少了色谱柱的寿命,故在保证同样效果的情况下对1%七氟丁酸酐醋酸溶液进行pH的调整,通过试验,最终使用1%七氟丁酸酐醋酸∶2 mol/L的甲酸铵溶液(90∶10,v/v)作为复溶液,使其pH在4~5。
3.2 流动相的选择
3.3 提取
由于庆大霉素水溶性高,易与组织成分结合,色谱分离较难;而且衍生化条件的普适性不强,导致了它们的理化分析方法比较繁琐,并且通常灵敏度不高。Bijleveld等[32]用10%的三氯乙酸沉淀血浆后,使用离子对反相色谱法检测血液中的庆大霉素含量;Kim[33]使用2%三氯乙酸溶液去除杂质来测定肉中的庆大霉素及其他抗生素含量。赵宝国等[30]使用5%三氯乙酸溶液沉淀猪肉中的蛋白等杂质,HLB柱净化并建立了LC-MS测定猪肉中庆大霉素的方法。本试验采用2%~10%的三氯乙酸进行提取,综合分析发现,庆大霉素在5%三氯乙酸提取效果较好,故最终选取5%三氯乙酸作为提取饲料中庆大霉素的提取剂。在此基础上,添加乙二胺四乙酸二钠,以降低其对金属离子的络合能力,加快其释药速度[34]。
3.4 净化
饲料中富含矿物质、维生素及蛋白质,采用适当的提纯技术,使其含量精确测定,显得尤为重要[35]。固相萃取是一种新兴的萃取技术,其净化效果好,回收率高,溶剂消耗量小,操作简便,省时省力[36]。本试验选用4种常用的不同类型的固相萃取柱,对其进行净化,结果显示PCX对其有较好的净化效果。为获得较高的回收率,我们对洗脱剂也作了严格的优化,如图4所示。由于PCX是一种具有反相、强阳离子交换功能的净化柱,在一定浓度氨水供给下,可以有效地将庆大霉素洗脱出来。但氨水浓度太高或太低都会影响产品的收率,分析其原因,主要是氨水浓度太低,无法提供充足的阳离子,造成淋洗不彻底;然而,过量氨水的存在会对庆大霉素的稳定性产生一定的影响。
3.5 基质效应
根据试验数据,基质效应增强0~20%,可能原因:一是电荷转移增效,液体基质分子与样品中的分析物分子发生电荷转移作用,使得分析物分子带上额外的电荷,以增强其电离过程。从而增加分析物的电离效率;二是化学反应增效,液体基质中存在一些与分析物分子发生化学反应的官能团,例如氢键供体或供体-受体的相互作用。这些反应有助于降低分析物的电离能量,加快电离过程,从而提高质谱信号;三是电子耦合增效,液体基质分子与样品中的分析物分子通过电子耦合作用形成电子共享体系,提高被测物质的力学稳定性及离子化效率,从而增强质谱信号。然而具体哪种原因导致,还需进一步研究。
3.6 方法性能
目前国内外鲜见有关饲料中庆大霉素含量的研究,由于饲料组成复杂,形态多样,传统的提取纯化方法存在基质干扰问题,需对提取纯化方法进行进一步优化。本试验采用LC-MS/MS进行检测,此方法的检出限为0.03 mg/kg,定量限为0.1 mg/kg;加标饲料样品中添加的不同浓度(1、10、100 mg/kg)的庆大霉素的平均回收率为81.5%~123.6%,相对标准偏差小于15%。因此,本研究拟构建的液质联用技术测定饲料中的庆大霉素含量,能够达到对饲料中违禁添加剂的测定标准,从而保证该方法的准确度。
4 结论
本研究通过优化前处理工艺,优化提取、纯化等前处理条件,并采用LC-MS/MS技术,实现对饲料中庆大霉素含量的快速检测。结果表明,该方法的检出限和定量限分别为0.03和0.1 mg/kg,加标回收率为81.5%~123.6%,相对标准偏差<15%。该方法具有预处理简便、试剂用量少、结果稳定、准确度高等优点。
京公网安备 11010802041926号
