动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 4: 2710 - 2720

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.233

研究论文

高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中乙氧基喹啉及其伴生物质

  • 李慧 , 1 ,
  • 索德成 1 ,
  • 张家庆 2, 3 ,
  • 王石 1 ,
  • 陈捷 2, 3 ,
  • 冯玉超 1 ,
  • 刘晓露 1 ,
  • 肖志明 1 ,
  • 樊霞 , 1, *
展开
  • 1 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京 100081
  • 2 江苏中丹化工技术有限公司,泰州 225453
  • 3 泰兴瑞泰化工有限公司,泰州 225453
*樊 霞,研究员,E-mail:

李 慧(1999—),女,河北定州人,硕士研究生,从事饲料质量安全监测技术研究。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2023-10-31

  网络出版日期: 2024-04-15

基金资助

国家“十三五”重点研发计划(2019YFE0103800)

收起

Simultaneous Determination of Ethoxyquin and Its Associated Substances in Feeds by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

  • LI Hui , 1 ,
  • SUO Decheng 1 ,
  • ZHANG Jiaqing 2, 3 ,
  • WANG Shi 1 ,
  • CHEN Jie 2, 3 ,
  • FENG Yuchao 1 ,
  • LIU Xiaolu 1 ,
  • XIAO Zhiming 1 ,
  • FAN Xia , 1
Expand
  • 1 Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
  • 2 Jiangsu Zhongdan Chemical Technology Co., Ltd., Taizhou 225453, China
  • 3 Taixing Ruitai Chemical Co., Ltd., Taizhou 225453, China
*professor, E-mail:

Received date: 2023-10-31

  Online published: 2024-04-15

Fold

摘要

本研究旨在建立一种应用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术同时测定饲料中乙氧基喹啉(EQ)、对氨基苯乙醚(PD)、非那西丁(PC)、乙氧基喹醌亚胺(EQI)和乙氧基喹啉二聚体(EQDM)含量的方法。饲料样品用乙腈提取,经BONDESIL-SI多重杂质吸附材料净化,采用HPLC-MS/MS测定,以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相,梯度洗脱,Waters BEH C18色谱柱分离。结果表明:通过饲料基质匹配绘制标准曲线,EQ、PD、PC、EQI和EQDM在5~500 μg/L范围内线性关系良好[决定系数(R2)>0.995 0]。方法中EQ、PD和PC的检出限和定量限分别为3.0和10.0 μg/kg,EQI和EQDM的检出限和定量限分别为1.5和5.0 μg/kg。EQ、PD、PC、EQI和EQDM在3个添加水平(20、50、100 μg/kg)的平均回收率为73.77%~98.77%,批内相对标准偏差(RSD,n=6)<10%,批间变异系数<12%。该方法前处理简单,操作方便,适用于饲料中EQ及其伴生物质的同步测定。

关键词： 高效液相色谱-串联质谱; 乙氧基喹啉; 对氨基苯乙醚; 非那西丁; 同步检测

本文引用格式

李慧 , 索德成 , 张家庆 , 王石 , 陈捷 , 冯玉超 , 刘晓露 , 肖志明 , 樊霞 . 高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中乙氧基喹啉及其伴生物质[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(4) : 2710 -2720 . DOI: 10.12418/CJAN2024.233

Abstract

The aim of this study was to establish a method for simultaneous determination of ethoxyquin (EQ), p-phenetidine (PD), phenacetin (PC), ethoxyquin quinone imine (EQI) and ethoxyquin dimer (EQDM) in feeds by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The feed samples were extracted with acetonitrile, purified by BONDESIL-SI multiple impurity adsorption material, determined by HPLC-MS/MS. The samples were separated with 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1% formic acid acetonitrile solution as mobile phase by gradient elution, and separated by Waters BEH C18 column. The results showed that the standard curves of EQ, PD, PC, EQI and EQDM were well linear in the range of 5 to 500 μg/L [coefficient of determination (R2)>0.995 0]. The limits of detection and quantification for EQ, PD and PC were 3.0 and 10.0 μg/kg, and those for EQI and EQDM were 1.5 and 5.0 μg/kg, respectively. The average recovery rates of EQ, PD, PC, EQI and EQDM at the three supplemental levels (20, 50 and 100 μg/kg) ranged from 73.77% to 98.77%, the relative standard deviation (RSD, n=6) within the lot was<10%, and the coefficient of variation between the batches was<12%. The method is simple and easy to operate, and is suitable for simultaneous determination of EQ and its associated biomass in feeds.

Key words： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; ethoxyquin; p-phenetidine; phenacetin; simultaneous detection

乙氧基喹啉(ethoxyquin,EQ),化学名为6-乙氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉,最初被用作橡胶添加剂以防止异戊二烯氧化破裂,后被用于保护香料(如辣椒和辣椒粉)中色素以及防止梨和苹果浅表烫伤(即形成褐斑)[1⇓⇓-4]。同时,EQ也可作为抗氧化剂应用于家禽和鱼类饲料,其能够有效地防止其中油脂、蛋白质、维生素和胡萝卜素等的变性或氧化变质[5]。因具有优越的抗氧化效果、安全低毒、使用方便和价格低廉等特点,EQ已成为目前应用最为广泛的饲料抗氧化剂。
工业上合成EQ是以对氨基苯乙醚(p-phenetidine,PD)和丙酮为原料,制得的EQ粗品经冷凝、蒸馏工艺进行精炼处理后仍会有少量原料PD残留;同时,在该反应体系下会伴生少量的副产物——非那西丁(phenacetin,PC)[6]。PD是一种公认的诱变剂,PC属于Ⅰ类致癌物。此外,EQ在使用过程中可被氧化进而生成氧化产物,主要包括乙氧基喹啉二聚体(ethoxyquin dimer,EQDM)和乙氧基喹醌亚胺(ethoxyquin quinone imine,EQI)[7-8]。EQDM被认为与EQ具有相似的抗氧化功效,但其在过量使用时会导致动物的肝脏、肾脏和肠道损伤以及肠道改变,且在鱼类组织中残留浓度要远高于其母体化合物,毒理学特征显著;而EQI因其具有醌亚胺的结构,被认为能够形成DNA加合物,可能具有致突变和致癌作用[9-10]。因此,EQ产品中除EQ本体外,通常还会含有PD、PC、EQI和EQDM等伴生物质,而这些伴生物质的存在增加了EQ在使用时的安全风险。
目前,饲料和食品中关于EQ的检测方法大都以EQ及其主要氧化产物EQI、EQDM为目标对象,检测手段主要有高效液相色谱法[6,11⇓⇓⇓-15]、气相色谱法[16-17]、液相色谱-串联质谱法[18⇓-20]以及气相色谱-串联质谱法[21⇓⇓-24]等。如He等[12]建立了一种鱼粉及鱼饲料中EQ、EQI和EQDM的高效液相色谱检测方法,该方法中3种物质的检出限分别为5、0.5和5 mg/kg。Zhang等[23]建立了一种能同时测定猪肉组织中EQ、EQI和EQDM的气相色谱-串联质谱方法,EQ、EQI和EQDM的定量限分别可达到0.5、5.0和5.0 μg/kg。EQ作为抗氧化剂在饲料中大量使用,其伴生物质PD、PC含量的高低显著影响着饲喂效果和动物健康,应引起重视并加以关注。但目前饲料中EQ及其伴生物质PD、PC、EQI和EQDM的同步检测方法鲜有报道,这在一定程度上制约了饲料企业对EQ的合理使用,也限制了政府部门对其进行有效的监管。
因此,本研究旨在基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术建立一种能够同时测定饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM的准确、快速、灵敏定量的分析方法,以实现EQ及其伴生物质的同步检测,为饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM的监测和安全性评估提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

AB SCIEX QTRAP 6500型HPLC-MS/MS仪(美国SCIEX公司):配备电喷雾电离(ESI)源;Waters BEH C18色谱柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm),Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。EQ、EQI、EQDM、PD和PC标准品(纯度>98%,德国Dr. Ehrenstorfer公司);甲酸(色谱纯,德国Sigma公司),乙腈(色谱纯,美国Fisher ChenAlert Guide公司);BONDESIL-SI、BONDESIL-FL、BONDESIL-SAX、Cleanert IC-H、Cleanert SLE、Cleanert S C18、强阳离子交换柱(SCX)、N-丙基乙二胺(PSA)、PestiCarb-CAT(天津博纳艾杰尔科技有限公司),Esela® MCX、Esela® HLB(大连沈源检验检测咨询有限公司),Z-Sep+(北京康林科技有限责任公司),Aluminum oxide(上海麦克林生化科技股份有限公司),多壁碳纳米管(长)(南京先丰纳米材料科技有限公司);其他试剂均为分析纯试剂,购自国药集团化学试剂有限公司。试验用水为经Milli-Q纯化后的一级水(电阻率>18 MΩ)。0.22 μm尼龙滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)。饲料样品(配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料等)由国家饲料质量检验检测中心(北京)提供,并全部按粉碎过0.425 mm孔径试验筛的要求制备,具有充分的代表性和均匀性。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1)混合标准储备液:称取EQ、PD、PC、EQI和EQDM标准品各50 mg(精确至0.01 mg),置于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,制备浓度为500 μg/mL的EQ、PD、PC、EQI和EQDM混合标准储备溶液。0~4 ℃暗处保存,有效期15 d。
2)混合标准中间液:准确移取1.0 mL混合标准储备溶液分别置于100 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容至刻度,制备浓度为5.0 μg/mL的EQ、PD、PC、EQI和EQDM的标准中间溶液。临用现配。
3)标准工作溶液:准确移取0.1、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 mL的混合标准中间液分别置于100 mL容量瓶中,用10%乙腈-0.1%甲酸水溶液定容至刻度,配制成浓度分别为5、20、50、100、200和500 ng/mL的EQ、PD、PC、EQI和EQDM标准工作溶液。临用现配。

1.2.2 样品前处理

样品提取:精确称取样品5.0 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管中,加入乙腈20 mL,涡旋振荡提取20 min,在4 ℃条件下以10 000 r/min离心5 min,取上清液备用。
净化:准确称取BONDESIL-SI吸附剂10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL离心管中,移取上清液1 mL,涡旋混合5 min,于4 ℃条件下以10 000 r/min离心5 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤,供HPLC-MS/MS测定。

1.3 色谱和质谱条件

色谱柱:Waters BEH C18柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm);柱温:40 ℃;进样量:5 μL;流动相流速为0.4 mL/min,流动相组成及洗脱梯度见表1。
表1 流动相组成及洗脱梯度

Table 1 Mobile phase composition and elution gradient%

时间
Time/min		 0.1%甲酸溶液
0.1% formic acid solution		 0.1%甲酸-乙腈溶液
0.1% formic acid-acetonitrile solution
0 100
0.5 90 10
1.5 80 20
3.0 5 95
5.0 5 95
5.1 95 5
6.0 95 5
质谱采用ESI源,正离子检测方式,多反应监测(MRM);喷雾电压为3.2 kV;离子源温度为300 ℃;气帘气为空气,碰撞气为氮气,使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求,分段采集,具体参数见表2。
表2 EQ及其伴生物质的质谱条件

Table 2 Mass spectrometry conditions of EQ and its associated substances

化合物名称
Compound names		 出峰时间
Peak time/min		 离子对
Ion pairs/(m/z)		 去簇电压
Declustering potential/V		 碰撞能
CE/eV
乙氧基喹啉 EQ 3.58 218.2>174.1*
218.2>163.3		 50 30
38
对氨基苯乙醚 PD 1.84 137.9>110.1*
137.9>93.3		 50 21
20
非那西丁 PC 2.94 180.3>137.8
180.3>109.9*		 80 20
40
乙氧基喹醌亚胺 EQI 3.46 188.3>137.3*
188.3>145.2		 50 24
26
乙氧基喹啉二聚体 EQDM 5.26 433.3>375.1
433.3>216.3*		 80 37
32

*为定量离子。

* were quantitative ions.

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

配制100 ng/mL的EQ、PD、PC、EQI和EQDM标准溶液,以微流量泵直接进质谱,进行质谱条件的优化。由于正离子比负离子响应强度高,所以采用ESI+模式测定。通过一级全扫描质谱得到EQ、PD、PC、EQI和EQDM的母离子[M+H]+为m/z 218.2、m/z 137.9、m/z 180.3、m/z 188.3和m/z 433.3;通过子离子扫描得到二级质谱,最终选择质荷比较大、强度较稳定的10个子离子;其中子离子218.2/174.1(EQ)、137.9/110.0(PD)、180.3/109.9(PC)、188.3/137.3(EQI)和433.3/216.3(EQDM)的响应强度较强且背景干扰小,故选择作为定量离子对。在MRM模式下,进一步优化了离子对的去簇电压和碰撞能,结果见表2。

2.2 色谱条件优化

本研究从出峰时间、分离效果、峰形和灵敏度等因素分别考察了Waters BEH C18[20]和Agilent Eclipse Plus C18这2种色谱柱对EQ及其伴生物质的分离效果。结果显示,在相同的流动相条件下,Waters BEH C18作为色谱柱时EQ及其伴生物质的分离效果最佳,峰形良好。在此基础上,比较了水(A)-乙腈(B)、0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)、0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈溶液(B)以及0.1%甲酸溶液(A)-0.01 mol/L乙酸铵-乙腈溶液(B)作为流动相时的梯度洗脱效果。结果显示,在相同的梯度洗脱条件下,0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈溶液(B)作为流动相时,洗脱效果更好,流动相采用0.4 mL/min的流速,具体流动相组成及洗脱梯度见表1。
在上述条件下,EQ、PD、PC、EQI和EQDM在该色谱柱上的保留时间分别为3.58、1.84、2.94、3.46和5.26 min,EQ、PD、PC、EQI和EQDM的MRM离子流图如图1所示。
图1 EQ及其伴生物质离子流色谱图

Fig.1 Ion flow chromatograms of EQ and its associated substances

2.3 提取试剂的选择

试验以空白配合饲料为试样,研究了乙腈、丙酮、甲醇、正己烷和乙腈/乙酸铵溶液(80/20,体积比)等5种提取溶剂对EQ、PD、PC、EQI和EQDM的提取效果。称取5份5.0 g上述饲料样品于50mL离心管中,加入200μL10μg/mLEQ及其伴生物质的混合标准溶液,涡旋2 min,避光静置30 min。再分别加入5种提取剂20 mL,按1.2.2的步骤进行样品前处理操作,其中正己烷取5 mL提取液氮吹至近干后用乙腈复溶后检测,HPLC-MS/MS的检测结果见图2。
图2 EQ及其伴生物质提取效果

误差线为3次测量结果的标准差。下图同。

Fig.2 Extraction effects of EQ and its associated substances

Error bars were standard deviation of results of 3 measures. The same as below.

从图2可以看出,选取乙腈作为提取溶剂对配合饲料中EQ及其伴生物质具有最佳的提取效果,EQ及其伴生物质的提取效率在54.9%~83.5%,基质校正后回收率均在73%以上,且重复性良好。正己烷对PD有着最佳的提取效果,但其余4种待测物质的提取效率均低于乙腈;正己烷、丙酮、乙腈/乙酸铵溶液对PC的提取效率较低,仅为标示量的30%~50%。

2.4 净化材料的优化

2.4.1 净化材料的选择

试验比较了14种多重杂质吸附材料(表3)对饲料中的EQ、PD、PC、EQI和EQDM的净化吸附效果。饲料样品的提取液经离心后,取上清液添加标准溶液,配制成含100 ng/mL的EQ及其伴生物质的溶液。随后,用50 mg多重杂质吸附材料对样品溶液进行净化,加入1 mL上述溶液涡旋5 min,于4 ℃条件下以10 000 r/min离心5 min,取离心后的上清液过0.22 μm滤膜,于HPLC-MS/MS仪测定,同时将1 mL不含吸附材料的溶液作为空白对照。通过将测量值与空白参考值进行比较来评估净化效果(图3)。由图可知,BONDESIL-SI能够起到较好的净化效果,净化后EQ、PD、PC、EQI和EQDM等5种物质的回收率均能达到75%以上。Cleanert IC-H、SCX几乎完全吸附被测物质,Esela® MCX也几乎完全吸附除EQDM外的其他目标物,而HLB、C18等其余几种材料,只对个别目标物有较好的净化效果。
表3 多重杂质吸附材料

Table 3 Multiple impurity adsorption materials

编号
Number		 名称
Names		 材料类型
Material types		 规格
Specification
1 BONDESIL-SI BONDESIL-SI 400 μm
2 Esela® MCX填料 MCX填料 40~60 μm
3 Cleanert IC-H Cleannert IC-H 40~60 μm
4 Esela® HLB填料 HLB填料 40~60 μm
5 Aluminum oxide 碱性氧化铝 100~200 μm
6 Cleanert S C18 硅胶上键合十八烷基袁键端处理过 50 μm
7 PSA 硅胶键合N-丙基乙二胺 40~60 μm
8 SCX 硅胶上键合磺酸钠盐 50 μm
9 BONDESIL-FL BONDESIL-FL 200 μm
10 BONDESIL-SAX BONDESIL-SAX 40 μm
11 Cleanert SLE Cleanert SLE 80~100目
12 PestiCarb CAT#.PC100 120~400目
13 多壁碳纳米管(长) Cleanert NANO <8 nm
14 Z-Sep+ 硅胶上键合C18和Z-SEP 100~200 μm
图3 不同多重杂质吸附材料对EQ及其伴生物质的净化效果

Fig.3 Purification effects of different multiple impurity adsorption materials on EQ and its associated substances

2.4.2 BONDESIL-SI添加量的优化

根据2.4.1结果选定BONDESIL-SI作为本方法的净化材料。然后对用量进行优化,比较了添加10、20、50和100 mg BONDESIL-SI时,EQ、PD、PC、EQI和EQDM的回收率变化,结果见图4。结果显示,随着BONDESIL-SI添加量的增加,EQ回收率逐渐降低,PD、PC、EQDM和EQI的回收率并无明显变化,因此将净化材料的添加量确定为10 mg。
图4 BONDESIL-SI不同添加量的净化效果

Fig.4 Purification effects of BONDESIL-SI with different addition amounts

2.5 基质效应、方法检出限和定量限

由于不同饲料样品的组成十分复杂,采用HPLC-MS/MS检测EQ、PD、PC、EQI和EQDM时,基质干扰非常明显,所以对基质效应的校正必不可少。取空白饲料样品按照1.2.2进行前处理,用基质提取液配制EQ、PD、PC、EQI和EQDM混合标准溶液,使其终浓度为0、10、20、50、100、200和500 μg/L,进HPLC-MS/MS测定。通过比较EQ及其伴生物质在HPLC-MS/MS仪上的相对响应值(基质添加标准溶液值/标准溶液值)可以看出,在配合饲料和添加剂预混合饲料中的各物质相对响应值为80%左右,在浓缩饲料中各物质相对响应值仅为70%左右,说明离子抑制现象的存在,因此本研究采用基质添加标准曲线来定量以弥补离子抑制造成的损失。经测得饲料样品的基质匹配标准曲线决定系数均大于0.995 0,表明该方法在0~500 μg/L内线性良好。
对方法的检测极限进行探讨,选取不同来源的饲料样品,按照上述提取、净化方法进行样品处理和测定。检出限(limits of detection,LOD)以空白样品中与标准品保留时间相同位置的极限噪声的3倍值为依据,定量限(limits of quantification,LOQ)以空白样品在标准品保留时间的基线噪声的10倍值为依据,测得空白基质中EQ、PD、PC的LOD和LOQ分别为3和10 μg/kg,EQI和EQDM的LOD和LOQ分别为1.5和5.0 μg/kg,能够满足饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM含量的分析需要。

2.6 回收率试验和精密度考察

在确定样品前处理方法后,试验选择未添加EQ的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料作为空白基质,进行加标回收试验,以考察方法的准确性和重现性。制备不同含量EQ、PD、PC、EQI和EQDM的试样,每批次内的同一含量做6个平行试验,共设置3个含量,分别为20、50和100 μg/kg添加水平连续重复3 d,结果见表5。
表4 饲料基质匹配标准曲线的线性方程和决定系数

Table 4 Linear equations and determination coefficients of feed matrix matching standard curve

项目
Items		 配合饲料 Compound feed 添加剂预混合饲料 Additive premix 浓缩饲料 Concentrated feed 检出限
LOD/
(μg/kg)		 定量限
LOQ/
(μg/kg)
线性方程
Linear equations		 决定系数
R2		 线性方程
Linear equations		 决定系数
R2		 线性方程
Linear equations		 决定系数
R2
乙氧基喹啉 EQ y=55 012x-252 427 0.999 2 y=54 036x-131 611 0.999 8 y=16 306x+28 282 0.997 7 3.0 10.0
对氨基苯乙醚 PD y=46 119x-68 637 0.999 7 y=40 480x-158 993 0.999 0 y=15 415x-231 772 0.995 9 3.0 10.0
非那西丁 PC y=69 654x+15 082 0.999 7 y=65 942x+86 177 0.999 6 y=33 507x-215 137 0.997 9 3.0 10.0
乙氧基喹醌亚胺 EQI y=178 522x+36 347 0.999 6 y=178 833x+451 530 0.999 8 y=45 627x+176 831 0.997 8 1.5 5.0
乙氧基喹啉二聚体 EQDM y=259 982x+327 281 0.999 7 y=313 839x+987 269 0.999 3 y=138 628x-469 055 0.998 3 1.5 5.0
表5 不同饲料中添加EQ及其伴生物质的回收率及精密度

Table 5 Recovery rate and precision of EQ and its associated substances added to different feeds (n=6)%

项目
Items		 加标量
Addition amounts/
(μg/kg)		 配合饲料 Compound feed 浓缩饲料 Concentrated feed 添加剂预混合饲料 Additive premix
批内回收率±
相对标准偏差
Intra recovery
rate±RSD		 批间变异系数
Inter coefficient of
variation		 批内回收率±
相对标准偏差
Intra recovery
rate±RSD		 批间变异系数
Inter coefficient of
variation		 批内回收率±
相对标准偏差
Intra recovery
rate±RSD		 批间变异系数
Inter coefficient of
variation
乙氧基喹啉 EQ 20 91.06±3.67 4.23 84.18±3.36 4.10 81.67±7.13 6.50
50 92.23±1.53 6.84 81.12±8.41 11.49 88.69±4.04 2.83
100 96.06±1.13 3.54 78.95±5.72 8.60 84.66±3.18 3.30
对氨基苯乙醚 PD 20 78.69±6.88 6.48 73.79±1.95 5.60 77.88±9.17 8.80
50 74.72±2.85 3.64 73.77±3.48 5.03 77.06±9.18 6.28
100 81.58±4.60 8.78 83.17±4.85 4.80 75.79±4.33 5.00
非那西丁 PC 20 89.62±3.06 4.79 87.32±3.29 3.30 85.29±2.92 2.20
50 96.48±5.30 4.70 89.08±1.90 6.15 92.07±2.28 7.25
100 92.44±3.36 3.84 86.10±2.23 7.40 90.59±5.63 8.20
乙氧基喹醌亚胺 EQI 20 91.06±1.95 4.98 91.24±3.75 4.20 92.07±0.94 7.00
50 95.33±2.11 3.27 84.10±6.84 5.16 98.77±3.27 2.82
100 93.82±1.42 3.95 89.76±6.53 5.40 95.37±3.43 5.50
乙氧基喹啉二聚体 EQDM 20 80.60±4.92 4.78 80.08±6.12 7.70 76.75±5.80 7.00
50 82.17±6.28 5.35 79.76±5.14 6.49 79.52±5.34 4.93
100 85.28±5.86 8.44 84.60±4.78 5.60 76.16±4.43 6.90
由表5可知,不同基质中EQ的回收率为78.95%~96.06%,PD的回收率为73.77%~83.17%,PC的回收率为85.29%~96.48%,EQI的回收率为84.10%~98.77%,EQDM的回收率为76.16%~85.28%,符合在一定含量上的回收率范围;批内相对标准偏差在0.94%~9.18%,批间变异系数在3.27%~11.49%。

2.7 实际样品测定

随机选取不同来源的50份饲料样品,按照上述方法进行样品分析。所有样品中EQ检出值为120.3~125 525.3 μg/kg,EQI检出值为6.0~2 219.2 μg/kg,EQDM检出值为8.4~24 071.7 μg/kg,PD检出值为10.4~189.5 μg/kg,PC检出值为14.8~47.1 μg/kg。各个样品中EQ、EQI、EQDM检出值总和符合《饲料添加剂安全使用规范》中EQ的最高限量,均低于150 mg/kg。

3 讨论

3.1 色谱条件

色谱柱的性能直接影响到物质的分离效果,因此选择合适的色谱柱可以提高分析的选择性、灵敏度和准确性。而C18反相色谱柱是一种常用的色谱柱类型,由于其固定相表面涂有十八烷基链,因此能与非极性或弱极性化合物发生静电吸附作用实现分离。本试验比较了Waters BEH C18色谱柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)和Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)对EQ、PD、PC、EQI和EQDM进行色谱分离。结果表明:在流动相相同的条件下,Waters BEH C18色谱柱对其分离的效果更好,峰形尖锐,各物质的灵敏度也更高。经分析,可能是因为Waters BEH C18色谱柱的亲水性氮化硅固定相表面经过特殊处理,同时小内径和短柱长减少峰的横向扩散,使相邻化合物之间的峰形更窄且尖锐,进而得到较好的分离效果和灵敏度[25]。
为了进一步提高EQ及其伴生物质的灵敏度,选用了乙腈、乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液[12]、乙腈-0.1%甲酸溶液[20]作为流动相,考察不同组成和比例流动相对质谱电离的影响。结果表明,流动相中添加甲酸和乙酸铵后,EQ、PD、PC、EQI和EQDM的信号强度都有明显提高,但乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液作为流动相时出峰时间晚且峰形拖尾较为严重,因此选择了乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。对不同水相(水、0.1%甲酸溶液)进行考察,最终确定本试验的水相为0.1%甲酸溶液。在此流动相条件下EQ、PD、PC、EQI和EQDM完全分离,且峰形良好。

3.2 提取

EQ及其氧化物EQI和EQDM化学结构式中含有喹啉环,其总体极性偏弱,属于弱极性化合物,而PD、PC与EQ极性略有差异,因此比较了乙腈、丙酮、甲醇、正己烷和乙腈/乙酸铵5种极性不同的有机溶剂对饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM的提取效果。各提取溶剂对PC的提取效率较低,除乙腈和丙酮外,回收率均低于50%,出现这种结果的原因可能是饲料基质复杂,在提取过程中将其他干扰物质也溶出,而PC本身易受其他物质干扰,导致响应信号强度降低,进而影响检测结果;而采用丙酮进行提取时,PD回收率处于较低水平,仅在50%左右,可能是由于丙酮对脂肪有很好的提取效果,而溶出的脂肪干扰了PD的检测。综合比较发现,乙腈对EQ、PD、PC、EQI和EQDM均表现出良好的提取效果,故最终选择乙腈作为提取溶剂。
前人研究表明,在样品制备过程中添加抗坏血酸和盐化剂可以提高EQ及其氧化物的回收率[14]。本研究分别加入不同量的抗坏血酸(0、25、50和100 mg/g)和不同类型盐化剂(硫酸钠、碳酸钠)与乙腈溶液共同提取EQ、PD、PC、EQI和EQDM,观察其对回收率的影响,结果发现:加入抗坏血酸后EQ的回收率略有提高,但PD的色谱峰出现展宽情况,且EQDM和EQI色谱峰发生少部分重合;加入碳酸钠和硫酸钠等盐化剂后,对于各物质的回收率影响并不明显。

3.3 净化

饲料样品成分复杂,基质效应会显著影响目标物质分析的准确性,因此提取液需进行净化。因此本试验选择了14种多重杂质吸附材料净化提取液。Cleanert IC-H、SCX和Esela® MCX吸附是基于离子交换和反相保留原理,在吸附提取液中杂质的同时,也吸附了EQ及其伴生物质,且难以将其洗脱。Cleanert S C18因烃基的存在,具有较强的疏水性,可以有效地去除提取液中脂类物质[26],进而使溶于脂肪中的EQI和EQDM等也被吸附。多壁碳纳米管能够通过π-π和疏水相互作用有效吸附色素,高表面积和多层中空结构可针对性的清除基质中的干扰成分[27],但饲料基质复杂,多壁碳纳米管也未能对EQ及其伴生物质起到较好的净化效果。而BONDESIL-SI对EQ及其伴生物质展现出良好的净化效果,由于BONDESIL-SI吸附剂是基于键合反相,以高纯不规则硅胶为基质,经端基封尾处理,可以去除样品中的脂质和碳水化合物[28],从而增强了EQ及其伴生物质的响应信号。因此,本试验选择了BONDESIL-SI为多重杂质吸附材料。
此外,试验比较了BONDESIL-SI添加量对饲料提取液中杂质净化效果影响。结果表明:当BONDESIL-SI添加10 mg时,EQ及其伴生物质能达到较高回收率,继续加大吸附剂的用量对样品杂质的净化效果和回收率无明显改善,反而导致EQ回收率降低。综上所述,将吸附材料的添加量设定为10 mg,加入BONDESIL-SI对提取液净化后,可以有效地去除基质中的干扰物对待测物色谱峰的影响,同时减少杂质对仪器和色谱柱的损害。

3.4 方法性能

目前关于饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM同步检测的研究尚未见报道,由于饲料基质复杂,因此,常规的提取净化方法会造成基质干扰;此外,在检测技术方面,HPLC-MS/MS特异性好、灵敏度高、检出限低、定性准确,可简化前处理过程,近年来广泛地应用于饲料中药物残留分析中,因此本试验采用HPLC-MS/MS进行检测,EQ、PD、PC的定量限为10.0 μg/kg,EQI、EQDM的定量限为5.0 μg/kg;EQ、PD、PC的检出限为 3.0 μg/kg,EQI、EQDM的检出限为1.5 μg/kg。
本试验通过对配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料进行加标回收试验,考察方法的准确度和精密度。在3个添加水平(20、50和100 μg/kg)的评价试验中,EQ的回收率为78.95%~96.06%,PD的回收率为73.77%~83.17%,PC的回收率为85.29%~96.48%,EQI的回收率为84.10%~98.77%,EQDM的回收率为76.16%~85.28%,符合在一定含量上的回收率范围;批内相对标准偏差在0.94%~9.18%(<10%),批间变异系数在3.27%~11.49%(<12%),在一定水平上满足饲料检测的回收率要求,表明本研究建立的方法具有较高的准确性和精密度。同时,对不同来源的50份饲料样品进行了测定,进一步验证了方法的适用性和可靠性。

4 结论

本研究建立了一种使用多重杂质吸附方法净化并结合HPLC-MS/MS技术,同时测定饲料中EQ、PD、PC、EQI和EQDM含量的方法。该方法可满足对饲料中EQ及其伴生物质同时测定的要求,前处理操作简单、快速,可用于相关样品的日常分析检测及监控。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
DE KONING A J. The antioxidant ethoxyquin and its analogues:a review[J]. International Journal of Food Properties, 2002, 5(2):451-461.

DOI

[2]
张剑伟, 张曦, 陶琳丽, 等. 橡胶籽油基础饲料添加乙氧基喹啉和番茄红素对虹鳟生长及抗氧化能力的影响[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2018, 33(6):1081-1088.

ZHANG J W, ZHANG X, TAO L L, et al. Effects of ethoxyquin and lycopene supplementation on the growth performance and antioxidant capacity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed rubber seed oil-based diet[J]. Journal of Yunnan Agricultural University(Natural Science), 2018, 33(6):1081-1088. (in Chinese)

[3]
TIAN J X, TAO Q Y, LI Y, et al. Ethoxyquin attenuate oxidant stress,inflammatory response and apoptosis in liver of Channa argus fed with high-fat dietary[J]. Aquaculture Reports, 2021, 21:100889.

DOI

[4]
MEREL S, REGUEIRO J, BERNTSSEN M H G, et al. Identification of ethoxyquin and its transformation products in salmon after controlled dietary exposure via fish feed[J]. Food Chemistry, 2019, 289:259-268.

DOI PMID

[5]
BŁASZCZYK A. AUGUSTYNIAK A, SKOLIMOWSKI J. Ethoxyquin:an antioxidant used in animal feed[J]. International Journal of Food Science, 2013, 2013:585931.

[6]
余晓琴, 李澍才, 唐昌云. 高效液相色谱-荧光检测法测定水果中乙氧基喹啉[J]. 分析测试学报, 2019, 38(10):1260-1264.

YU X Q, LI S C, TANG C Y. Determination of ethoxyquin in fruits by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2019, 38(10):1260-1264. (in Chinese)

[7]
CHEN P M, VARGA D M, MIELKE E A, et al. Control of superficial scald on ‘D'Anjou’ pears by ethoxyquin:oxidation of α-farnesene and its inhibition[J]. Journal of Food Science, 1990, 55(1):171-175.

DOI

[8]
BOHNE V J B, LUNDEBYE A K, HAMRE K. Accumulation and depuration of the synthetic antioxidant ethoxyquin in the muscle of Atlantic salmon (Salmo salar L.)[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(5):1834-1843.

DOI

[9]
BERNTSSEN M H G, HOOGENVEEN R, BERNHARD A. Modelling of the feed-to-fillet transfer of ethoxyquin and one of its main metabolites,ethoxyquin dimer,to the fillet of farmed Atlantic salmon (Salmon salar L.)[J]. Food Additives & Contaminants:Part A, 2019, 36(7):1042-1054.

[10]
KRANAWETVOGL A, ELSINGHORST P W. Determination of the synthetic antioxidant ethoxyquin and its metabolites in fish and fishery products using liquid chromatography-fluorescence detection and stable-isotope dilution analysis-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(23):6650-6657.

DOI PMID

[11]
舒晓梦, 赵素娟, 王羚佳, 等. 高效液相荧光法测定猪肉中抗氧化剂乙氧基喹啉以及代谢产物二聚乙氧基喹啉[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(5):244-248.

SHU X M, ZHAO S J, WANG L J, et al. Determination of EQ and EQDM in pork by HPLC with fluorescence detector[J]. Food and Fermentation Industries, 2018, 44(5):244-248. (in Chinese)

DOI

[12]
HE P, ACKMAN R G. HPLC determination of ethoxyquin and its major oxidation products in fresh and stored fish meals and fish feeds[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(1):10-16.

DOI

[13]
BOHNE V J B, HOVE H, HAMRE K. Simultaneous quantitative determination of the synthetic antioxidant ethoxyquin and its major metabolite in Atlantic salmon (Salmo salar,L),ethoxyquin dimer,by reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of AOAC International, 2007, 90(2):587-597.

DOI

[14]
AOKI Y, KOTANI A, MIYAZAWA N, et al. Determination of ethoxyquin by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection and its application to the survey of residues in food products of animal origin[J]. Journal of AOAC International, 2010, 93(1):277-283.

PMID

[15]
RODRÍGUEZ-GÓMEZ R, VANDEPUT M, ZAFRA-GÓMEZ A, et al. Liquid chromatography-electrochemical detection for the determination of ethoxyquin and its dimer in pear skin and salmon samples[J]. Talanta, 2018, 177:157-162.

DOI

[16]
陈集元. 气相色谱法检测水产配合饲料中的合成抗氧化剂[J]. 福建分析测试, 2018, 27(5):47-53.

CHEN J Y. Determination of synthetic antioxidant in aquatie formula feed by gas chromatography[J]. Fujian Analysis & Testing, 2018, 27(5):47-53. (in Chinese)

[17]
孟庆文, 刘再胜, 谢宁. 气相色谱法测定抗氧化剂中乙氧基喹啉及BHT的含量[J]. 饲料工业, 2001, 22(3):26.

MENG Q W, LIU Z S, XIE N. Determination of ethoxyquinoline and BHT in antioxidants by gas chromatography[J]. Feed Industry, 2001, 22(3):26. (in Chinese)

[18]
HUANG Z Q, ZHANG Y, WANG L B, et al. Simultaneous determination of 103 pesticide residues in tea samples by LC-MS/MS[J]. Journal of Separation Science, 2009, 32(9):1294-1301.

DOI PMID

[19]
丁涛, 沈崇钰, 蒋原, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定水果中乙氧基喹啉残留[J]. 质谱学报, 2009, 30(5):307-310.

DING T, SHEN C Y, JIANG Y, et al. Determination of ethoxyquin residues in fruits by HPLC-MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2009, 30(5):307-310. (in Chinese)

[20]
STOECKELHUBER M, SCHERER M, BRACHER F, et al. Development of a human biomonitoring method for assessing the exposure to ethoxyquin in the general population[J]. Archives of Toxicology, 2020, 94(12):4209-4217.

DOI

[21]
高冰心. 气相色谱-质谱法测定饲料添加剂中乙氧基喹啉的残留量[J]. 广州化工, 2022, 50(11):85-87.

GAO B X. GC-MS determination of ethoxyquin residues in feed additives[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2022, 50(11):85-87. (in Chinese)

[22]
梁宇, 沈应涛, 梁颖彤, 等. 气相色谱-质谱法同时测定水果中联苯醚、肉桂醛和乙氧基喹残留量[J]. 现代食品, 2022, 28(12):203-206,210.

LIANG Y, SHEN Y T, LIANG Y T, et al. Determination of diphenyl ether,cinnamaldehyde,and ethoxy sinensis residues in fruits by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Modern Food, 2022, 28(12):203-206,210. (in Chinese)

[23]
ZHANG C, GAI X R, TIAN Y, et al. Analysis of ethoxyquin and its oxidation products in swine tissues by gas chromatography-tandem mass spectrometry for evaluating the feed-to-animal tissue transfer of ethoxyquin and its metabolites[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2021, 12(1):8.

DOI PMID

[24]
SANCHEZ COSTA L, PUJOL BOIRA J, ARAGÓ IGLESIAS M, et al. Analysis of ethoxyquin residues in animal feed using QuEChERS and gas chromatography tandem mass spectrometry and its results from Catalonian production 2018-2019[J]. Analytical Methods:Advancing Methods and Applications, 2020, 12(32):4080-4088.

[25]
WERRES T, SCHMIDT T C, TEUTENBERG T. Influence of the column inner diameter on chromatographic efficiency in miniaturized and conventional ultra-high-performance liquid chromatography[J]. Chromatographia, 2023, 86(2):143-151.

DOI

[26]
张金环, 程艳宇, 李桂红, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定生姜中多种农药及代谢物残留[J]. 世界农药, 2023, 45(5):31-37.

ZHANG J H, CHENG Y Y, LI G H, et al. Determination of multiple pesticide and metabolite residues in ginger by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. World Pesticides, 2023, 45(5):31-37. (in Chinese)

[27]
ABDULLAH N, TAJUDDIN M H, YUSOF N. 13-carbon-based polymer nanocomposites for dye and pigment removal[M]// ISMAILA F, GOHP S. Carbon-based polymer nanocomposites for environmental and energy applications. Amsterdam: Elsevier Inc.,2018:305-329.

[28]
GUAN X, FENG Y C, SUO D C, et al. Simultaneous determination of 11 mycotoxins in maize via multiple-impurity adsorption combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Foods, 2022, 11(22):3624.

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