动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 6: 3739 - 3755

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.321

研究论文

沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率及微生物区系的影响

  • 姚海博 , 1 ,
  • 胡晋升 2 ,
  • 孙晨旭 1 ,
  • 高会霞 1 ,
  • 何瑊瑊 1 ,
  • 于爱缓 1 ,
  • 谢耀弟 1 ,
  • 柳振 1 ,
  • 王贺 2 ,
  • 段月岩 2 ,
  • 唐德富 1 ,
  • 年芳 3 ,
  • 刘旺景 , 1, *
展开
  • 1 甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州 730070
  • 2 澳新牧业(天津)有限公司,天津 300384
  • 3 甘肃农业大学理学院,兰州 730070
*刘旺景,副教授,硕士生导师,E-mail:

姚海博(1998—),男,甘肃正宁人,硕士研究生,研究方向为反刍动物营养调控。E-mail:

Copy editor: 陈鑫

收稿日期: 2023-12-28

  网络出版日期: 2024-06-07

基金资助

甘肃农业大学科技创新基金-盛彤笙创新基金资助(GSAU-STS-2021-20)

甘肃农业大学科研创新基金-公招博士科研启动基金(GAU-KYQD-2020-24)

国家自然基金地区科学基金项目(32260846)

甘肃农业大学学科团队项目(GAU-XKTD-2022-24)

澳新牧业(天津)有限公司研发专项(GSAU-JSYF-2021-025)

收起

Effects of Allium mongolicum Regel Powder on Rumen in Vitro Fermentation Parameters, Nutrient Degradation Rate and Microflora of Yaks

  • YAO Haibo , 1 ,
  • HU Jinsheng 2 ,
  • SUN Chenxu 1 ,
  • GAO Huixia 1 ,
  • HE Jianjian 1 ,
  • YU Aihuan 1 ,
  • XIE Yaodi 1 ,
  • LIU Zhen 1 ,
  • WANG He 2 ,
  • DUAN Yueyan 2 ,
  • TANG Defu 1 ,
  • NIAN Fang 3 ,
  • LIU Wangjing , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
  • 2 Aoxin Animal Husbandry (Tianjin) Co., Ltd., Tianjin 300384, China
  • 3 College of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2023-12-28

  Online published: 2024-06-07

Fold

摘要

本试验旨在通过体外发酵法研究不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率和微生物区系的影响。采用体外发酵法,在发酵罐中分别加入1 g全混合日粮(TMR,发酵底物)(YZA组)、1 g TMR+1.2%沙葱粉(YLA组)、1 g TMR+2.4%沙葱粉(YMA组)、1 g TMR+3.6%沙葱粉(YHA组),在发酵时间分别到达4、8、16、24、48和72 h时采集发酵液及底物残渣,测定发酵参数、营养物质降解率及微生物区系。结果表明: 1)与YZA组相比,发酵从16 h开始,YMA组和YHA组氨态氮(NH3-N)含量均极显著降低(P<0.01),发酵16和72 h时,YMA组和YHA组菌体蛋白(MCP)含量极显著升高(P<0.01);发酵4和16 h时,YLA组和YMA组pH均显著降低(P<0.05),48 h时YMA组pH显著降低(P<0.05),72 h时YMA组pH极显著降低(P<0.01);除72 h外,其余各时间点YLA组和YMA组总挥发性脂肪酸(TVFA)和乙酸含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高;各发酵时间点YLA组和YMA组丙酸含量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。2) 与YZA组相比,发酵时间4、24、72 h时,YMA组干物质降解率(DMD)显著升高(P<0.05);发酵4、24、48和72 h时,YMA组和YHA组中性洗涤纤维降解率(NDFD)显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高;各发酵时间点,YLA组和YMA组酸性洗涤纤维降解率(ADFD)显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。3) 不同添加水平沙葱粉并未改变瘤胃主要微生物类群的占比,但可增加属水平普雷沃氏菌科UCG-001(YMA组)和F082(YMA组和YHA组)等有益微生物的相对丰度,提高底物营养物质降解率。4)毛螺菌科UCG-009相对丰度与丙酸含量呈极显著正相关(r=0.982;P<0.01),与DMD呈极显著负相关(r=-0.990;P<0.01),土圈菌DEV114相对丰度与异戊酸含量呈极显著正相关(r=0.998;P<0.01),不动杆菌属相对丰度与丙酸含量呈极显著负相关(r=-0.994;P<0.01),与DMD呈极显著正相关(r=0.984;P<0.01)。综上所述,在本试验条件下,饲粮中添加2.4%沙葱粉能改善牦牛瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率,促进有益菌的增殖,且部分参数变化呈现剂量依赖效应。

关键词： 沙葱粉; 牦牛; 营养物质降解率; 发酵参数; 微生物区系

本文引用格式

姚海博 , 胡晋升 , 孙晨旭 , 高会霞 , 何瑊瑊 , 于爱缓 , 谢耀弟 , 柳振 , 王贺 , 段月岩 , 唐德富 , 年芳 , 刘旺景 . 沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率及微生物区系的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(6) : 3739 -3755 . DOI: 10.12418/CJAN2024.321

Abstract

The purpose of this experiment was to study the effects of different levels of Allium mongolicum Regel powder on rumen in vitro fermentation parameters, nutrient degradation rate and microflora of yak by in vitro fermentation. In vitro fermentation method was used to add 1 g total mixed ration (TMR, fermentation substrate)(YZA group), 1 g TMR+1.2% Allium mongolicum Regel powder (YLA group), 1 g TMR+2.4% Allium mongolicum Regel powder (YMA group), 1 g TMR+3.6% Allium mongolicum Regel powder (YHA group) to the fermentation tank. When the fermentation time reached 4, 8, 16, 24, 48 and 72 h, the fermentation broth and substrate residue were collected, and the fermentation parameters, nutrient degradation rate and microflora were determined. The results showed as follows: 1) compared with the YZA group, the content of ammonia nitrogen (NH3-N) in the YMA group and the YHA group decreased significantly (P<0.01) from 16 h of fermentation, and the content of mycoprotein (MCP) increased significantly (P<0.01) at 16 and 72 h of fermentation. The pH in YLA group and YMA group decreased significantly at 4 and 16 h (P<0.05), the pH in YMA group decreased significantly at 48 h (P<0.05), and the pH in YMA group decreased significantly at 72 h (P<0.01). Except for 72 h, the contents of total volatile fatty acids (TVFA) and acetic acid in YLA group and YMA group were significantly (P<0.05) or extremely significantly (P<0.01) increased at other time points. The propionic acid content in YLA group and YMA group increased significantly (P<0.05) or extremely significantly (P<0.01) at each fermentation time point. 2) Compared with YZA group, the dry matter degradation rate (DMD) in YMA group significantly increased at 4, 24 and 72 h of fermentation time (P<0.05). The neutral detergent fiber degradation rate (NDFD) in YMA group and YHA group increased significantly (P<0.05) or extremely significantly (P<0.01) at 4,24,48 and 72 h of fermentation. At each fermentation time point, the acid detergent fiber degradation rate (ADFD) in YLA group and YMA group increased significantly (P<0.05) or extremely significantly (P<0.01). 3) Different addition levels of Allium mongolicum Regel powder did not change the proportion of main microbial groups in rumen fluid, but increased the relative abundance of beneficial microorganisms such as Prevotellaceae_UCG-001 (YMA group) and F082 (YMA group and YHA group) at the genus level, and increased the degradation rate of substrate nutrients. 4) The relative abundance of Lachnospiraceae_UCG-009 was significantly positively correlated with propionic acid content (r=0.982; P<0.01), and there was a significant negative correlation with DMD (r=-0.990; P<0.01). The relative abundance of DEV114 was significantly positively correlated with isovaleric acid content (r=0.998; P<0.01). The relative abundance of Agathobacter was significantly negatively correlated with propionic acid content (r=-0.994; P<0.01), which was positively correlated with DMD (r=0.984; P<0.01). In summary, within the scope of this experiment, the addition of 2.4% Allium mongolicum Regel powder to the diet of yak can improve the in vitro fermentation parameters and nutrient degradation rate of rumen fluid of yak, promote the value-added of beneficial bacteria, and some parameter changes show a dose-dependent effect.

Key words： Allium mongolicum Regel powder; yak; nutrient degradation rate; fermentation parameters; microflora

随着2020年全面禁抗时代的开启,寻找天然的替代品迫在眉睫。天然植物提取物含有丰富的黄酮类、精油类、生物碱、多酚、多糖、皂苷类等活性成分,具有不易产生耐药性、毒副作用小、残留低和抗氧化等特点,因此,作为一类“安全、高效、稳定”的饲料添加剂逐渐成为养殖行业替抗产品的首选[1-2]。据研究报道,天然植物源饲料添加剂对畜禽具有促进生长、提高动物生产性能、增强机体免疫力、增强抗应激功能、改善肠道健康及改善动物产品品质等作用[3]。我国的植物资源非常丰富,尤其是一些植物已被证明具有良好的药用价值,所以,寻找植物源饲料添加剂对我国畜牧业的健康发展和畜产品品质的改善和提高具有重要的意义。
沙葱(Allium mongolicum Regel)又叫蒙古韭,主要分布在新疆东北部、甘肃河西走廊北部、内蒙古阿拉善等地[4],因具有较高的食用价值和药用价值被称作“山野菜中的灵芝”[5]。研究发现,沙葱中含有丰富的蛋白质等常规营养成分以及黄酮、多糖等生物学活性成分[6],具有抗氧化、抗炎以及免疫调节等生物学功能[7]。有报道称,在精补料中添加沙葱粉可以适当改善高海拔地区放牧藏羊肉色,且对其生长性能和屠宰性能的提升有积极作用[8]。Zhao等[9]研究发现,沙葱精油作为饲料添加剂可以改善绵羊生长性能,提高其瘤胃发酵效率,使瘤胃细菌群落组成多样化,提高干物质(DM)和粗蛋白质(CP)的表观消化率。Xie等[10]在西门塔尔犊牛补饲试验中发现,饲粮中添加沙葱可以提高西门塔尔犊牛的DM消化率和酸性洗涤纤维(ADF)消化率。Du等[11]研究发现,沙葱粉能够通过影响绵羊瘤胃微生物区系,提高柔壁菌门(Tenericutes)和柔膜菌门(Mollicutes)的丰度(其与平均日增重呈显著正相关),进而改善绵羊的生长性能。综上所述,我们推测饲粮中添加沙葱粉可能会通过影响牦牛瘤胃微生物区系,进而影响其瘤胃发酵及营养物质消化,但其在牦牛饲粮中的适宜添加水平鲜见报道。郭旭东等[12]认为,适当添加水平的天然植物源饲料添加剂会对动物生长产生有益作用,如果大剂量使用则可能产生副作用,可见筛选最佳添加剂量对沙葱在牦牛生产中的应用具有重要意义。因此,本试验旨在采用体外发酵法,研究添加不同水平沙葱粉对牦牛营养物质降解率、瘤胃发酵参数和微生物区系的影响,为沙葱粉作为饲料添加剂应用于牦牛的饲养中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵底物为育肥牛全混合日粮(TMR),TMR参照《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[13]进行配制,经65 ℃干燥24 h制成风干样,粉碎后过80目筛密封备用,其组成及营养水平见表1。
表1 全混合日粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR (air-dry basis)%

项目 Items 含量Content
原料 Ingredients
玉米青贮 Corn silage 16.66
豆粕 Soybean meal 6.63
羊草 Guinea grass 19.54
稻草 Rice straw 38.31
玉米 Corn 6.29
小麦麸 Wheat bran 5.51
玉米胚芽粕 Corn germ meal 6.06
预混料 Premix1) 1.00
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
维持净能 NEm/(MJ/kg) 5.63
增重净能 NEg/(MJ/kg) 2.63
粗灰分 Ash 12.60
粗蛋白质 CP 11.04
粗脂肪 EE 2.20
中性洗涤纤维 NDF 48.60
酸性洗涤纤维 ADF 29.60
钙 Ca 0.81
磷 P 0.21

1)预混料为每千克全混合日粮提供The premix provided the following per kg of the TMR:VA 950 IU,VD 180 IU,VE 25 IU,Cu 10 mg,Fe 80 mg,Mn 20 mg,Zn 75 mg,I 1.0 mg,Se 0.6 mg。

2)维持净能、增重净能为根据NASEM(2016)[15]计算得出的数值,Ash、CP、 EE 、NDF、 ADF、 Ca、P为分别根据国标GB/T 6438—2007、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2022、GB/T 6434—2022、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018测定得出的数值。The NEm and NEg were values calculated according to NASEM (2016)[15], while Ash, CP, EE, NDF, ADF, Ca and P were values determined according to standards GB/T 6438—2007, GB/T 6432—2018, GB/T 6433—2006, GB/T 6434—2022, GB/T 6434—2022,GB/T 6436—2018, GB/T 6437—2018, respectively.

沙葱于2023年2月10日购自甘肃省武威市民勤县,经65 ℃干燥24 h制成风干样,粉碎后过80目筛,密封保存备用。
缓冲液参考Menke等[14]的方法进行配制,持续通入饱和二氧化碳(CO2)使颜色变成无色透明,置于39 ℃水浴中预热备用。瘤胃液供体选取3头年龄为2岁、体重和体况相似且装有瘤胃瘘管的健康牦牛。瘤胃液于晨饲前采集,经4层纱布过滤后装入39 ℃预热的保温瓶中,迅速带回实验室。按照1∶2的比例将瘤胃液与缓冲液混合配制发酵液。

1.2 试验设计

采用单因素试验设计,准确称取1 g发酵底物装入400目自制尼龙袋中,放入预热培养瓶中,各组底物中分别添加0(YZA组)、1.2%(YLA组)、2.4%(YMA组)、3.6%(YHA组)的沙葱粉,迅速加入30 mL发酵液后通入CO2密封培养发酵。当发酵时间分别到达4、8、16、24、48和72 h时采集样品,每个时间点3个重复。

1.3 样品采集

在到达各发酵时间时,取出发酵管置于冰水中停止发酵,立即测定其pH后采集5 mL发酵液于10 mL离心管中,于-20 ℃冰箱保存,用于氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)和菌体蛋白(MCP)含量测定。采集10 mL发酵液于15 mL离心管中,于-80 ℃冰箱保存,用于测定微生物区系。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 体外降解率的测定

参考标准GB/T 6435-2014、NY/T 1459-2022、GB/T 20806-2022分别测定DM、ADF、NDF含量,计算干物质降解率(DMD)、酸性洗涤纤维降解率(ADFD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD),计算公式如下:

营养物质降解率(%)=100×[1-(m/M)]。

式中:m为发酵后底物DM或中性洗涤纤维(NDF)或ADF含量(g);M为发酵前底物DM或NDF或ADF含量(g)。

1.4.2 体外瘤胃发酵参数

使用PHS-10便携式酸度计测定发酵液pH;采用冯宗慈等[16]比色法,用L3型可见分光光度计测定发酵液NH3-N含量;参考Makkar等[17]报道的考马斯亮蓝法测定MCP含量;参照王文基[18]的方法,对离心管中发酵液进行预处理,用磐诺GC-1949型气相色谱仪测定瘤胃液中VFA含量。

1.4.3 微生物总DNA提取、扩增和测序

采用磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(TianGen)抽提发酵液总DNA,提取完成后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度,取适量检测合格的DNA样品于离心管中稀释至1 ng/μL,将稀释后的基因组DNA作为模板,瘤胃细菌DNA扩增目的片段为16SV4区(测序引物为515F和806R,引物序列分别为5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'和5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'),PCR扩增产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,对检测合格的产物进行磁珠纯化,采用酶标定量,根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,对目的条带使用通用型DNA纯化回收试剂盒(TianGen)回收产物,使用NovaSeq 6000进行PE 250上机测序。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way AVOVA)及线性、二次效应分析,采用最小显著性差异(LSD)法比较组间差异显著性,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。试验结果以平均值和均值标准误表示。应用Graphpad Pism9.5和Origin 2021软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数的影响

由表2可知,与YZA组相比,发酵4 h时,YMA组发酵液中NH3-N含量极显著降低(P<0.01),发酵8 h时,YLA组和YMA组NH3-N含量极显著降低(P<0.01),发酵16和72 h时,YLA组、YMA组和YHA组NH3-N含量均极显著降低(P<0.01),发酵24和48 h时,YMA组和YHA组NH3-N含量极显著降低(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,4和8 h发酵液中NH3-N含量呈现二次效应(P<0.05),24和48 h发酵液中NH3-N含量呈现线性下降(P<0.01),16和72 h发酵液中NH3-N含量呈现线性或二次效应(P<0.01)。
表2 不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵液NH3-N和MCP含量的影响

Table 2 Effects of different levels of Allium mongolicum Regel powder on NH3-N and MCP contents in rumen in vitro fermentation broth of yaksmg/dL

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
YZA YLA YMA YHA 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
氨态氮 NH3-N
4 h 14.76Aa 13.88Aa 11.45Bb 14.96Aa 0.465 0.003 0.407 0.002
8 h 15.13Aa 12.56Bb 12.78Bb 17.01Aa 0.607 0.002 0.059 <0.010
16 h 16.73Aa 11.25BCbc 9.39Cc 12.32Bb 0.852 <0.010 <0.010 <0.010
24 h 20.79Aa 20.11Aa 10.79Bb 12.91Bb 1.359 <0.001 <0.001 0.109
48 h 26.07Aa 24.34Aa 15.64Bb 16.35Bb 1.622 0.009 0.002 0.541
72 h 28.54Aa 21.34Bb 18.54Bb 21.66Bb 1.456 0.002 0.003 0.003
菌体蛋白 MCP
4 h 11.36 12.52 13.37 12.54 0.208 0.120 0.060 0.187
8 h 10.79b 11.25b 13.15a 11.58b 0.314 0.013 0.041 0.032
16 h 9.98Bb 10.73Bb 12.36Aa 12.02Aa 0.318 0.002 <0.010 0.114
24 h 11.86 12.06 13.02 11.92 0.284 0.486 0.667 0.291
48 h 10.29b 10.63b 11.56a 10.60b 0.168 0.013 0.083 0.015
72 h 10.46Bb 10.69Bb 12.03Aa 11.69Aa 0.215 0.001 <0.001 0.188

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

与YZA组相比,在发酵8和48 h时,YMA组发酵液中MCP含量显著升高(P<0.05);在发酵16和72 h时,YMA组和YHA组MCP含量极显著升高(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,16和72 h发酵液中MCP含量呈现线性升高(P<0.01),48 h发酵液中MCP含量呈现二次效应(P<0.05),8 h发酵液中MCP含量呈现线性(P<0.05)或者二次效应(P<0.05)。
由表3可知,与YZA组相比,在发酵4和16 h时,YLA组和YMA组发酵液pH显著降低(P<0.05);发酵48 h时,YMA组pH显著降低(P<0.05);发酵时间到达72 h时,YMA组pH极显著降低(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,除8 h外,其余各时间点发酵液pH均呈现线性效应(P<0.05或P<0.01)。
表3 不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵液pH和VFA含量的影响

Table 3 Effects of different levels of Allium mongolicum Regel powder on pH and VFA content in rumen in vitro fermentation broth of yaks

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
YZA YLA YMA YHA 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
pH
4 h 6.76a 6.66b 6.64b 6.69ab 0.016 0.029 0.011 0.065
8 h 6.60 6.53 6.51 6.57 0.017 0.221 0.059 0.454
16 h 6.58a 6.44b 6.42b 6.54a 0.023 0.015 0.003 0.320
24 h 6.51 6.36 6.36 6.50 0.029 0.060 0.010 0.881
48 h 6.45ab 6.34bc 6.30c 6.47a 0.027 0.032 0.006 0.850
72 h 6.42Aa 6.30Aa 6.18Bb 6.41Aa 0.034 0.005 0.001 0.409
总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L)
4 h 9.66Bb 15.53Aa 16.00Aa 10.04Bb 0.985 0.002 0.723 <0.001
8 h 28.91b 35.62a 36.58a 26.86b 1.497 0.015 0.558 0.002
16 h 51.06b 57.51a 58.01a 49.59b 1.399 0.030 0.661 0.005
24 h 54.89Bb 61.13Aa 60.84Aa 53.85Bb 1.048 <0.001 0.317 <0.001
48 h 72.61Cc 87.92Aa 85.49Aa 77.57Bb 1.917 <0.001 0.049 <0.001
72 h 90.77 97.32 98.43 98.83 1.544 0.222 0.077 0.303
乙酸 Acetic acid/(mmol/L)
4 h 6.01b 10.25a 10.34a 7.00b 0.706 0.023 0.492 0.004
8 h 16.05b 19.27a 19.42a 15.03b 0.713 0.025 0.515 0.004
16 h 25.10b 28.33a 28.38a 24.02b 0.705 0.021 0.466 0.004
24 h 24.33Dd 27.36Bb 29.05Aa 25.80Cc 0.559 <0.001 0.010 <0.001
48 h 39.61Bb 47.27Aa 49.86Aa 40.86Bb 1.341 <0.001 0.128 <0.001
72 h 45.59Bb 44.94Bb 56.47Aa 52.25Aa 1.563 0.001 0.001 0.240
丙酸 Propionic acid/(mmol/L)
4 h 1.22Cc 2.39Aa 2.71Aa 1.79Bb 0.187 0.001 0.029 <0.001
8 h 8.06b 11.27a 11.38a 7.03b 0.710 0.025 0.507 0.004
16 h 18.11b 21.27a 21.38a 17.03b 0.708 0.026 0.486 0.004
24 h 18.24Bb 22.84Aa 22.83Aa 23.22Aa 0.689 0.003 0.002 0.018
48 h 18.95Bb 24.69Aa 23.75Aa 22.81Aa 0.747 0.006 0.021 0.116
72 h 25.51Cc 32.83ABab 36.54Aa 28.72BCbc 1.418 0.005 0.001 0.056
丁酸 Butyric acid/(mmol/L)
4 h 1.57b 1.83a 1.90a 1.49b 0.060 0.011 0.606 0.002
8 h 3.42b 3.69b 5.04a 4.31ab 0.227 0.021 0.017 0.129
16 h 6.04bc 5.99c 6.40a 6.33ab 0.066 0.032 0.016 0.888
24 h 8.67Bb 7.22Cc 10.30Aa 6.96Cc 0.418 <0.001 0.130 0.008
48 h 8.64b 9.78ab 11.28a 9.24ab 0.424 0.031 0.333 0.057
72 h 10.66b 12.25ab 15.05a 12.44ab 0.642 0.015 0.110 0.072
戊酸 Valeric acid/(mmol/L)
4 h 0.17Bb 0.27Aa 0.25Aa 0.14Bb 0.017 <0.001 0.137 <0.001
8 h 0.38a 0.32b 0.37a 0.36ab 0.009 0.045 0.957 0.143
16 h 0.55bc 0.59ab 0.51c 0.62a 0.014 0.012 0.119 0.117
24 h 1.26ABab 1.61Aa 0.88Bb 1.02Bb 0.095 0.008 0.021 0.364
48 h 2.31b 3.54a 2.41b 2.46b 0.182 0.021 0.547 0.039
72 h 4.81Aa 4.04Aa 2.94Bb 2.32Bb 0.307 <0.001 <0.001 0.750
异丁酸 Isobutyric acid/(mmol/L)
4 h 0.26b 0.26b 0.27b 0.29a 0.004 0.017 0.003 0.195
8 h 0.44b 0.48ab 0.49a 0.50a 0.009 0.024 0.019 0.228
16 h 0.59c 0.60bc 0.62ab 0.63a 0.005 0.013 0.002 0.645
24 h 1.13Aa 0.94Cc 1.07Bb 0.88Dd 0.031 <0.001 <0.001 1.000
48 h 1.25Aa 1.17Aa 1.29Aa 0.89Bb 0.053 0.004 0.005 0.022
72 h 1.61 1.33 1.35 1.37 0.064 0.423 0.251 0.278
异戊酸 Isovaleric acid/(mmol/L)
4 h 0.42ab 0.53a 0.54a 0.30b 0.034 0.013 0.109 0.003
8 h 0.56bc 0.58ab 0.61a 0.53c 0.010 0.011 0.268 0.004
16 h 0.68b 0.73b 0.71b 0.97a 0.041 0.014 0.006 0.076
24 h 1.26Bb 1.16Cc 1.42Aa 0.94Dd 0.053 <0.001 <0.001 <0.001
48 h 1.85Aa 1.48Bb 1.71Aa 1.32Cc 0.065 <0.001 <0.001 0.829
72 h 2.59Aa 1.93Bb 1.51Cc 1.73BCbc 0.131 <0.001 <0.001 0.005
乙酸/丙酸 A/P
4 h 5.74a 4.39ab 3.81b 3.50b 0.349 0.029 0.018 0.375
8 h 2.00Aa 1.73Bb 1.72Bb 2.14Aa 0.062 0.008 0.226 0.001
16 h 1.39ab 1.33b 1.33b 1.41a 0.013 0.025 0.358 0.005
24 h 1.26b 1.20b 1.07b 1.42a 0.046 0.019 0.214 0.009
48 h 1.67Bb 1.92Bb 2.64Aa 1.80Bb 0.121 <0.001 0.033 <0.001
72 h 1.25Cc 1.37Cc 2.22Aa 1.85Bb 0.128 <0.001 <0.001 0.038
与YZA组相比,发酵4和24 h时,YLA组和YMA组发酵液中TVFA含量极显著升高(P<0.01),发酵8和16 h时YLA组和YMA组TVFA含量显著升高(P<0.05),发酵48 h时试验组TVFA含量极显著升高(P<0.01);发酵4、8和16 h时YLA组和YMA组发酵液中乙酸含量显著升高(P<0.05),发酵24 h时,试验组乙酸含量极显著升高(P<0.01),发酵48 h时,YLA组和YMA组乙酸含量极显著升高(P<0.01),发酵72 h时YMA组和YHA组乙酸含量极显著升高(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,48 h发酵液中TVFA含量呈现线性效应(P<0.05),4、8、16、24和48 h发酵液中TVFA和乙酸含量呈现二次效应(P<0.01),24和72 h发酵液中乙酸含量呈现线性效应(P<0.01)。
与YZA组相比,发酵4、24和48 h时,YLA组、YMA组和YHA组发酵液中丙酸含量均极显著升高(P<0.01),发酵8和16 h时,YLA组和YMA组丙酸含量显著升高(P<0.05),发酵72 h时,YLA组和YMA组丙酸含量极显著升高(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,4和48 h发酵液中丙酸含量呈现线性效应(P<0.05),发酵24和72 h丙酸含量呈现线性效应(P<0.01),发酵4、8和16 h丙酸含量呈现二次效应(P<0.01),发酵24 h时丙酸含量呈现二次效应(P<0.05)。
与YZA组相比,在发酵24 h时,YMA组发酵液中丁酸含量极显著升高(P<0.01),除24 h其余各时间点,YMA组发酵液中丁酸含量显著升高(P<0.05)。随着沙葱粉添加水平的提高,8和16 h发酵液中丁酸含量呈现线性效应升高(P<0.05),4和24 h丁酸含量呈现二次效应(P<0.01)。
与YZA组相比,发酵4 h时,YMA组和YHA组发酵液中乙酸/丙酸显著降低(P<0.05),发酵8 h时,YLA组和YMA组乙酸/丙酸极显著降低(P<0.01),发酵24 h时,YHA组乙酸/丙酸显著升高(P<0.05),发酵48 h时,YMA组乙酸/丙酸极显著升高(P<0.01),发酵72 h时,YMA组和YHA组乙酸/丙酸极显著升高(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,发酵48和72 h,发酵液中乙酸/丙酸呈现线性效应和二次效应(P<0.05或P<0.01),发酵8、16和24 h,乙酸/丙酸呈现二次效应(P<0.01),发酵4 h,乙酸/丙酸呈现线性效应(P<0.05)。
与YZA组相比,发酵4 h时YHA组发酵液中异丁酸含量显著升高(P<0.05),发酵8和16 h时YMA组和YHA组异丁酸含量显著升高(P<0.05);发酵8和24 h时YMA组发酵液中异戊酸含量显著升高(P<0.05),发酵16 h时YHA组发酵液中异戊酸含量显著升高(P<0.05)。

2.2 沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵营养物质降解率的影响

由表4可知,与YZA组相比,发酵4 h时,YLA组、YMA组和YHA组的DMD均显著升高(P<0.05),发酵24和72 h时,YMA组DMD显著升高(P<0.05)。随着沙葱粉添加水平的提高,发酵4 h时发酵底物DMD呈现线性关系(P<0.01),发酵72 h时发酵底物DMD呈现二次效应(P<0.05)。
表4 不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵DM、NDF和ADF降解率的影响

Table 4 Effects of different levels of Allium mongolicum Regel powder on degradation rates of DM, NDF and ADF in rumen in vitro fermentation of yaks%

项目
Items		 组别 Groups SEM P值P-value
YZA YLA YMA YHA 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
干物质降解率 DMD
4 h 14.85b 18.04a 18.24a 19.27a 0.583 0.012 0.003 0.168
8 h 15.79 16.80 16.85 17.22 1.149 0.983 0.731 0.908
16 h 25.91 26.66 26.77 27.89 0.623 0.786 0.369 0.897
24 h 28.50b 29.93ab 34.23a 30.06ab 0.916 0.029 0.225 0.104
48 h 37.22 39.03 41.53 39.75 0.958 0.517 0.435 0.237
72 h 42.15b 45.97ab 47.08a 43.61ab 0.835 0.037 0.406 0.031
中性洗涤纤维降解率 NDFD
4 h 6.96Bb 7.55Bb 10.07Aa 9.77Aa 0.418 <0.001 <0.001 0.072
8 h 9.49b 9.60b 12.43a 10.47b 0.414 0.011 0.033 0.072
16 h 14.39b 14.77b 16.49a 14.67b 0.321 0.025 0.261 0.051
24 h 15.72b 17.95ab 18.20a 18.67a 0.458 0.029 0.021 0.252
48 h 22.37Bb 21.43Bb 28.39Aa 27.73Aa 0.946 <0.001 <0.001 0.679
72 h 32.08Bb 36.07Aa 35.78Aa 36.06Aa 0.537 <0.001 <0.001 0.002
酸性洗涤纤维降解率 ADFD
4 h 5.36Cc 7.41Bb 10.13Aa 9.38Aa 0.582 <0.001 <0.001 0.007
8 h 8.84Cc 10.45Bb 11.53Aa 7.41Dd 0.488 <0.001 0.037 0.007
16 h 7.88Cc 12.67ABab 14.05Aa 11.16Bb 0.744 <0.001 0.005 <0.001
24 h 12.29Bb 15.86Aa 15.56Aa 15.60Aa 0.466 <0.001 <0.001 <0.001
48 h 19.75c 23.00ab 23.84a 20.68bc 0.591 0.014 0.305 0.002
72 h 25.62Dd 30.21Bb 31.06Aa 26.56Cc 0.705 <0.001 0.009 <0.001
与YZA组相比,发酵4、48 h时,YMA组和YHA组NDFD极显著升高(P<0.01),发酵8、16、24 h时,YMA组NDFD显著升高(P<0.05),发酵72 h时,YLA组、YMA组和YHA组NDFD极显著升高(P<0.01)。随着沙葱粉添加水平的提高,发酵4和48 h时发酵底物NDFD呈现线性效应(P<0.01),发酵8和24 h时发酵底物NDFD呈现线性效应(P<0.05),发酵72 h时发酵底物NDFD呈现线性和二次效应(P<0.01)。
与YZA组相比,发酵4、16、24、72 h时,YLA组、YMA组和YHA组ADFD极显著升高(P<0.01),发酵8 h时,YLA组和YMA组ADFD极显著升高(P<0.01),48 h时,YLA组和YMA组ADFD显著升高(P<0.05)。随着沙葱粉添加水平的提高,发酵8 h时,发酵底物ADFD呈现线性效应(P<0.05)和二次效应(P<0.01),发酵48 h时,发酵底物ADFD呈现二次效应(P<0.01),其余发酵时间发酵底物ADFD均呈现线性(P<0.01)和二次效应(P<0.01)。

2.3 沙葱粉对牦牛瘤胃微生物区系的影响

2.3.1 稀释曲线及分类操作单元(OTU)的Venn图分析

由图1-a可知,随着样本量的增加,稀释曲线趋于平缓,说明测序数据量渐进合理,更多的数据量也不会对α-多样性指数有显著的影响。由图2-b可知,YZA组发酵液中含有2 238个OTU,YLA组含有2 750个OTU,YMA组中含有2 433个OTU,YHA组中含有2 648个OTU,YZA组和YLA组共有1 428个OTU,YZA组和YMA组共有1 344个OTU,YZA组和YHA组共有1 415个OTU,YZA组、YLA组、YMA组和YHA组特有OTU数目分别为592、877、701和197个。
图1 稀释曲线(a)和Venn图(b)

YZA为对照组,不添加沙葱粉;YLA、YMA、YHA为试验组,沙葱粉添加量分别为1.2%、2.4%和3.6%。下图同。

Fig.1 Dilution curve (a) and Venn diagram (b)

YZA was the control group, without the addition of Allium mongolicum Regel powder; YLA, YMA and YHA were the experimental groups, and the addition amounts of Allium mongolicum Regel were 1.2%, 2.4% and 3.6%, respectively. The same as below.

图2 各组门水平(a)和属水平(b)微生物的丰度图

Bacteroidota:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Verrucomicrobiota:疣微菌门;Fibrobacterota:纤维杆菌门;Spirochaetota:螺旋菌门;Cyanobacteria:脱硫杆状菌门;Desulfobacterota:互养菌门;Synergistota:放线菌门;Patescibacteria:髌骨菌门;Prevotella:普雷沃氏菌属;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9肠道群;Succinivibrio:琥珀酸弧菌属;Ruminobacter:瘤胃杆菌属;Anaerovibrio:厌氧弧菌属;Fibrobacter:丝状杆菌属;Prevotellaceae_UCG-003:普雷沃氏菌科UCG-003;Streptococcus:链球菌属;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森氏菌科R-7群;Prevotellaceae_YAB2003_group:普雷沃氏菌科YAB2003群;Selenomonas:月形单胞菌属。

Fig.2 Abundance graph of microorganism at phylum level (a) and genus level (b) in each group

2.3.2 瘤胃微生物α-多样性指数分析

由表5可知,本次测序Coverage指数均达到0.99以上,测序深度合理,测序范围能涵盖大部分区域。3个试验组α-多样性指数略高于YZA组,但与YZA组相比均没有显著差异(P>0.05)。
表5 不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃微生物α-多样性指数的影响

Table 5 Effects of different levels of Allium mongolicum Regel powder on rumen microorganism α-diversity indexes of yaks

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
YZA YLA YMA YHA 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
Chao1指数 Chao1 index 1 439.265 1 850.119 1 445.996 1 772.821 92.383 0.271 0.460 0.813
Shannon指数 Shannon index 7.621 7.914 7.930 8.087 0.098 0.452 0.147 0.741
Simpson指数 Simpson index 0.978 0.979 0.983 0.986 0.002 0.372 0.104 0.757
Coverage指数 Coverage index 0.998 0.997 0.998 0.997 0.000 0.214 0.671 0.753

2.3.3 瘤胃微生物物种组成分析

通过16S rRNA基因测序分析了瘤胃微生物物种组成。如图2-a所示,各组瘤胃微生物在门水平上的优势菌门均为拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes),Bacteroidota、Firmicutes、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)及纤维杆菌门(Fibrobacterota)相对丰度>1%,Bacteroidota相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为39.44%、43.08%、43.86%和41.86%,Firmicutes相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为25.62%、26.24%、28.16%和26.09%,Proteobacteria相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为25.87%、24.80%、21.55%和23.05%,但与YZA组相比(图3-a至图3-e),试验组Bacteroidota、Firmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobiota及Fibrobacterota相对丰度无显著差异(P>0.05);各组瘤胃微生物在属水平上的优势菌属均为普雷沃氏菌属(Prevotella)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio),Prevotella相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为15.37%、15.41%、18.72%和21.19%,Rikenellaceae_RC9_gut_group相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为17.26%、19.50%、18.79%和17.89%,Succinivibrio相对丰度在YZA组、YLA组、YMA组和YHA组中分别为15.31%、14.86%、12.27%和11.60%,与YZA组相比(图3-f至图3-j),各试验组Prevotella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Succinivibrio和瘤胃杆菌属(Ruminobacter)相对丰度无显著差异(P>0.05),YMA组和YHA组F082相对丰度显著升高(P<0.05)。这提示沙葱粉的添加并未改变体外瘤胃液优势微生物的占比。
图3 门水平和属水平微生物相对丰度箱线图

a~e:门水平微生物相对丰度箱线图;f~j:属水平微生物相对丰度箱线图;*代表差异显著(P<0.05)。a to e: box plots of relative abundance of microorganism at the phylum level; f to j: box plots of relative abundance of microorganism at the genus level; * represents significant difference (P<0.05).

Bacteroidota:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Verrucomicrobiota:疣微菌门;Fibrobacterota:纤维杆菌门;Prevotella:普雷沃氏菌属;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9肠道群;Succinivibrio:琥珀酸弧菌属;Ruminobacter:瘤胃杆菌属。

Fig.3 Box plots of relative abundance of microorganism at phylum level and genus level

2.3.4 瘤胃微生物属水平组间差异性分析

利用Metastat检验评估不同水平沙葱粉对瘤胃液微生物属水平相对丰度差异显著的物种,结果如图4所示。由图4-a可知,与YZA组相比,YLA组假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、反刍真杆菌群(Eubacterium_ruminantium_group)、UCG-005、毛螺菌科UCG-009(Lachnospiraceae_UCG-009)、UCG-009、p-1088-a5_gut、颤螺菌属(Oscillospira)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度显著升高(P<0.05),梭状芽孢杆菌1(Clostridium_sensu_stricto_1)相对丰度显著降低(P<0.05)。由图4-b所示,YMA组F082、普雷沃氏菌科UCG-001、凸腹真杆菌群(Eubacterium_ventriosum_group)、p-1088-a5_gut相对丰度显著升高(P<0.05),Clostridium_sensu_stricto_1相对丰度显著降低(P<0.05)。由图4-c所示,YHA组F082、口腔杆菌属(Oribacterium)、乳头杆菌属(Papillibacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、UCG-005和Family_XIII_AD3011_group相对丰度显著升高(P<0.05),金字塔杆菌属(Pyramidobacter)、有益杆状菌属(Agathobacter)和DEV114相对丰度显著降低(P<0.05)。
图4 差异微生物属水平相对丰度(Metastat 检验)

Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌属;Eubacterium_ruminantium_group:反刍真杆菌群;Lachnospiraceae_UCG-009:毛螺菌科UCG-009;Oscillospira:颤螺菌属;Bifidobacterium:双歧杆菌属;Clostridium_sensu_stricto_1:梭状芽孢杆菌1:Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Eubacterium_ventriosum_group:凸腹真杆菌群;Oribacterium:口腔杆菌属;Papillibacter:乳头杆菌属;Pyramidobacter:金字塔杆菌属;Acinetobacter:不动杆菌属。

Fig.4 Relative abundance of differential microorganism at genus level (Metastat test)

2.3.5 属水平差异微生物与体外发酵参数、营养物质降解率的相关性分析

如图5所示,发酵液中NH3-N含量与Prevotellaceae_UCG-001(r=-0.946)、F082(r=-0.910)和Family_XIII_AD3011_group(r=-0.919)相对丰度呈显著负相关(P<0.05),MCP含量与Kandleria相对丰度呈显著负相关(r=-0.919;P<0.05),与UCG-005(r=0.919)、p_1088_a5_gut_group(r=0.978)和Papillibacter(r=0.949)相对丰度呈显著正相关(P<0.05);pH与F082(r=-0.952)、Oribacterium(r=-0.950)和Family_XIII_AD3011_group(r=-0.965)相对丰度呈显著负相关(P<0.05)。
图5 差异微生物相对丰度与发酵参数、营养物质降解率的皮尔逊相关性分析

红色表示正相关,蓝色表示负相关,颜色越深表示相关性越强;*表示显著相关(P<0.05),**表示极显著相关(P<0.01)。Red indicates positive correlation, blue indicates negative correlation, and darker color indicates stronger correlation; * means significant association (P<0.05), ** means very significant association (P<0.01)。

Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌属;Eubacterium_ruminantium_group:反刍真杆菌群;Lachnospiraceae_UCG-009:毛螺菌科UCG-009;Oscillospira:颤螺菌属;Bifidobacterium:双歧杆菌属;Clostridium_sensu_stricto_1:梭状芽孢杆菌1; Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Eubacterium_ventriosum_group:凸腹真杆菌群;Oribacterium:口腔杆菌属;Papillibacter:乳头杆菌属;Pyramidobacter:金字塔杆菌属;Acinetobacter:不动杆菌属;NH3-N:氨态氮 ammoniacal nitrogen;MCP:菌体蛋白 mycoprotein;TVFA:总挥发性脂肪酸 total volatile fatty acids;Acetic acid:乙酸;Propionic acid:丙酸;Butyric acid:丁酸;Valeric acid:戊酸;Isobutyric acid:异丁酸;Isovaleric acid:异戊酸;A/P:乙酸/丙酸 acetic/propionic acid;DMD:干物质降解率 dry matter degradation rate;NDFD:中性洗涤纤维降解率 neutral detergent fiber degradation rate;ADFD:酸性洗涤纤维降解率 acid detergent fiber degradation rate。

Fig.5 Pearson correlation analysis of differential microbial relative abundance with fermentation parameters and nutrient degradation rates

TVFA含量与Agathobacter相对丰度呈显著负相关(r=-0.965;P<0.05),与Lachnospiraceae_UCG-001相对丰度呈显著正相关(r=0.978;P<0.05);乙酸含量与UCG-005(r=0.904)、Eubacterium_ventriosum_group(r=0.943)和VadinHA49(r=0.947)相对丰度呈显著正相关(P<0.05);丙酸含量与Lachnospiraceae_UCG-009相对丰度呈极显著正相关(r=0.982;P<0.01),与Agathobacte相对丰度呈极显著负相关(r=-0.994;P<0.01),与Clostridium_sensu_stricto_1相对丰度呈显著负相关(r=-0.965;P<0.05);丁酸含量与DEV114相对丰度呈显著正相关(r=0.907;P<0.05);戊酸含量与Oscillospira相对丰度呈显著正相关(r=0.931;P<0.05),与Prevotellaceae_UCG-001相对丰度呈显著负相关(r=-0.941;P<0.05);异丁酸含量与Bifidobacterium相对丰度呈显著负相关(r=-0.925;P<0.05);异戊酸含量与DEV114相对丰度呈极显著正相关(r=0.998;P<0.01);乙酸/丙酸(A/P)与p_1088-a5_gut_group(r=-0.910)、DEV114(r=-0.914)和Pyramidobacter(r=-0.952)相对丰度呈显著负相关(P<0.05);DMD与Clostridium_sensu_stricto_1相对丰度呈显著正相关(r=0.909;P<0.05),与Agathobacter相对丰度呈极显著正相关(r=0.984;P<0.01),与Lachnospiraceae_UCG-009相对丰度呈极显著负相关(r=-0.990;P<0.01);NDFD与Oscillospira相对丰度呈显著负相关(r=-0.918;P<0.05),ADFD与Oscillospira(r=-0.966)和Pseudobutyrivibrio(r=-0.964)相对丰度呈显著负相关(P<0.05)。

3 讨论

3.1 沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数和营养物质降解率的影响

瘤胃pH可以反映微生物发酵活动,是评价瘤胃内环境稳定性的重要指标之一。反刍动物瘤胃pH的正常范围是5.5~7.5[19]。本试验结果显示,发酵液中各组pH的变化范围是6.18~6.76,属于正常范围之内,表明沙葱粉的添加对瘤胃内环境未产生负面影响,不会影响瘤胃微生物发酵。与YZA组相比,YMA组pH在发酵4、16、48和72 h时显著降低,而YLA组在发酵4和16 h时显著降低,YHA组则无显著差异,说明YMA组对瘤胃内环境的影响较显著。瘤胃内pH的降低和TVFA含量的升高相关[20],瘤胃发酵过程中碳水化合物的主要降解产物TVFA是反刍动物机体的主要能量来源[2],也是反映微生物对于饲料利用程度的重要指标。本研究中,YLA组和YMA组TVFA、乙酸和丙酸含量显著升高,说明瘤胃微生物对纤维素的分解水平上升,同时与YZA组相比,YLA组和YMA组中,作为主要参与纤维类物质和碳水化合物降解的Bacteroidota、Firmicutes相对丰度分别升高3.64%、4.43%和0.62%、2.54%,说明沙葱粉的添加可以促进瘤胃纤维分解菌的繁殖及瘤胃中纤维素和半纤维素的降解。A/P可以反映发酵类型,当比值≤2.5时为丙酸型发酵[21],本研究中,发酵4 h时试验组未改变发酵类型,但是有向丙酸发酵转变的趋势,发酵8~24 h开始,试验组A/P低于YZA组,发酵48和72 h试验组A/P高于YZA组,变为丙酸型发酵,并从8 h开始,A/P逐渐降低,这可能是由于沙葱粉的添加刺激了部分乙酸或者丙酸产生菌的繁殖,致使发酵类型发生改变。Zhao等[9]研究表明,饲粮中添加沙葱精油会对丙酸和醋酸盐产生菌具有刺激作用,降低绵羊的瘤胃pH,提高TVFA含量,究其原因可能是因为沙葱水提取物和沙葱乙醇提取物可以增加瘤胃中淀粉降解菌和纤维素降解菌的数量,有助于可溶性碳水化合物及粗纤维的发酵,促进营养物质降解。
包玲玲[22]以绵羊为试验动物,在其饲粮中添加沙葱黄酮类化合物,发现沙葱黄酮可显著提高TVFA、乙酸及丙酸含量,显著降低A/P。这提示沙葱及其提取物可以通过改变瘤胃发酵模式促进肉羊营养物质消化吸收,进而提高其生长性能,这与本试验研究结果一致。在本研究中,YLA组和YMA组除72 h以外其余各发酵时间点的瘤胃液TVFA含量较YZA组显著升高,YHA组无显著变化;且除72 h外各发酵时间点随着沙葱粉添加水平的增加,TVFA和乙酸含量二次变化效应极显著,说明在本试验条件下,饲粮中添加2.4%沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵液中TVFA和乙酸含量的影响显著。
瘤胃中的NH3-N主要来源于饲粮中的含氮物质、MCP和非蛋白氮降解物质,以及尿素通过瘤胃壁的再循环过程,其中一部分NH3-N经微生物分解形成MCP。瘤胃中的NH3-N是瘤胃细菌的唯一氮源,瘤胃原虫由于不能产生MCP,只能通过吞噬细菌来增加氮在瘤胃中的周转消耗。研究表明,瘤胃原虫可以分解蛋白质,参与NH3-N生成,但不能使用NH3-N用于自身[23]。本研究中,随着沙葱粉添加水平的提高,发酵液中NH3-N含量下降,MCP含量提高,瘤胃对NH3-N含量耐受范围为8.5~30 mg/dL[24],本试验中,YZA组和试验组瘤胃液NH3-N含量均在有效范围内,YMA组和YHA组瘤胃液NH3-N含量显著低于YZA组,YMA组瘤胃液MCP含量显著升高,YHA组MCP含量具有升高的趋势,说明沙葱粉可以通过降低NH3-N含量来提高瘤胃微生物的合成速度及内源氮的周转。范娟等[8]通过研究表明,沙葱粉可以降低藏羊瘤胃液NH3-N含量,这与本试验研究结果一致,产生这一现象的原因可能是沙葱黄酮抑制了原虫的活性,降低了原虫对MCP的消耗以及对NH3-N的降解效率[25]。在本研究中,YLA组在发酵8、16、72 h时发酵液中NH3-N含量较YZA组显著降低,YHA组在发酵16、24、48和72 h时较YZA组显著降低,YMA组在完整的发酵周期内均显著低于YZA组,说明在本试验条件下饲粮中添加2.4%沙葱粉对NH3-N含量的影响较明显。
营养物质降解率指的是在体外发酵过程中微生物对发酵底物的利用程度,营养物质消化率越高则说明其微生物丰度越高[26]。本试验结果显示,与YZA组相比,YMA组和YHA组牦牛体外瘤胃液中DMD显著提高,NDFD和ADFD提高。赵亚星等[27]研究表明,沙葱精油对肉羊体外瘤胃发酵有积极影响,添加0.08 mg沙葱精油能够显著提高底物DMD。Ma等[28]研究发现,饲粮中添加大蒜素(主要活性成分为有机硫化合物),可以使犊牛瘤胃内分解纤维素(琥珀酸酵母菌、黄酸酵母菌和溶纤维酵母菌)的菌群丰度提高,从而提高犊牛的有机物、氮、NDF和ADF的表观消化率。在本试验中,饲粮中添加沙葱粉显著提高了Rikenellaceae_RC9_gut_group和Succinivibrio的相对丰度,Rikenellaceae_RC9_gut_group和Succinivibrio是瘤胃中主要的纤维分解菌,能够产生纤维素酶,降解纤维素和半纤维[29],从而提高了NDFD和ADFD。综上所述,饲粮中添加1.2%和2.4%沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵参数具有显著影响,添加2.4%和3.6%沙葱粉对牦牛瘤胃体外营养物质降解率具有显著影响,综合考虑,饲粮中添加2.4%沙葱粉对牦牛体外发酵的效果最佳。

3.2 沙葱粉对牦牛瘤胃微生物区系的影响

反刍动物瘤胃内栖息着大量的微生物,它们在瘤胃中发挥着发酵并消化营养物质[30]、提高对外部应激的抵抗力和促进生长发育[31]等重要作用。瘤胃中最重要的微生物类群是细菌,这类菌群的丰度可能长期处于一种动态平衡状态,但也可能会受到诸如饮食、动物年龄和饲料添加剂[32]等多种因素的影响。本试验中,各组Chao1、Simpson、Shannon和Coverage指数均无显著差异,说明添加沙葱粉对瘤胃微生物α-多样性指数没有显著影响,同时瘤胃微生物物种组成分析显示,沙葱粉的添加并未改变体外瘤胃液优势菌群的占比。同时发现,Bacteroidota、Firmicutes、Proteobacteria是微生物群落的优势门,与YZA组相比,饲粮中添加沙葱粉提高了Firmicutes与Bacteroidota的相对丰度,Firmicutes能够分解和利用植物纤维,为反刍动物提供能量和其他营养物质。Bacteroidota的代谢作用有助于维护肠道微生物平衡和反刍动物的健康。这提示沙葱粉的添加更有利于牦牛利用纤维素等难消化的物质为机体提供能量[33]。在反刍动物瘤胃中,瘤胃微生物优势菌属主要有Prevotella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Succinivibrio,而Prevotella是拟杆菌门中相对丰度最高的属[34],本试验也证实了这一点。研究表明,Prevotella不仅可以分泌有助于降解多糖的木聚糖[35],部分Prevotella还参与纤维、半纤维、果胶和蛋白质的降解和利用过程[36]。另外,YLA组了Pseudobutyrivibrio、Eubacterium_ruminantium_group、UCG-005的相对丰度显著提高,研究发现,瘤胃中Pseudobutyrivibrio是一种产丁酸盐的瘤胃细菌,可以分泌较高的纤维素酶,能显著提高纤维类物质的降解[37];Eubacterium_ruminantium_group可以发酵纤维素和碳水化合物,产生醋酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸;而UCG-005参与体内纤维素的降解和淀粉消化过程。发酵参数结果显示,在发酵达到24 h时,TVFA、乙酸、丙酸含量均显著升高,且UCG-005、Eubacterium_ruminantium_group相对丰度与TVFA、丙酸含量呈正相关关系,说明本试验结果与上述情况一致。YMA组F082和Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度显著升高,YHA组F082和Oribacterium相对丰度显著升高。研究发现,Prevotella参与葡萄糖代谢,产生醋酸作为初级发酵终产物,导致TVFA含量上升[38]。本试验中,YMA组Prevotellaceae_UCG-001相对丰度显著升高,且Prevotellaceae_UCG-001的相对丰度与戊酸含量呈显著负相关,这个可能是由于戊酸作为一种能量来源,被其利用进行自身的生长和代谢活动。YMA组和YHA组F082相对丰度显著升高,且与NH3-N含量和pH呈显著负相关。Han等[39]研究发现,用富含黄酮类、多糖化学活性成分的桑叶青贮替代玉米青贮和豆粕后饲喂滩羊,结果发现滩羊瘤胃中F082的相对丰度显著提高,其相对丰度与滩羊瘤胃发酵参数密切相关,在非常规饲料的消化过程中具有重要作用。闵力等[40]在研究中发现,饲喂沉香叶有提高育肥黑山羊瘤胃Prevotella相对丰度的趋势,并提高F082的相对丰度,本试验中,YMA组F082相对丰度显著升高,且F082相对丰度与NH3-N含量、pH呈负相关,与MCP、TVFA、乙酸、丙酸含量呈正相关,说明产生上述现象的原因可能是由于F082能够促进反刍动物更好地利用NH3-N、肽和氨基酸合成MCP。综上所述,在牦牛饲粮中添加不同水平沙葱粉对牦牛瘤胃体外发酵液中部分微生物具有不同程度的影响,其中YMA组F082相对丰度显著提高,这可能是其改善瘤胃发酵和营养物质降解率的主要原因。

4 结论

在饲粮中添加2.4%和3.6%沙葱粉显著提高牦牛瘤胃体外ADFD和NDFD;添加1.2%和2.4%沙葱粉显著影响牦牛瘤胃体外发酵pH、MCP、NH3-N、TVFA、乙酸、丙酸含量和A/P;在门水平和属水平上,优势菌群占比没有发生改变,但添加2.4%和3.6%沙葱显著影响F082的相对丰度,同时Prevotella和Succinivibrio相对丰度有变化的趋势。综上所述,在本试验条件下,牦牛饲粮中沙葱粉的最适添加水平为2.4%。

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