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2024 , Vol. 36 >Issue 6: 3963 - 3972

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.339

研究论文

水蔓菁总黄酮对小鼠巨噬细胞的抗炎活性及其机制

  • 韩勇
展开
  • 山西药科职业学院,太原 030031

韩 勇(1978—),男,山西太原人,讲师,硕士,从事天然产物药理活性研究。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2023-12-14

  网络出版日期: 2024-06-07

基金资助

山西省2020年度职业院校教师素质提高计划中高职教师素质协同提升项目(CXTD2020-11)

山西药科职业学院科研资助项目(2020106)

山西药科职业学院教师发展基金专项资助项目

收起

Anti-Inflammatory Activity and Mechanism of Total Flavonoids from Veronica linariifolia on Mouse Macrophage

  • HAN Yong
Expand
  • Shanxi Pharmaceutical Vocational College, Taiyuan 030031, China

HAN Yong, lecturer, E-mail:

Received date: 2023-12-14

  Online published: 2024-06-07

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摘要

本试验以脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7为试验材料,研究水蔓菁总黄酮的体外抗炎活性及其机制。采用MTT法检测水蔓菁总黄酮的细胞毒性,中性红试验测定细胞吞噬能力,Griess法检测一氧化氮(NO)的生成量,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)的生成量,Western blot法检测核因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白表达量。结果显示:质量浓度为200 μg/mL的水蔓菁总黄酮对小鼠巨噬细胞RAW264.7无显著毒性(P>0.05)。不同质量浓度(25、50、100、200、300、400 μg/mL)的水蔓菁总黄酮均能显著或极显著增强LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力(P<0.05或P<0.01),显著或极显著抑制NO、IL-1 、IL-6、TNF-α、PGE2、iNOS和COX-2的生成量及磷酸化核因子-κB p65 (p-NF-κB p65)和磷酸化核因子-κB抑制蛋白α(p-IκBα)的蛋白表达量(P<0.05或P<0.01),并能显著或极显著增强核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达量(P<0.05或P<0.01)。综上可知,水蔓菁总黄酮能增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力,并能够通过抑制细胞内iNOS、COX-2、NO和炎症因子的生成和调控NF-κB信号通路相关蛋白表达来发挥体外抗炎活性。

关键词： 水蔓菁; 总黄酮; 巨噬细胞; 抗炎活性

本文引用格式

韩勇 . 水蔓菁总黄酮对小鼠巨噬细胞的抗炎活性及其机制[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(6) : 3963 -3972 . DOI: 10.12418/CJAN2024.339

Abstract

The purpose of this study was to investigate the in vitro anti-inflammatory activity and mechanism of total flavonoids from Veronica linariifolia by lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophages RAW264.7. MTT assay was used to detect the cytotoxicity of total flavonoids from Veronica linariifolia; the phagocytosis capacity was determined by neutral red assay; the production of nitric oxide (NO) was detected by Griess method; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to detect the production of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), prostaglandin E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2); the expression levels of nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway-associated proteins were assayed by Western blotting method. The results showed that the total flavonoids from Veronica linariifolia in the mass concentration of 200 μg/mL had no significant cytotoxicity to mouse macrophages RAW264.7 (P>0.05). Different mass concentrations (25, 50, 100, 200, 300 and 400 μg/mL) of total flavonoids from Veronica linariifolia could significantly or extremely significantly enhance the phagocytosis capacity of mouse macrophages RAW264.7 induced by LPS (P<0.05 or P<0.01), significantly or extremely significantly inhibit the production of NO, IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2, iNOS, COX-2 and the protein expression levels of phosphorylated nuclear factor-κB p65 (p-NF-κB p65) and phosphorylated inhibitor of nuclear factor-κBα (p-IκBα) (P<0.05 or P<0.01), and significantly or extremely significantly enhance the protein expression level of inhibitor α of nuclear factor-κB (IκBα). In conclusion, the total flavonoids from Veronica linariifolia can enhance the phagocytosis function of mouse macrophages and exert anti-inflammatory activity in vitro by inhibiting the production of iNOS, COX-2, NO and inflammatory factors, and regulating the expression of NF-κB signaling pathway-associated proteins.

Key words： Veronica linariifolia; total flavonoids; macrophage; anti-inflammatory activity

炎症是动物的机体接受有害刺激或损伤后形成的一种生理应答反应,但过度的炎症反应将会对机体造成损伤甚至引起疾病[1-2]。作为一种免疫细胞,巨噬细胞在机体的炎症反应中发挥重要作用。静息状态的巨噬细胞只生成极微量的炎症物质,当受到外部刺激时,巨噬细胞会释放白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)等炎症因子和一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)等炎症介质,这些炎症物质过量生成能加剧炎症反应[3]。脂多糖(LPS)是一种炎症诱导剂,可激活巨噬细胞。在LPS诱导下,巨噬细胞释放一系列炎症因子和炎症介质,使机体产生严重的炎症反应,因而降低炎症物质的过量生成是控制炎症反应、减轻机体损伤或疾病的有效途径[4]。
水蔓菁[Veronica linariifolia Pall. ex Link subsp. dilatata (Nakai et Kitagawa)Hong]是玄参科婆婆纳属植物,又名勒马回[5],味苦、性微寒[6],主要生长于山西、山东、河南、河北、广东、浙江等地区[7]。在民间,水蔓菁有长期且广泛的食用和药用历史。《救荒本草》和《植物名实图考长编》对水蔓菁的食用和药用作了记载。作为民间草药,水蔓菁有“中药抗生素”之称[8]。《中华人民共和国药典(1977年版 一部)》和2002年版《山东省中药材标准》对水蔓菁均有收载。在临床治疗中,以水蔓菁为主要成分的制剂有勒马回注射液、勒马回胶囊、勒马回片、复方勒马回颗粒、消肿止痛贴等[9]。目前关于水蔓菁有效成分的生物活性研究报道较少,吴华燕等[8]对水蔓菁中含量较高的5种苷类化合物进行了分离鉴定,樊串巧[10]测定了水蔓菁中的原茶儿酸。研究表明,水蔓菁的主要化学成分有黄酮类[11]、挥发油[12]、酚类等,其中黄酮类是水蔓菁的主要活性物质,具有止咳、体外促凝血、抗大鼠前列腺增生等活性[13-14]。黄酮类成分在药用植物中分布广泛,具有多种生物活性,研究已发现黄芪[15]、芦蒿[16]、沙葱[17]、苦竹枝[18]等多种药用植物的总黄酮表现出良好的抗炎活性,但目前有关水蔓菁中黄酮类成分抗炎活性的研究鲜见报道。
本研究以LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7构建体外炎症反应细胞模型,考察水蔓菁总黄酮的体外抗炎作用,旨在从细胞水平探讨水蔓菁总黄酮的抗炎作用机制,为水蔓菁活性成分的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水蔓菁产于山西运城市万荣县;小鼠巨噬细胞RAW264.7购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝科技有限公司;IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司;MTT细胞毒性检测试剂盒、RIPA裂解液购自上海尚宝生物科技有限公司;青霉素-链霉素溶液、LPS、中性红试剂盒、NO检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;小鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)ELISA试剂盒、小鼠COX-2 ELISA试剂盒购自英国Abcam公司;β-肌动蛋白(β-actin)、核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκBα(p-IκBα)、磷酸化核因子-κB p65(p-NF-κB p65)抗体购自美国CST公司。
TU1900紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;BC-J160型CO2细胞培养箱,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;VS840U型净化工作台,上海合恒仪器设备有限公司;BM-37XCC型倒置生物显微镜,上海彼爱姆光学仪器制造有限公司;DNM9606酶标分析仪,北京普朗新技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 水蔓菁总黄酮的制备

采用闪式提取方法制备水蔓菁总黄酮[11],所得总黄酮提取液通过聚酰胺柱,经纯化水洗脱至无色,再经体积分数为95%的乙醇洗脱后,收集洗脱液,真空干燥后备用。所得试验样品采用紫外分光光度法[9]在波长510 nm处测得总黄酮含量为95.6%。

1.2.2 细胞培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7使用DMEM培养基,细胞培养液中加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液,于CO2培养箱中5% CO2、37 ℃条件下培养。

1.2.3 MTT法检测细胞毒性

按照“1.2.2”项下步骤培养细胞,待细胞生长至对数生长期,制备单细胞悬液,调整细胞密度为1×105个/mL。将制备好的单细胞悬液以每孔100 μL接种于96孔板,继续培养24 h。设空白对照组和总黄酮组,每组3个平行孔。空白对照组加入100 μL培养液,总黄酮组加入100 μL含不同质量浓度(分别为25、50、100、200、300、400 μg/mL)水蔓菁总黄酮的培养液,于CO2培养箱中5% CO2、37 ℃条件下培养8 h,然后按照MTT细胞毒性检测试剂盒方法检测吸光度(OD),计算细胞存活率(空白对照组为100%):

细胞存活率(%)=(OD总黄酮组/OD空白对照组)×100。

1.2.4 细胞吞噬能力测定

按照“1.2.3”项下步骤进行试验。设空白对照组、LPS组、LPS+总黄酮组,每组3个平行孔。空白对照组加入100 μL培养液,LPS组加入100 μL含1 μg/mL LPS的培养液,LPS+总黄酮组加入100 μL含1 μg/mL LPS和不同质量浓度(分别为10、20、40、80 μg/mL)水蔓菁总黄酮的培养液,于CO2培养箱中5% CO2、37 ℃条件下培养24 h,然后参考文献[19]的方法,使用中性红试剂盒测定细胞吞噬能力。

1.2.5 NO和炎症因子生成量检测

按照“1.2.4”项下步骤进行试验,培养结束后采用Griess法,使用NO检测试剂盒检测NO生成量;采用ELISA法,按照试剂盒说明检测IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2生成量。

1.2.6 iNOS和COX-2生成量检测

按照“1.2.4”项下步骤进行试验,各组培养结束后弃去上清液,使用磷酸缓冲液冲洗3次,用RIPA裂解液裂解蛋白,以10 005×g离心20 min,得上清液,参考文献[20]的方法,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,并用ELISA法检测iNOS和COX-2生成量。

1.2.7 Western blot法检测核因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白表达

按照“1.2.4”项下步骤进行试验,各组培养结束后弃去上清液,经预冷的磷酸盐缓冲液洗涤,加RIPA裂解液,蛋白裂解后离心得上清液,按照BCA试剂盒检测蛋白浓度。取蛋白开展十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),后移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,封闭液封闭2 h后,加一抗溶液4 ℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜3次,在室温下二抗孵育1 h,洗涤后ECL显影。以β-actin条带作为试验内标,检测目的蛋白的表达水平。

1.3 统计分析

运用SPSS 21.0软件进行t检验、单因素方差分析,试验数据用平均值±标准误表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 水蔓菁总黄酮的细胞毒性

由图1可知,与空白对照组相比,当水蔓菁总黄酮质量浓度为300和400 μg/mL时,细胞存活率极显著下降(P<0.01);质量浓度为25~200 μg/mL的水蔓菁总黄酮对细胞存活率无显著影响(P>0.05),说明此浓度范围对细胞无明显毒性,因此采用质量浓度不超过200 μg/mL的水蔓菁总黄酮进行后续试验。
图1 细胞存活率

##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。

Fig.1 Cell survival rate

## indicates extremely significant difference compared with blank control group (P<0.01).

2.2 水蔓菁总黄酮对细胞吞噬能力的影响

由图2可知,与空白对照组相比,LPS和不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均能极显著增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力(P<0.01);与LPS组相比,不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均能显著或极显著增强LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力(P<0.05或P<0.01),并且随着水蔓菁总黄酮质量浓度的增加,细胞的吞噬能力不断增强。
图2 细胞吞噬能力

##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);*表示与LPS组相比差异显著(P<0.05),**表示与LPS组相比差异极显著(P<0.01)。

Fig.2 Cell phagocytosis capacity

## indicates extremely significant difference compared with blank control group (P<0.01); * indicates significant difference compared with LPS group (P<0.05), and ** indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01).

2.3 水蔓菁总黄酮对NO生成量的影响

由表1可知,在空白对照组的正常小鼠巨噬细胞RAW264.7中,NO生成量较低,经过LPS诱导后,LPS组的小鼠巨噬细胞RAW264.7中产生了大量NO,NO的生成量较空白对照组极显著增加(P<0.01),表明体外炎症反应细胞模型建模成功。与LPS组相比,不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均能显著或极显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中NO的生成量(P<0.05或P<0.01),并且随着水蔓菁总黄酮质量浓度的升高,抑制NO生成作用不断增强。
表1 水蔓菁总黄酮对NO、炎症因子、iNOS和COX-2生成量的影响

Table 1 Effects of total flavonoids from Veronica linariifolia on production of NO, inflammatory factors, iNOS and COX-2

项目
Items		 空白对照组
Blank control
group		 LPS组
LPS group		 LPS+总黄酮组 LPS+total flavonoids groups
10 μg/mL 20 μg/mL 40 μg/mL 80 μg/mL
NO/(μmol/mL) 6.52±0.84 72.33±1.32## 64.47±1.70* 57.17±1.51** 46.13±1.36** 32.47±2.24**
IL-1β/(ng/L) 101.70±2.95 507.57±4.10## 478.80±4.88* 448.37±5.77** 346.63±7.69** 228.03±5.85**
IL-6/(ng/L) 41.73±1.89 252.97±3.03## 233.43±4.48* 196.50±3.35** 142.37±3.68** 79.93±4.28**
TNF-α/(ng/L) 129.18±5.19 2 956.91±18.41## 2 777.99±18.56** 2 526.10±36.34** 2 027.56±42.16** 1 351.86±34.14**
PGE2/(ng/L) 74.80±2.33 409.38±5.17## 360.45±9.55** 314.33±7.52** 256.89±11.59** 173.92±6.41**
iNOS/(ng/L) 65.28±3.25 900.26±9.72## 815.46±11.46* 669.43±17.25** 565.25±19.89** 426.06±23.24**
COX-2/(ng/L) 151.58±7.25 1 727.39±13.32## 1 539.47±19.53** 1 331.21±27.00** 1 098.20±56.42** 875.78±16.55**

NO:一氧化氮 nitric oxide;IL-1β:白细胞介素-1β interleukin-1β;IL-6:白细胞介素-6 interleukin-6;TNF-α:肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-α;PGE2:前列腺素E2 prostaglandin E2;iNOS:诱导型一氧化氮合酶 inducible nitric oxide synthase;COX-2:环氧合酶-2 cyclooxygenase-2。

LPS组数据标注##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);LPS+总黄酮组数据标注*表示与LPS组相比差异显著(P<0.05),**表示与LPS组相比差异极显著(P<0.01)。下表同。

Data shoulder of LPS group with ## indicates the extremely significant difference compared with the blank control group (P<0.01); data shoulder of LPS+total flavonoids groups with * indicates significant difference compared with LPS group (P<0.05), and with ** indicates the extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01). The same as below.

2.4 水蔓菁总黄酮对炎症因子生成量的影响

由表1可知,经LPS诱导后,LPS组的小鼠巨噬细胞RAW264.7中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2的生成量较空白对照组极显著增加(P<0.01),表明体外炎症反应细胞模型建模成功。与LPS组相比,不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均可显著或极显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2的生成量(P<0.05或P<0.01),并且随着水蔓菁总黄酮质量浓度的升高,抑制炎症因子生成作用不断增强。

2.5 水蔓菁总黄酮对iNOS和COX-2生成量的影响

由表1可知,经LPS诱导后,LPS组的小鼠巨噬细胞RAW264.7中iNOS和COX-2的生成量较空白对照组极显著增加(P<0.01)。与LPS组相比,不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均可显著或极显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中iNOS和COX-2的生成量(P<0.05或P<0.01),并且随着水蔓菁总黄酮质量浓度的升高,抑制iNOS和COX-2生成作用不断增强。

2.6 水蔓菁总黄酮对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

由图3、表2可知,经LPS诱导后,LPS组的小鼠巨噬细胞RAW264.7中p-NF-κB p65和p-IκBα的蛋白表达量明显升高,IκBα蛋白表达量明显降低,与空白对照组比较均差异极显著(P<0.01);与LPS组相比,不同质量浓度的水蔓菁总黄酮均可显著或极显著抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7中p-NF-κB p65和p-IκBα的蛋白表达量(P<0.05或P<0.01),同时显著或极显著增强IκBα的蛋白表达量(P<0.05或P<0.01)。
图3 IκBα、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白电泳图

Fig.3 Electrophoretogram of IκBα, p-NF-κB p65 and p-IκBα proteins

表2 水蔓菁总黄酮对IκBα、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达量的影响

Table 2 Effects of total flavonoids from Veronica linariifolia on protein expression levels of IκBα, p-NF-κB p65 and p-IκBα

项目
Items		 空白对照组
Blank control
group		 LPS组
LPS group		 LPS+总黄酮组 LPS+total flavonoids groups
10 μg/mL 20 μg/mL 40 μg/mL 80 μg/mL
IκBα 0.135±0.002 0.044±0.003## 0.059±0.003* 0.065±0.002** 0.097±0.004** 0.123±0.005**
p-NF-κB p65 0.084±0.001 0.972±0.006## 0.948±0.004* 0.722±0.006** 0.575±0.007** 0.347±0.005**
p-IκBα 0.118±0.003 0.277±0.004## 0.256±0.003* 0.227±0.004** 0.174±0.004** 0.134±0.005**

IκBα:核因子-κB抑制蛋白α inhibitor α of nuclear factor-κB;p-NF-κB p65:磷酸化核因子-κB p65 phosphorylated nuclear factor-κB p65;p-IκBα:磷酸化核因子-κB抑制蛋白α phosphorylated inhibitor α of nuclear factor-κB。

3 讨论

长期的慢性炎症和过度的炎症反应将对机体造成损伤甚至引起疾病[21-22]。研究发现,炎症与心血管疾病、类风湿关节炎、癌症等疾病的产生和恶化有关[23]。因此,有效安全的控制炎症反应,对于多种疾病的治疗具有促进作用。在炎症反应的试验研究中,小鼠巨噬细胞RAW264.7是一种普遍采用的体外炎症反应细胞模型。LPS可激活巨噬细胞,刺激细胞产生炎症因子和炎症介质,这些炎症物质相互作用与影响,在炎症反应中发挥重要的调节作用[24],检测炎症物质的产生量已成为评价炎症程度的必要指标。

3.1 水蔓菁总黄酮对细胞吞噬能力的影响

巨噬细胞不仅参与炎症反应,而且通过吞噬功能在免疫应答中产生重要作用。炎症中白细胞的正常凋亡与炎症后期的炎症反应的清除有关,巨噬细胞可吞噬白细胞凋亡后的细胞碎片,增强巨噬细胞的吞噬能力,加速炎症反应的消除[25]。黄秋菊等[26]研究表明,ZLJ-601抗炎活性的机制之一是能增强巨噬细胞的吞噬功能。付依依等[19]对大果沙棘黄酮的抗炎活性研究表明,大果沙棘黄酮能显著提高LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力。王海燕等[27]对黑松露多糖的抗炎活性研究表明,黑松露多糖能显著增强巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力。本试验发现,随着水蔓菁总黄酮质量浓度的升高,小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力不断增强,提示水蔓菁总黄酮的抗炎作用可能与细胞吞噬能力的增强有关,有待更深入的研究。

3.2 水蔓菁总黄酮对NO生成量的影响

巨噬细胞RAW264.7在LPS刺激可以生成NO[28]。NO参与炎症反应和细胞免疫,是细胞间传递信息的调节因子之一。发生炎症反应时,将增加细胞合成与释放NO的水平,高水平的NO具有细胞毒性作用,因此抑制过量的NO生成对减少炎症反应给机体的损伤有重要意义[29-30]。研究发现,芦蒿总黄酮、苦竹枝总黄酮、柴胡总黄酮均对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7释放的NO具有抑制作用[16,18,31]。
在LPS刺激下,巨噬细胞能够大量表达iNOS,产生大量NO,过量的NO会诱导其他炎症物质的表达,进一步导致炎症反应程度的加剧,因此降低NO生成量是缓解炎症的有效途径[32]。本研究表明,随着水蔓菁总黄酮质量浓度的升高,抑制NO生成作用不断增强。

3.3 水蔓菁总黄酮对炎症因子生成量的影响

IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2是巨噬细胞生成的主要炎症因子。高浓度炎症因子的持续作用是诱发机体炎症的重要因素,因此检测各类炎症因子的生成量是衡量炎症程度的必要方法。研究发现,通过LPS刺激巨噬细胞RAW264.7,柴胡总黄酮能抑制巨噬细胞释放IL-6和TNF-α[31],黄芪总黄酮能抑制巨噬细胞生成过量的IL-1β、IL-6、TNF-α[15],油茶枯黄酮类化合物和黑籽南瓜黄酮类化合物对PGE2的生成具有抑制作用[33-34]。
IL-1β是初期产生的炎症因子,可以提高免疫细胞的杀伤作用,调节免疫功能和诱发炎症反应。IL-6有致炎和抗炎作用,是多重功能细胞炎症因子,机体中正常水平的IL-6可以产生有益作用,但IL-6水平过高能导致机体发生炎症反应,并增加炎症介质的生成。TNF-α是炎症早期主要通过巨噬细胞产生的炎症因子,具有促进炎症产生与发展的作用,也具有细胞间传递信息的作用。发生炎症反应时,将增加细胞合成与释放TNF-α的水平,高水平的TNF-α能诱导其他炎症因子的产生,同时加重炎症反应[35]。TNF-α已成为预防与治疗炎症反应的靶向物质。PGE2可提高血管渗透性,增强组织细胞分泌炎症因子的能力,从而诱导炎症反应,而且PGE2可与NO协同产生致炎作用,增强炎症反应。本研究中,小鼠巨噬细胞RAW264.7经LPS诱导后,IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的生成量极显著增加,表明细胞内存在严重的炎症反应;当细胞经水蔓菁总黄酮作用后,以上炎症因子的生成量显著或极显著降低,表明水蔓菁总黄酮能够抑制LPS诱导的巨噬细胞产生的炎症反应。

3.4 水蔓菁总黄酮对iNOS和COX-2生成量的影响

iNOS可催化L-精氨酸生成NO,COX-2能催化花生四烯酸生成PG E 2 [36-37]。正常情况下iNOS和COX-2生成量较低。炎症状态时,巨噬细胞在LPS刺激下能够过量生成iNOS和COX-2,进而生成大量的NO和PGE2。NO和PGE2协同作用,进一步加剧机体的炎症反应。目前,治疗炎症类疾病的重点之一是研究能够抑制iNOS和COX-2过量生成的药物。油茶枯黄酮类化合物、甘草总黄酮均能抑制iNOS和COX-2的表达[33,38]。本试验结果表明,水蔓菁总黄酮可以抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中iNOS和COX-2的生成量,从而抑制NO和PGE2的生成,这与NO和PGE2生成量的试验结果相一致。

3.5 水蔓菁总黄酮对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

NF-κB信号通路具有抗炎活性物质的重要靶点。在炎症反应中,NF-κB是重要的转录因子[39],具有调节iNOS和COX-2的作用[40]。静息状态的巨噬细胞中,NF-κB与其抑制物IκBα结合,当细胞受到诱导刺激后,IκBα被磷酸化降解,NF-κB进入细胞核,激活的p65与DNA结合,从而激活靶位点的炎症基因,促进TNF-α、IL-6等炎症因子生成[41-42]。研究发现,黄酮类化合物能抑制LPS诱导的NF-κB靶基因的表达,从而发挥抗炎活性[17]。黄芪总黄酮抑制NF-κB信号通路的过度激活,从而抑制LPS刺激下IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的过度释放[15]。焦兵等[33]研究了油茶枯黄酮类化合物的抗炎活性,发现油茶枯黄酮类化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中的NF-κB活性具有抑制作用。王翠芳等[43]研究发现,沙葱总黄酮水洗组分的抗炎活性可能与NF-κB信号通路有关。本研究中,Western blot结果显示,对LPS诱导的p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白的表达,水蔓菁总黄酮表现出明显的抑制作用,并能显著或极显著增加IκBα蛋白的表达。结合水蔓菁总黄酮能抑制细胞内iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α的生成,可知调控NF-κB信号通路是水蔓菁总黄酮发挥抗炎作用的机制之一。

4 结论

综上所述,水蔓菁总黄酮能增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能,并能够通过抑制细胞内iNOS、COX-2、NO和主要炎症因子的生成以及调控NF-κB信号通路来发挥体外抗炎活性。

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