动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 7: 4638 - 4653

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.398

研究论文

绵羊脂肪细胞去分化和诱导再分化特性及关键基因表达规律研究

  • 张伟 , 1 ,
  • 郭庆河 1 ,
  • 崔炳灿 1 ,
  • 高莉 1 ,
  • 宁程程 1 ,
  • 牛嘉 2 ,
  • 王世银 , 1, * ,
  • 吕刚 , 1, 3, *
展开
  • 1 新疆农业职业技术学院,农业农村部西北畜禽健康养殖技术重点实验室,昌吉 831100
  • 2 中国农业科学院西部农业研究中心,昌吉 831100
  • 3 新疆泰昆集团有限责任公司,昌吉 831100
*王世银,副教授,E-mail: ;
吕刚,E-mail:

张伟(1978—),男,甘肃武威人,教授,博士,主要从事草食家畜功能基因及遗传改良相关研究。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-01-13

  网络出版日期: 2024-07-09

基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金杰出青年科学基金项目(2022D01E18)

新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2022D01A92)

新疆维吾尔自治区现代农业羊产业技术体系

收起

A Study of Characteristics and Key Genes Expression Patterns of Sheep Adipocytes in Dedifferentiation and Induced Redifferentiation State

  • ZHANG Wei , 1 ,
  • GUO Qinghe 1 ,
  • CUI Bingcan 1 ,
  • GAO Li 1 ,
  • NING Chengcheng 1 ,
  • NIU Jia 2 ,
  • WANG Shiyin , 1, * ,
  • LYU Gang , 1, 3, *
Expand
  • 1 Key Laboratory of Livestock and Poultry Healthy Breeding Technology in Northwest China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Xinjiang Agricultural Vocational Technical College, Changji 831100, China
  • 2 Western Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Changji 831100, China
  • 3 Xinjiang Taikun Group Co., Ltd., Changji 831100, China
*WANG Shiyin, associate professor, E-mail: ;
LYU Gang, E-mail:

Received date: 2024-01-13

  Online published: 2024-07-09

Fold

摘要

本试验旨在初步探究绵羊脂肪细胞去分化机制和诱导再分化能力差异。分别使用经优化的“天花板”培养法研究不同月龄和组织来源脂肪细胞去分化能力,及去分化过程中细胞形态和关键基因的表达,并对不同组织来源去分化脂肪(DFAT)细胞诱导成脂分化能力进行比较。结果表明:若不使用不同孔径的细胞筛筛选脂肪细胞大小,不同月龄相同来源的脂肪细胞完成去分化的时间无显著差异(P>0.05);相同月龄绵羊的尾部脂肪细胞和肾周脂肪细胞完成去分化的时间无显著差异(P>0.05),但均极显著长于肌内脂肪细胞(P<0.01)。若将脂肪细胞筛选为不同大小的细胞组,则不论是尾部脂肪细胞还是肌内脂肪细胞,直径<300目细胞筛孔径的细胞完成去分化的时间均极显著短于直径>300目细胞筛孔径的细胞(P<0.01),直径>200目细胞筛孔径的尾部脂肪细胞完成去分化的时间又极显著长于直径200~300目细胞筛孔径的细胞(P<0.01),证明脂肪细胞完成去分化的时间与其细胞大小有关,而与其来源无明显相关性。脂肪细胞启动去分化后,细胞中的大脂滴逐步裂解为小脂滴,调控脂质合成和分解的基因均出现极显著上调(P<0.01),同时在细胞培养基中检测到甘油三酯含量出现极显著上升(P<0.01),而游离脂肪酸的含量虽有显著上升(P<0.05),但在整个去分化过程中基本保持稳定,推断脂肪细胞在去分化过程中主要通过直接排出脂滴完成细胞中脂质的清除。随着脂肪细胞的去分化,脂肪细胞祖细胞和前体脂肪细胞标志基因以及干细胞标志基因均出现极显著上调(P<0.01),说明脂肪细胞逆转了细胞命运决定而重新获得了干细胞特性。不同组织来源的DFAT细胞诱导成脂分化能力无显著差异(P>0.05)。综上所述,绵羊脂肪细胞大小与其去分化能力极显著相关,但与其组织来源和年龄无明显相关性。DFAT细胞主要通过排出脂滴完成细胞内脂质的清除并获得干细胞特性,但DFAT细胞诱导成脂分化能力不受其组织来源的影响。

关键词： 绵羊; 脂肪细胞; 脂质; 脂滴; 去分化; DFAT; 诱导分化

本文引用格式

张伟 , 郭庆河 , 崔炳灿 , 高莉 , 宁程程 , 牛嘉 , 王世银 , 吕刚 . 绵羊脂肪细胞去分化和诱导再分化特性及关键基因表达规律研究[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(7) : 4638 -4653 . DOI: 10.12418/CJAN2024.398

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the differences in dedifferentiation mechanisms and induction redifferentiation abilities of sheep adipocytes. The optimized ‘ceiling' culture method was utilized to examine the dedifferentiation ability of adipocytes derived from different months of age and tissue sources, as well as the cell morphology and expression of key genes during dedifferentiation. Additionally, the induced lipogenic redifferentiation ability of dedifferentiated fat (DFAT) cells from different tissue sources were compared. The results showed as follows: if adipocytes were not screened using cell screens with different mesh sizes, there were no significant differences in the dedifferentiation time among adipocytes originating from same tissue but different months of age (P>0.05); there were no significant differences in dedifferentiation time between tail adipocytes and perirenal adipocytes within the same month of age (P>0.05), but both significantly longer than intramuscular adipocytes (P<0.01). If adipocytes were screened into cell groups of different sizes, the dedifferentiation time for both tail adipocytes and intramuscular adipocytes with a diameter less than 300 mesh cell sieve apertures was significantly shorter than that with a diameter greater than 300 mesh cell sieve apertures (P<0.01), the dedifferentiation time for tail adipocytes with a diameter larger than 200 mesh cell sieve apertures was significantly longer than that with diameters ranging between 200 and 300 mesh cell sieve apertures (P<0.01). So, it was confirmed that the time of adipocyte dedifferentiation was related to their size rather than their tissue source. After the dedifferentiation of adipocytes, large lipid droplets in cells gradually fragmented into smaller ones, accompanied by significant upregulation of genes related to lipid synthesis and decomposition processes (P<0.01), and significant increase in triglyceride content detected in the cell medium (P<0.01), while the free fatty acid content also showed a significant increase but keep stable throughout all stages of dedifferentiation (P<0.05), so it was inferred that during the cell dedifferentiation, adipocytes may primarily eliminate lipids from cells by directly expelling lipid droplets. With the dedifferentiation of adipocytes, the expression of marker genes for adipocyte progenitor cells and preadipocytes, as well as stem cell marker genes were significantly upregulated (P<0.01), which indicated that adipocytes reversed their cellular fate determination and regained stem cell characteristics. The induced lipogenic redifferentiation ability of DFAT cells from different tissue sources showed no significant difference (P>0.05). In conclusion, the dedifferentiation capacity of sheep adipocytes is strongly correlated with their cell size but not with tissue source and age. Adipocyte dedifferentiation mainly involves clearing intracellular lipids by expelling lipid droplets and acquiring stem cell characteristics, however, the ability of DFAT cells to induce lipogenic redifferentiation is not influenced by their tissue source.

Key words： sheep; adipocyte; lipid; lipid droplet; dedifferentiation; DFAT; induced redifferentiation

在畜牧生产中,家畜皮下、内脏和肌内脂肪的沉积量与胴体品质密切相关。近年来,人们的健康意识逐渐增强,由于高脂肪含量的肉食品摄入而导致的肥胖及各类心脑血管疾病已日益引起社会的关注,消费者大都偏向于食用低脂肪含量的肉食品。所以,降低家畜皮下和内脏脂肪的沉积量是当前肉用家畜育种的重要方向。同时,由于适量肌内脂肪的沉积可大大提高肉的多汁性和口感,所以如何在降低畜体皮下和内脏脂肪沉积量的同时,使肌内脂肪适量沉积,也是畜牧科技工作者亟待解决的问题。
脂肪沉积依赖于脂肪细胞数量和体积的增加。脂肪细胞由脂肪组织中的前体脂肪细胞发育而来[1],所以建立高效的前体脂肪细胞分离培养体系,并深入研究其生物学特征,对阐明家畜脂肪沉积分子调控机制,进而更为精准地控制不同部位的脂肪沉积量至关重要。目前常用胶原酶消化法从脂肪组织中分离培养前体脂肪细胞[2],但由于脂肪组织中含有多种细胞,该方法获得的前体脂肪细胞很容易被成纤维细胞、血管内皮细胞等增殖能力强的细胞污染。如果要分离高纯度前体脂肪细胞,需要借助流式细胞仪进行分选,技术路线比较复杂。另外,由于前体脂肪细胞在脂肪组织中数量较少,在骨骼肌中数量更少,且随着动物年龄的增长,前体脂肪细胞会发育为成熟脂肪细胞,进而导致其数量进一步减少。所以,该方法适合从幼龄动物脂肪组织中分离前体脂肪细胞,从成年动物脂肪组织和骨骼肌中分离前体脂肪细胞效率很低。有研究表明,在体内和体外条件下,成熟脂肪细胞均可以发生去分化,进而转变为去分化脂肪(dedifferentiated fat,DFAT)细胞,且DFAT细胞具有和前体脂肪细胞相似的分子特征和分化潜力[3-4],并以此为基础开发了一种称之为“天花板”培养法的DFAT细胞培养体系[5]。该方法利用成熟脂肪细胞较轻、在充满培养液的倒置细胞培养瓶中可以通过上浮而与培养面接触,进而逐步完成贴壁,待其牢固贴壁生长后,即可正置细胞培养瓶,继续进行常规培养直至其完成去分化生长,转变为DFAT细胞。“天花板”培养法可以利用成年动物成熟脂肪细胞获得DFAT细胞,细胞来源丰富。同时,当培养瓶倒置时,脂肪细胞上浮而其他细胞会下沉,可有效避免脂肪细胞被其他细胞污染,能够获得大量高纯度DFAT细胞,且技术路线简单。
近年来,国内外学者已针对人[6]、猪[7]和牛[8]等家畜建立了基于“天花板”培养法的DFAT细胞培养体系,并对DFAT细胞的细胞特性、分化潜力及相关基因表达开展了深入研究,大大促进了脂肪细胞发育相关的研究,也为组织工程学提供了丰富的种子细胞来源。但目前采用的“天花板”培养法由于需要将培养液充满培养瓶,若要开展多组对照培养试验,培养液和胎牛血清(FBS)的使用量很大,且由于培养瓶在培养期间是严格密封的,难以对不同去分化阶段的脂肪细胞开展诸如免疫荧光、原位杂交等试验分析。另外,目前绵羊脂肪细胞去分化培养体系尚未建立,其脂肪细胞去分化的分子调控机制尚未见报道。
基于此,本研究以脂肪沉积能力极强的新疆优良地方绵羊品种阿勒泰羊为研究对象,建立改良的“天花板”培养体系,并进一步研究不同年龄阶段、不同来源脂肪细胞去分化和诱导再分化能力的差异,以及该过程中关键基因的表达情况,以期为阐明绵羊不同部位脂肪沉积调控机制,进而培育胴体品质和羊肉口感俱佳的肉羊新品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物及样品采集

分别选择6、12、18和24月龄阿勒泰羊公羊各3只,屠宰后迅速采集尾部脂肪、肾周脂肪和背最长肌各约10 g,灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次后置于含1%双抗的PBS中,在4 ℃下于1 h内运送至实验室备用。

1.1.2 主要试剂

Ⅰ型胶原酶(Sigma公司,美国)、FBS(Gibco公司,美国)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco公司,美国)、胰酶(Gibco公司,美国)、双抗(北京索莱宝科技有限公司)、PBS(北京索莱宝科技有限公司)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma公司,美国)、地塞米松(DEX,北京索莱宝科技有限公司)、牛胰岛素(北京索莱宝科技有限公司)、油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、细胞筛网(北京索莱宝科技有限公司)、TRIzol(Thermo Fisher公司,美国)、去基因组反转录试剂盒(TaKaRa公司,日本),TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司,日本)、甘油三酯测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、游离脂肪酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1 绵羊脂肪细胞去分化的“天花板”培养体系建立

取2 g脂肪和背最长肌组织,用75%酒精浸泡30 s后立刻放入含有双抗的PBS中,超净工作台内用含1%双抗的PBS冲洗3次,直至PBS变清亮。剔除可见血管和结缔组织,剪成0.5~1.0 mm的小块,转移至50 mL无菌玻璃锥形瓶内,加入0.1%的Ⅰ型胶原酶(组织体积∶Ⅰ型胶原酶体积=1∶5),透气封口膜封口,在37 ℃恒温水浴锅内消化1 h,期间每间隔5 min轻柔混匀1次,以使组织和Ⅰ型胶原酶充分接触,提高消化效率。消化液经100和200目细胞筛过滤,滤液2 500 r/min离心5 min。成熟脂肪细胞中由于充满脂质,细胞由于较轻而漂浮在消化液的表面,未消化的组织和其他细胞则被离心至管底,从而达到初步分离脂肪细胞的目的。
15 mL无菌离心管中加入10 mL预热至37 ℃的细胞培养基(99% DMEM+1%双抗),小心吸取漂浮于表层的脂肪细胞转入离心管中,使用移液器缓慢吹打、洗涤细胞,然后2 500 r/min离心5 min。重复洗涤3次,确保尽可能去除非脂肪细胞,以免影响后续试验。整个洗涤、离心期间,应保持细胞培养基温度在30 ℃以上,可使脂肪细胞处于分散状态,进而减少细胞与离心管壁的黏附损失,改善洗涤效果。
将清洗后的脂肪细胞移入15 mL无菌离心管中,加入10 mL完全细胞培养基(79% DMEM+20% FBS+1%双抗),置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养24 h,使可能引入培养体系的微量非脂肪细胞下沉至离心管底,进一步提高脂肪细胞纯度。
6孔板中加入10 mL完全细胞培养基,小心放入一张直径为24 mm的细胞爬片,使其借助液体表面张力漂浮在细胞培养基表面,然后吸取约4×104个成熟脂肪细胞,将吸头通过6孔板壁与细胞爬片的间隙伸入细胞爬片下表面,然后缓慢注入细胞,使接种的脂肪细胞在浮力和细胞爬片吸附力的作用下均匀分散在细胞爬片下表面。轻轻盖上6孔板盖,置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养2 d。去分化培养前2 d不观察细胞,以免由于培养板晃动而干扰脂肪细胞贴壁。静置培养至3 d时,观察1次细胞形态,操作时应小心平稳移动细胞培养板,以免剧烈晃动导致细胞爬片下沉。静置培养至5 d时,将细胞爬片取出,翻转后原底面向上放入另一个新的6孔板中,然后加入4 mL完全细胞培养基进行正常培养,之后每2 d换液1次,使脂肪细胞去分化为具有成纤维细胞形态的DFAT细胞,待细胞生长至约80%融合时进行常规传代培养。

1.2.2 不同月龄和组织来源脂肪细胞去分化能力差异性研究

分别取6、12、18和24月龄阿勒泰羊的尾部脂肪、肾周脂肪和背最长肌组织各约2 g,采用1.2.1中的方法分离脂肪细胞并进行去分化培养。从第3天开始,每隔6 h观察记录1次细胞形态。每次观察时,在100×的放大倍数下,随机选择5个视野,统计视野中完成去分化的脂肪细胞占视野中细胞总数的比例,直至90%的脂肪细胞完成去分化,并分别统计90%的脂肪细胞完成去分化所需要的时间。通过分析相同月龄不同来源以及不同月龄相同来源脂肪细胞90%完成去分化所需要的时间,研究月龄和脂肪细胞来源对脂肪细胞去分化能力的影响。

1.2.3 不同大小和来源脂肪细胞去分化能力差异性研究

取12月龄阿勒泰羊的尾部脂肪和背最长肌组织各约2 g,采用1.2.1中的方法分离脂肪细胞。将在60 mm培养皿中经过37 ℃、5% CO2培养24 h的脂肪细胞连续过200、300、400和500目的细胞筛,分别收集200、300、400和500目细胞筛网上的脂肪细胞,以及500目细胞筛过滤后滤液中的脂肪细胞。由于细胞筛网目数越高孔径越小,滤过的脂肪细胞亦越小,所以通过这种方法即可获得不同大小的脂肪细胞。分别将上述脂肪细胞进行去分化培养,采用上述研究脂肪细胞去分化能力差异的方法,分别统计90%的脂肪细胞完成去分化所需要的时间,以比较不同大小和来源脂肪细胞去分化能力差异。

1.2.4 脂肪细胞不同去分化时期关键基因表达规律研究

取12月龄阿勒泰羊的尾部脂肪组织约2 g,采用1.2.1中的方法分离脂肪细胞并进行去分化培养。分别在去分化培养的0、2、3、4、5、6、8、10、12、14和16 d消化细胞,TRIzol法提取总RNA,反转录合成cDNA,以18S为内参,0 d的表达量为对照,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对前体脂肪细胞、干细胞标志性基因以及脂质合成和分解关键基因表达量进行相对定量,以分析脂肪细胞去分化过程中细胞清除脂质的机制,并确定去分化的脂肪细胞是否具有前体脂肪细胞和干细胞特性。同时收集去分化培养的0、2、3、4、5、6、8、10、12、14和16 d的细胞培养基,分别使用甘油三酯测定试剂盒和游离脂肪酸测定试剂盒测定细胞培养基中甘油三酯和游离脂肪酸含量,测定方法参照试剂盒说明书。
RT-qPCR引物使用Oligo 6软件设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息见表1。RT-qPCR扩增采用20 μL体系,即TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 8 μL,cDNA 1 μL。退火温度为60 ℃的引物采用两步法RT-qPCR扩增,退火温度为55 ℃的引物采用三步法RT-qPCR扩增。两步法RT-qPCR扩增程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸20 s,共40个循环;每个循环60 ℃延伸结束后采集荧光信号。三步法RT-qPCR扩增程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,共40个循环;每个循环72 ℃延伸结束后采集荧光信号。熔解曲线分析程序:95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,然后95 ℃变性并持续收集荧光信号。
表1 RT-qPCR引物信息

Table 1 RT-qPCR primer information

基因
Genes		 GenBank登录号
GenBank accession
number		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 产物大小
Product size/bp		 退火温度
Tm/℃
ADIPOQ NM_001308565 F:CTTCCACACTGACCGAAGTC
R:TGGTGTCCTGGCCATAACTG		 114 60
C/EBPα NM_001308574 F:CATCTGCGAACACGAGACG
R:GGCTGTGTTGGAACAGGTC		 95 60
FABP4 NM_001114667 F:CTGGAAACTTGTCTCCAGTG
R:GACCACATCCCCATTTACAC		 127 55
FSP27 NM_001306115 F:TAAGTCCCTCTCCAGGTACA
R:CAGCAGTGGTTACTCTACAG		 113 60
LPL NM_001009394 F:AAGACACAGCTGAGGACACT
R:TTGGCACCCAACTCTCATAC		 141 55
PPARγ XM_015102095 F:CTCCAAGAGTACCAAAGTGC
R:GAGTTGGAAGGCTCTTCATG		 104 60
STAT1 NM_001166203 F:AATGCTTGCCTGGATCAGCT
R:TGGGGTCATGTTCATAGGTG		 124 60
Leptin XM_027968780.2 F:CGCAAGGTCCAGGATGACAC
R:TTTGGAGGAGACGGACTGCG		 90 60
HSL NM_001128154 F:CTGCGGGAAGGACAGAACAG
R:AAGCCACCACCGTGGATGTG		 137 60
ATGL NM_001308576 F:AAAGAGGAGCTTATCCAGGC
R:ACCGTGATGGTGTTCTTGAG		 149 60
DPP4 XM_042243804 F:TCAGTGGGTCATAAGTTGGC
R:AGTCCATGTGATCCTCTGAC		 90 55
PDGFRα NM_001192345 F:GTCACCATTTCTGTTCACGAG
R:CTTGACTTCATGCAGGTTGAC		 87 60
TGFβ NM_001009400 F:ACCAACTACTGCTTCAGCTC
R:CTTGGGTTCGTGAATCCACT		 102 60
Wnt10 XM_004023070 F:CCATCCTCAAGCGCGGTTTC
R:GTCGATCCTGCTCACCACTG		 147 60
CD142 XM_027972225 F:AGACGTATTTGGCGAGGGTC
R:GGCTGTCCAAGGTTTGTCTC		 118 55
ICAM1 NM_001009731 F:GCAGCGTGACCATGTATAGC
R:TGAGACTCCGTTCAGCCTCA		 131 60
c-Myc NM_001009426 F:TCTGCTCTCCTCTGCTGAGT
R:CTTGTTCTTCCTCAGAGTCG		 104 55
Nanog NM_001025344 F:ACCTCAGCTACAAGCAGGTG
R:CATTGCTATTCCTCGGCCAG		 130 60
Sox2 NM_001318074 F:CGCCCTGCAGTACAACTCTA
R:GGGTGCCCTGCTGAGAATAG		 89 60
Oct3/4 XM_004018968 F:TTTGAGGCTTTGCAGCTCAG
R:GTCTCTGCCTTGCATATCTC		 116 55
BMP4 XM_042251941 F:GCTTCCACCACGAAGAACAT
R:TCACCTCATTCTCTGGGATG		 102 55
Lox XM_015095952.3 F:CGGCTACTTCCAGTATGGTC
R:CAGCGCATCTCAGGTTGTAC		 104 60
Yap1 NM_001267881.3 F:TTAACAGTGGCACCTATCAC
R:TTGGTTGATAGTGTCACCTG		 137 60
Col1a1 XM_027974705.2 F:TGGCAAGAACGGAGATGATG
R:CCAAACCACTGAAACCTCTG		 143 60
18S KY129860.1 F:AGTGAAACTGCGAATGGCTC
R:CGTCGGCATGTATTAGCTCT		 105 55/60

ADIPOQ:脂联蛋白C1Q和胶原结构区域 adiponectin C1Q and collagen domain containing;C/EBPα:CCAAT/增强子结合蛋白α CCAAT/enhancer-binding protein alpha;FABP4:脂肪酸结合蛋白4 fatty acid binding protein 4;FSP27:脂肪特异性蛋白27 fat-specific protein of 27;LPL:脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase;PPARγ:过氧化物酶体增殖物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor gamma;STAT1:信号传导及转录激活蛋白1 signal transducer and activator of transcription 1;Leptin:瘦素 leptin;HSL:激素敏感脂酶 hormone sensitive triglyceride lipase;ATGL:脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase;DPP4:二肽基肽酶4 dipeptidyl peptidase 4;PDGFRα:血小板源性生长因子受体α platelet derived growth factor receptor alpha;TGFβ:转化生长因子β transforming growth factor beta;ICAM1:细胞黏附分子1 intercellular adhesion molecule 1;Sox2:Y染色体性别决定区域盒2 sex determining region Y box 2;Oct3/4:八聚体结合转录因子3/4 octamer-binding transcription factor 3/4;BMP4:骨形态发生蛋白4 bone morphogenetic protein 4;Lox:赖氨酸氧化酶 lysine oxidase;Yap1:Yes关联蛋白1 Yes-associated protein 1;Col1a1:α1-1型胶原基因 collagen type I alpha 1。图4和图5同 the same as Fig.4 and Fig.5.

1.2.5 不同来源DFAT细胞诱导成脂分化差异研究

取12月龄阿勒泰羊的尾部脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪细胞的DFAT细胞,以1×106的细胞密度接种于6孔板中,加入完全培养基(89% DMEM+10% FBS+1%双抗),置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至70%~80%融合,更换为成脂分化诱导培养基(89% DMEM+10% FBS+1%双抗+250 μmol/L IBMX+500 μmol/L DEX+8 μmol/L胰岛素)培养,每2 d换液1次,分别在诱导分化的0、2、4、6、8、10和12 d使用油红O染色法比较不同来源DFAT细胞的脂肪沉积量,以分析其成脂分化能力差异。油红O染色操作按照试剂盒说明进行,即移除细胞培养基,PBS清洗2次,加油红O固定液固定20~30 min,弃去固定液,PBS清洗2次,加入60%异丙醇浸洗20~30 s,弃去60%异丙醇后加入新配制好的油红O染色液,浸染10~20 min,弃去染色液,60%异丙醇漂洗20~30 s至间质清晰,蒸馏水清洗2~5次,确保无多余染液,加入Mayer苏木精染色液复染核1~2 min,弃去染色液后蒸馏水清洗2~5次,加入油红O缓冲液孵育1 min,弃去缓冲液后加入3 mL蒸馏水覆盖细胞,并在显微镜下观察拍照;拍照后弃去蒸馏水,每孔细胞加入1 mL异丙醇萃取油红O,测定510 nm处的吸光度(OD)值;萃取油红O后的细胞使用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA,通过测定260 nm处的OD值计算DNA含量,然后通过计算油红O OD510 nm/DNA OD260 nm比较诱导分化细胞脂肪沉积量。

1.3 数据分析

所有试验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。RT-qPCR试验使用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。使用SPSS 20.0软件包中one-way ANOVA程序对试验数据进行单因素方差分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 DFAT细胞形态变化

图1为改良“天花板”培养法示意图和实物图,细胞爬片在液体表面张力的作用下漂浮在细胞培养基的表面,供上浮的脂肪细胞贴壁。经Ⅰ型胶原酶消化、离心获得的脂肪细胞集中在离心管中细胞培养基的表层,可用移液器方便吸出,并接种至6孔板中进行去分化培养。
图1 改良“天花板”培养法分离培养DFAT细胞

A:改良“天花板”培养法分离培养DFAT细胞示意图,图示了6孔板的其中1个孔的情况;B:经离心分离后的脂肪细胞漂浮在培养基的表层;C:改良“天花板”培养法实物图,细胞爬片漂浮在培养基的表面形成“天花板”供上浮的脂肪细胞贴壁生长。

Fig.1 Optimized ‘ceiling' culture method for isolating DFAT cells

A: schematic diagram of the optimized ‘ceiling' culture method for isolating DFAT cells, showing the situation of one well in a 6-well plate; B: after centrifugal separation, the adipocytes float on the surface of the culture medium; C: physical image of the optimized ‘ceiling' culture method, cell climbing slices float on the surface of the culture medium and form a ‘ceiling' for the floating adipocytes to grow.

使用本研究建立的改良“天花板”培养法,系统地观察了脂肪细胞去分化期间的形态变化(图2)。球形脂肪细胞先是与培养面接触(图2-A);经过约3 d的培养后,部分脂肪细胞开始贴壁,细胞形态逐渐由球形转变为梭形或星形(图2-B);约7 d后贴壁脂肪细胞中的大脂滴开始逐渐裂解为小脂滴(图2-C);经过约13 d的连续培养,绝大部分脂肪细胞内的脂滴完全消失(图2-D);约16 d后细胞完成去分化(图2-E);至18 d左右完成去分化的脂肪细胞大量增殖,覆盖80%~90%的培养面(图2-F),即可进行传代培养。
图2 绵羊尾部脂肪细胞去分化为DFAT细胞的过程

A:去分化培养0 d细胞;B:去分化培养3 d细胞;C:去分化培养7 d细胞;D:去分化培养13 d细胞;E:去分化培养16 d细胞;F:去分化培养18 d细胞;刻度线表示100 μm。

Fig.2 Process of dedifferentiation of sheep tail adipocytes into DFAT cells

A: the adipocytes dedifferentiated for 0 d; B: the adipocytes dedifferentiated for 3 d; C: the adipocytes dedifferentiated for 7 d; D: the adipocytes dedifferentiated for 13 d; E: the adipocytes dedifferentiated for 16 d; F: the adipocytes dedifferentiated for 18 d; the scale line indicates 100 μm.

高倍镜下观察去分化的脂肪细胞(图3),可以看到大多脂肪细胞贴壁后呈梭形(图3-A~图3-F)或者星形(图3-G~图3-I)。细胞中的大脂滴会逐渐裂解为小脂滴,呈梭形的脂肪细胞一般是大脂滴首先一分为二,然后再逐步裂解为小脂滴;呈星形的脂肪细胞大脂滴一般是从细胞星形凸起处开始裂解为小脂滴。同时可以观察到,在脂肪细胞去分化过程中这些小脂滴似乎是被直接排出细胞外的。另外,在脂肪细胞去分化过程中,细胞贴壁生长和脂滴裂解是同步进行的(图3-C)。
图3 绵羊尾部脂肪细胞去分化过程中的主要形态变化

A~F:脂肪细胞呈梭形去分化;G~I:脂肪细胞呈星形去分化;C图为B图细胞的相差显微照片,显示了脂滴裂解的同时,脂肪细胞已开始贴壁,其余为明场显微照片,显示了大脂滴逐渐裂解为小脂滴的过程;刻度线表示20 μm。

Fig.3 The main morphologic change of sheep tail adipocytes during dedifferentiation

A to F: fusiform dedifferentiation adipocytes; G to I: starlike dedifferentiation adipocytes; the figure C is the phase contrast micrograph of figure B, which shows that the adipocytes have begun to adhere to the wall at the same time as the lipid droplet cleavage, the rest are bright field micrographs showing the gradual cleavage of large lipid droplets into smaller ones; the scale line indicates 20 μm.

2.2 月龄和来源对脂肪细胞去分化能力的影响

分别对6、12、18和24月龄阿勒泰羊的尾部脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪细胞进行去分化培养,以研究不同月龄和来源脂肪细胞去分化能力的差异。从表2可以看出,不同月龄相同来源的脂肪细胞,完成去分化的时间无显著差异(P>0.05);相同月龄绵羊的尾部脂肪细胞和肾周脂肪细胞完成去分化的时间无显著差异(P>0.05),但均极显著长于肌内脂肪细胞(P<0.01)。
表2 不同月龄和来源脂肪细胞完成去分化的时间

Table 2 Completion dedifferentiation time of adipocytes from different months of age and sources

月龄
Months of age		 90%细胞完成去分化所需时间
Time of 90% cells to complete dedifferentiation/h
尾部脂肪细胞
Tail adipocytes		 肾周脂肪细胞
Perirenal adipocytes		 肌内脂肪细胞
Intramuscular adipocytes
6 312±12A 311±6A 252±6B
12 315±6A 313±12A 251±6B
18 314±6A 315±6A 254±12B
24 316±6A 314±12A 251±6B

同行或同列数据,数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same line or column, the data with same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.3 脂肪细胞大小对其去分化能力的影响

在观察脂肪细胞去分化过程中细胞形态的变化时发现,不同来源脂肪细胞的大小存在明显差异,尾部脂肪细胞和肾周脂肪细胞的直径要远大于肌内脂肪细胞。即使是同一来源的脂肪细胞,其直径亦存在较大的差异。另外,直径小的脂肪细胞在去分化培养中均优先完成贴壁、脂滴裂解和去分化,而直径越大的脂肪细胞去分化的速度越慢。由此猜测:肌内脂肪细胞完成去分化的时间极显著短于尾部脂肪细胞和肾周脂肪细胞是否与其细胞直径小有关?
为了验证上述猜测,分别用不同孔径的细胞筛过滤、收集尾部脂肪细胞和肌内脂肪细胞,进而分别得到5组和4组不同大小的脂肪细胞。肌内脂肪细胞直径均<200目细胞筛孔径。分别对不同大小的脂肪细胞进行去分化培养。从表3可以看出,脂肪细胞完成去分化的时间与其大小直接相关,相同直径的尾部脂肪细胞和肌内脂肪细胞完成去分化的时间无显著差异(P>0.05)。同时,不论是尾部脂肪细胞还是肌内脂肪细胞,直径<300目细胞筛孔径的细胞完成去分化的时间均极显著短于直径>300目细胞筛孔径的细胞(P<0.01)。直径>200目细胞筛孔径的尾部脂肪细胞完成去分化的时间又极显著长于直径200~300目细胞筛孔径的细胞(P<0.01)。证明上述猜测成立,脂肪细胞完成去分化的时间与其大小有关,而与其来源无明显相关性。
表3 不同大小和来源脂肪细胞完成去分化的时间

Table 3 Completion dedifferentiation time of adipocytes from different sizes and tissues

细胞筛孔径
Cell sieve aperture/目		 90%细胞完成去分化所需时间
Time of 90% cells to complete dedifferentiation/h
尾部脂肪细胞
Tail adipocytes		 肌内脂肪细胞
Intramuscular adipocytes
<500 226±12C 223±12C
400~500 224±6C 221±6C
300~400 223±6C 224±12C
200~300 348±12B 342±6B
>200 414±6A

2.4 脂肪细胞不同去分化时期相关基因相对表达量的变化

尾部脂肪细胞去分化培养的0、2、3、4、5、6、8、10、12、14和16 d时,脂质合成和分解相关基因相对表达量的变化如图4所示。在整个脂肪细胞去分化过程中,脂质分解相关基因激素敏感脂酶(HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和瘦素(Leptin)相对表达量(图4-A~图4-C)以及脂质合成相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联蛋白C1Q和胶原结构区域(ADIPOQ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、脂肪特异性蛋白27(FSP27)、脂蛋白脂酶(LPL)相对表达量(图4-D~图4-I)均出现极显著上调(P<0.01),然后在脂肪细胞基本完成去分化后又出现极显著下调(P<0.01),且脂质合成相关基因上调幅度要普遍大于脂质分解相关基因。由此可推断,在脂肪细胞去分化过程中,脂解作用并不是清除细胞内脂质的主要途径。
图4 脂质分解相关基因和脂质合成相关基因相对表达量

A~C:脂质分解相关基因;D~I:脂质合成相关基因。
数据柱标相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同。

Fig.4 Relative expression levels of genes related to lipidolysis and genes related to lipid synthesis

Value columns with the same letter mean no significant difference (P>0.05), with different small letter mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.
A to C: genes related to lipidolysis; D to I: genes related to lipid synthesis.

尾部脂肪细胞去分化培养的0、2、3、4、5、6、8、10、12、14和16 d时,各级前体脂肪细胞标志性基因和细胞发育过程中的重要基因相对表达量的变化如图5所示。脂肪细胞祖细胞标志性基因二肽基肽酶4(DPP4)和血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)相对表达量均出现极显著上调(P<0.01),去分化培养至6 d时DPP4基因比0 d时上调了400多倍(图5-J和图5-K),前体脂肪细胞标志性基因CD142和细胞黏附分子1(ICAM1)相对表达量也出现极显著上调(P<0.01)(图5-L和图5-M),干细胞标志性基因Nanog、Y染色体性别决定区域盒2(Sox2)和八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4)相对表达量随着脂肪细胞的去分化均出现极显著上调(P<0.01)(图5-O~图5-Q),但c-Myc相对表达量在整个去分化过程中呈现振荡表达(图5-N),说明脂肪细胞在该过程中逆转了细胞命运决定而重新获得了干细胞特性。另外,转化生长因子β(TGFβ)、Wnt10、信号传导及转录激活蛋白1(STAT1)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、α1-1型胶原基因(Col1a1)、Yes关联蛋白1(Yap1)和赖氨酸氧化酶(Lox)相对表达量在脂肪细胞去分化过程中均出现极显著上调(P<0.01)(图5-R~图5-X),这些基因在Wnt、TGFβ、Smad、Janus激酶-信号传导及转录激活蛋白(JAK-STAT)和Hippo等与发育相关信号通路中发挥重要调控作用,推测可能与脂肪细胞启动去分化有关。
图5 各级前体脂肪细胞标志性基因和细胞发育过程中的重要基因相对表达量

J~M:各级前体脂肪细胞标志性基因;N~X:细胞发育过程中的重要基因。

Fig.5 Relative expression levels of different levels of precursor fat cell signature genes and key genes during cell development

J to M: different levels of precursor fat cell signature genes; N to X: key genes during cell development.

2.5 脂肪细胞不同去分化时期培养液中甘油三酯和游离脂肪酸含量的变化

通过观察脂肪去分化过程中的形态变化(图3和图6-A),可见脂肪细胞将大脂滴裂解为小脂滴,同时在培养液表面可以看到脂质形成的大的油滴,由此推测将小脂滴直接排出细胞可能是脂肪细胞去分化过程中清除细胞内脂质的主要方式。为了验证上述推测,连续检测了去分化培养0、2、3、4、5、6、8、10、12、14和16 d的细胞培养基中甘油三酯和游离脂肪酸的含量(图6)。随着脂肪细胞去分化,培养液中甘油三酯的含量出现极显著上升(P<0.01),至去分化培养6~8 d达到峰值,比初始培养时升高了近6倍,然后又逐步下降,直至细胞完成去分化后降至最低值(图6-B)。培养液中甘油三酯含量的变化基本与脂肪细胞去分化的时间保持一致。而培养液中游离脂肪酸的含量在去分化培养3 d时显著上升(P<0.05),并基本保持稳定,至去分化培养12 d时又显著下降(P<0.05)(图6-C)。但与培养液中甘油三酯含量的变化相比,整个去分化培养过程中游离脂肪酸的含量变化很小。结合基因表达检测结果可以确定,直接排出脂滴应该是脂肪细胞去分化过程中清除细胞内脂质的主要方式。
图6 不同去分化阶段培养液中甘油三酯和游离脂肪酸含量变化

A:正在排出脂滴的脂肪细胞,刻度线表示20 μm;B:脂肪细胞去分化过程中培养液中甘油三酯含量的变化;C:脂肪细胞去分化过程中培养液中游离脂肪酸含量的变化。

Fig.6 Variation of triglyceride and free fatty acid contents in culture medium at different dedifferentiation stages

A: the adipocytes expelling lipid droplets, the scale line indicates 20 μm; B: variation of triglyceride contents in culture medium at different dedifferentiation stages; C: variation of free fatty acid contents in culture medium at different dedifferentiation stages.

2.6 不同来源DFAT细胞诱导成脂分化能力差异

经诱导成脂分化的DFAT细胞逐渐停止细胞增殖,诱导分化至4 d时部分细胞中开始出现一些微小的脂滴,随着诱导时间的增加,细胞中的脂滴数量迅速增多,说明细胞开始大量储积脂质(图7-A),同时细胞中的小脂滴开始逐渐融合为大脂滴(图7-B)。使用油红O染色法对不同来源DFAT细胞诱导成脂分化能力进行定量检测,结果表明,尾部脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪细胞来源的DFAT细胞诱导成脂分化能力无显著差异(P>0.05)(图7-C)。
图7 DFAT细胞诱导分化期间细胞中脂滴的形成

A:诱导分化4(a)、8(b)、12 d(c)的DFAT细胞,红色箭头指示的为细胞中出现的脂滴,刻度线表示50 μm;诱导分化4(d)、8(e)、12 d(f)的DFAT细胞油红O和苏木精联合染色图片,红色为油红O染色脂滴,黄色箭头指示的为苏木精染色的细胞核,刻度线表示20 μm;B:诱导分化12 d的DFAT细胞,红色箭头指示的为不断融合增大的脂滴,刻度线表示50 μm;C:不同来源DFAT细胞诱导成脂分化能力差异。

Fig.7 Formation of lipid droplets during DFAT cells were induced redifferentiation

A: DFAT cells were induced redifferentiation for 4 (a), 8 (b) and 12 days (c), the red arrows show the lipid droplets in cells, the scale line indicates 50 μm; DFAT cells dyed by oil red O and hematoxylin when induced redifferentiation for 4 (d), 8 (e) and 12 days (f), the red arrows show the lipid droplets in cells dyed by oil red O, and yellow arrows show the cell nucleus dyed by hematoxylin, the scale line indicates 20 μm; B: DFAT cells were induced redifferentiation for 12 days, the scale line indicates 50 μm; C: capacity variance of DFAT cells from different source when were induced redifferentiation.

3 讨论

3.1 DFAT细胞及其分离培养体系

前体脂肪细胞是研究脂肪沉积分子调控机制的理想细胞模型,也是组织工程学良好的种子细胞。但前体脂肪细胞在组织中的数量少,分离培养过程中易受到增殖能力强的杂细胞污染。而DFAT细胞具有和前体脂肪细胞相似的分子特征和分化潜力[3-4],且具有细胞来源丰富、分离培养简便、细胞纯度高等优点,所以可很好地替代前体脂肪细胞用于相关研究。经典的“天花板”培养法最早由Sugihara等[9]首先提出,并用于分离培养小鼠DFAT细胞。目前已建立了人[6]、猪[7]和牛[8]等多个物种的脂肪细胞去分化“天花板”培养法。在实际应用过程中,国内外学者基于经典的“天花板”培养法存在的缺陷进行了一些改良。Jumabay等[10]将膜孔径为70 μm的细胞培养小室置于6孔板中,加满细胞培养基后接种适量人成熟脂肪细胞。漂浮在培养基表面的脂肪细胞启动去分化,完成去分化的脂肪细胞下沉并穿过细胞培养小室的滤膜至6孔板底贴壁生长,从而与未完成去分化的脂肪细胞分离,经过5 d的培养就获得了约10 000个DFAT细胞。这个试验同时也证实了附着面和密闭低氧环境不是脂肪细胞启动去分化的必要条件。本研究中,用漂浮在培养基表面的细胞爬片为脂肪细胞提供了一个附着面,但整个培养体系不是密闭的,也成功获得了大量绵羊DFAT细胞。与Jumabay等[10]建立的体系相比较,本研究建立的去分化培养体系的优势在于,可以在去分化培养的不同时间将细胞爬片取出,对处于不同去分化阶段的脂肪细胞进行免疫荧光、原位杂交等深入研究,为深入研究脂肪细胞去分化的分子调控机制提供了便利。

3.2 不同脂肪细胞去分化能力的差异

脂肪细胞在体内和体外均可完成去分化,小鼠乳腺中的脂肪细胞会随着小鼠妊娠、哺乳和断奶的转变而反复出现去分化和再分化[4,11]。但到目前为止,有关不同组织来源和年龄脂肪细胞去分化能力差异的研究仍很少,对绵羊的相关研究尚未见报道。Lessard等[12]对来自不同肥胖患者的网膜和皮下脂肪细胞去分化能力进行了比较,这些患者的年龄在29~66岁,体重在91.9~212.0 kg,包括13名女性和11名男性,体外试验结果表明,这些脂肪细胞的去分化能力无显著差异,且获得的不同来源DFAT细胞连续传代16代后细胞的增殖能力均未见明显下降。Poloni等[13]对年龄在53~81岁无肥胖患者的网膜和皮下脂肪细胞去分化能力的研究也得到了同样的结果。本研究分别对6、12、18和24月龄阿勒泰羊的尾部脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪细胞去分化能力进行比较,发现脂肪细胞去分化的能力与其组织来源、年龄无明显相关性,与Lessard等[12]和Poloni等[13]的研究结果一致。但本研究同时发现,脂肪细胞的大小与其完成去分化的时间存在极显著的相关性,直径越小的脂肪细胞内储存的脂质越少、脂滴越小,所以其裂解、排出脂滴完成去分化的时间也越短。从已有的研究结果可以看出,与动物体内其他终末分化的细胞相比,脂肪细胞长期保持着去分化、增殖和再分化能力,有极强的可塑性。由此推测,组织中的脂肪细胞可能作为其干细胞库的重要组成部分参与组织损伤的修复。脂肪细胞的这一特性也使其成为组织工程学、再生医学和美容行业理想的种子细胞来源[14]。

3.3 绵羊脂肪细胞去分化过程中相关基因相对表达量的变化

成熟脂肪细胞去分化的过程,实质上是其逆转细胞命运决定、清除储存的脂质、进而转变为具有干细胞特性的DFAT细胞的过程。所以,该过程中必然涉及一些细胞命运决定和分化、干细胞特性维持以及脂质代谢相关基因表达变化。Merrick等[1]利用单细胞转录组测序技术对脂肪组织中间充质祖细胞和处于不同分化层级的细胞,以及其标志性分子进行了深入解析,发现祖细胞均为DPP4+细胞,且这些细胞均分布在由胶原纤维和弹性纤维构成的网状结构的小间隙里面,这些网状结构又包裹着脂肪组织。TGFβ信号通路在维持其祖细胞状态至关重要。DPP4+细胞分裂后有一部分细胞会从网状组织中进入脂肪组织,转变为命运决定的ICAM1+和CD142+前体脂肪细胞,进而在胰岛素的诱导下启动脂质沉积转变为ADIPOQ+成熟脂肪细胞。本研究在脂肪细胞去分化过程中检测到DPP4、ICAM1、CD142和TGFβ相对表达量均出现极显著上调,且DPP4相对表达量最高上调了400多倍。Li等[15]利用单细胞转录组测序技术对鸡胸肌中的细胞类型进行了研究,发现COL1A1可以作为肌内前体脂肪细胞的特异性分子标志,而本研究中也检测到COL1A1相对表达量在脂肪细胞去分化过程中最高上调80多倍。同时Nanog、Sox2和Oct3/4相对表达量随着脂肪细胞的去分化也出现极显著上调,与Liu等[16]的研究结果一致。Nanog、Sox2和Oct3/4均在各类干细胞中高表达,对干细胞多能性的维持至关重要。Ortega等[17]研究表明,Nanog和Sox2对牛胚胎外胚层形成及其多能性维持是必不可少的。在人诱导多能干细胞中Oct3/4相对表达量出现极显著上调,在诱导外胚层形成时其相对表达量进一步上调[18]。本研究中,脂肪细胞去分化过程中Nanog、Sox2和Oct3/4相对表达量均出现极显著上调,说明其逐步转变为具有干细胞特性的DFAT细胞。另外,脂肪细胞祖细胞标志性基因DPP4[1]及前体脂肪细胞标志性基因ICAM1[1]、CD142[1]和COL1A1[15]相对表达量均出现极显著上调,说明DFAT细胞具有脂肪细胞祖细胞和前体细胞的特性。从以上结果可以看出,脂肪细胞在去分化过程中相关基因迅速逆转为其祖细胞和前体细胞表达状态,进而重新获得了干细胞特性,提示在这些基因及其参与的信号通路可能在脂肪细胞去分化中发挥着重要的调控作用。
在脂肪细胞去分化过程中,细胞中脂质的清除机制目前仍未被阐明。宋子仪等[19]对猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因相对表达量进行了研究,发现成脂关键基因脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)、PPARγ和LPL相对表达量以及脂肪分解关键基因HSL和ATGL相对表达量均出现了极显著上调,与本研究得到的结果一致,说明加强脂质分解不是DFAT细胞清除脂质的主要方式。同时,本研究对去分化期间培养液中甘油三酯和游离脂肪酸含量变化的检测结果表明,直接排出脂滴应该是脂肪细胞去分化过程中清除细胞内脂质的主要方式。但调控大脂滴裂解为小脂滴并排出细胞的分子机制尚待进一步研究。Kim等[20]研究表明,脂肪细胞内脂滴的形态与肌动蛋白的状态有关,并直接影响细胞对胰岛素的敏感性。在褐色和米色脂肪细胞中,肌动蛋白相互聚合呈纤维状,脂滴也以分散的小脂滴存在,细胞对胰岛素的敏感性高;而在白色脂肪细胞中,纤维状的肌动蛋白解聚为球状单体,脂滴也转变为单个大脂滴状态,且细胞对胰岛素的敏感性降低。本研究中也检测到了去分化过程中Col1a1、Yap1和Lox等与纤维交联相关的基因相对表达量出现极显著上调,推测可能与大脂滴裂解为小脂滴有关。已有的研究结果表明,体内细胞也存在直接排出脂滴的现象,并有重要的生物学意义。Flaherty等[21]研究发现,组织中脂肪细胞以出芽的方式将小脂滴释放到组织中,通过促进组织巨噬细胞的分化而发挥免疫调理的作用。牛奶中的脂肪球就是乳腺上皮细胞以顶浆分泌的方式释放到乳汁中的脂滴[22]。但体内和体外状态下细胞排出脂滴的机制是否存在差异尚未有明确结论。

3.4 组织来源对绵羊DFAT细胞诱导成脂分化能力的影响

已有的研究结果表明,DFAT细胞具有多能性,可诱导再分化为脂肪细胞、内皮细胞和成骨细胞等[5]。到目前为止,有关不同组织来源DFAT细胞诱导成脂能力差异的研究相对较少。Chen等[23]对来源于猪肌内脂肪和内脏脂肪组织DFAT细胞的研究表明,肌内脂肪DFAT细胞诱导后沉积脂肪的速度要远高于内脏脂肪组织DFAT细胞。陈涛等[24]在新西兰兔中的研究表明,皮下前体脂肪细胞启动分化的时间要早于肌内前体脂肪细胞。但本研究对来源于绵羊尾部脂肪、肾周脂肪和肌内脂肪DFAT细胞诱导成脂分化能力进行了比较,未见出现显著差异。造成以上试验结果不一致的原因,可能与研究材料、诱导分化条件等因素有关,故尚待进一步研究。另外,在对动物体内不同部位脂肪沉积的研究表明,皮下脂肪和内脏脂肪启动沉积的时间要远早于肌内脂肪,且肌内脂肪的沉积具有明显的阶段性。幼龄动物即使用高能量饲粮饲喂,皮下脂肪和内脏脂肪会加速沉积,但肌内脂肪不会出现明显沉积[25]。这也再次证明,前体脂肪细胞启动脂肪沉积受多种因素的影响,体内不同组织中前体脂肪细胞启动脂肪沉积必然受到来自机体信号的严格调控,而体外试验中诱导培养基的构成、培养条件等因素都可能对其启动成脂分化产生影响,这也可能是造成了不同实验室研究结果存在较大差异的重要原因。

4 结论

① 绵羊脂肪细胞去分化能力与绵羊年龄、脂肪细胞组织来源无明显相关性,但与脂肪细胞的大小极显著相关,脂肪细胞越小,其完成去分化的时间越短。
② 绵羊脂肪细胞主要通过直接排出脂滴清除细胞中的脂质,加强脂质分解在该过程中并不占主导地位。
③ 绵羊脂肪细胞去分化过程中,成熟脂肪细胞迅速逆转细胞命运决定,转变为具有其祖细胞和前体细胞分子特征的细胞,进而重新获得干细胞特性。
④ 绵羊不同组织来源DFAT细胞诱导成脂分化能力没有显著差异。

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