我国农业农村部发布的《饲料原料目录》中对秸秆的特征描述是成熟农作物干的茎叶(穗)[1],即小麦、水稻、玉米、大豆、棉花、油菜、甘蔗和其他农作物收获籽实后的剩余部分,广义上也包括农产品加工后的剩余产品。我国农作物秸秆产量大、种类多,近10年来产量稳定在8亿t/年[2],大批量的秸秆被就地焚烧,不仅造成巨大的资源浪费,还引发了严重的环境污染问题。2021年农作物秸秆作为肥料、饲料、原料、燃料和基料的五项综合利用方案在官方指南中得到了明确和总结[3]。2018—2020年间,我国秸秆的平均可收集产量为6.0亿t,其中89.3%进行了秸秆综合利用,秸秆肥料化利用占比达到69.3%,其次是饲料化(17.8%)和燃料化(10.6%),基料化或原料化占比为2.1%[4]。
秸秆饲料化用于畜禽养殖是秸秆资源化的一种有效途径。我国粮食安全的主要问题在于饲料粮紧缺,将秸秆这一资源丰富的农业副产物饲料化,可变废为宝,缓解我国饲料粮短缺问题,同时还可减轻焚烧秸秆带来的环境污染[5-6]。然而,农作物秸秆具有低能低蛋白质、营养价值差、质地粗硬、高纤维等特点,直接用作饲料适口性差、利用率低,这大大限制了秸秆的饲料化进程。究其原因,秸秆的主要成分木质纤维素,特别是其中的木质素,难以被动物直接消化利用,成为秸秆饲料化的关键限制因素之一[7]。关于木质素的降解目前主要的方法有物理法、化学法和生物法,其中生物法耗能低,化学副产物少、环境友好、操作相对简单、成本低、绿色可持续,有巨大应用前景[8]。本文综述了木质素的化学组成及种类、降解相关微生物及酶、生物发酵降解现状以及在动物养殖中的应用,以期为秸秆饲料化生产提供参考。
1 秸秆中木质素的化学组分及作用
表1 不同农作物秸秆中木质纤维素成分含量(干物质基础)Table 1 Contents of lignocellulose components in different crop straws (DM basis) % |
| 农作物秸秆种类 Crop straw species | 木质素 Lignin | 纤维素 Cellulose | 半纤维素 Hemicellulose | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 水稻秸秆Rice straw | 11.59~26.70 | 36.21~48.88 | 9.98~23.70 | [10] |
| 玉米秸秆Corn straw | 14.66~30.02 | 31.57~48.65 | 9.63~26.46 | [10] |
| 小麦秸秆Wheat straw | 15~20 | 33~40 | 20~25 | [11] |
| 棉花秸秆Cotton straw | 25~31 | 33~36 | 9~18 | [12] |
| 油菜秸秆Rape straw | 17.72 | 49.52 | 12.69 | [13] |
| 大豆秸秆Soybean straw | 12.8 | 39.8 | 22.6 | [14] |
| 甘蔗渣Bagasse | 36 | 31 | 23 | [15] |
| 大麦秸秆Barley straw | 16 | 38 | 35 | [16] |
| 高粱秸秆Sorghum straw | 30.42 | 49.43 | 19.18 | [17] |
| 苎麻秸秆Ramie straw | 32.63 | 18.44 | 19.90 | [18] |
| 烟草秸秆Tobacco straw | 21.06 | 30.22 | 40.28 | [19] |
木质素是一种复杂异质、三维无定型的长链高分子芳香族聚合物,由3种主要的苯丙烷单元组成,分别为对羟苯甲基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)。不同植物木质素的苯丙烷组成单元有所不同,硬木(如桦树和白杨树)中S型木质素较多,软木(如松树、云衫)中G型木质素较多[20],在草本植物(如水稻、小麦、玉米)中除了S、G型木质素外,同时还具有H型木质素。木质素亚基间以不同类型的碳-碳键和碳-氧键连接,并被各种官能团修饰。β-O-4是木质素单元间连接最多的化学键,另外还有β-5、β-β、α-O-4和4-O-5等多种连接方式[21]。植物种类及生长阶段不同,木质素含量会有所差异,一般随植物的成熟,木质素含量逐渐增加;木本植物比草本植物木质素含量高。木质素的这种复杂异质结构使其难以被微生物降解,并且木质素与纤维素、半纤维素以共价健、非共价键紧密结合,在细胞壁中起到黏合剂的作用,在保持植株的机械强度、抵抗病原体入侵、防止纤维素和半纤维素的降解等方面发挥重要作用,但是也严重阻碍了秸秆中木素纤维素的降解及其高值化应用[22]。此外,各类植物木质素的化学结构差异非常大,开发通用性强的降解改造方法也有很大的困难。
2 木质素的种类
根据不同的提取方法,木质素可分为磨木木质素、碱木质素、Klason木质素、Kraft木质素以及酶解木质素等。木质素的分离提取原料来源通常包括农作物秸秆在内的植物原料、造纸制浆工艺中分离纤维素后的主要杂质或二代生物乙醇生产的主要副产品。由于不同的提取方法对原生木质素的破坏程度不同,各类木质素在化学结构上存在显著差异[25-26]。磨木木质素又称为贝克曼木质素,原料多为秸秆等废弃生物质,在室温下用不引起润胀作用的中性溶剂作介质将其研磨,通过溶剂抽提而获得的高得率的分离木质素[27]。碱木质素主要来源于碱法造纸制浆黑液,在高温条件下加入强碱使木质素溶解在溶剂中形成黑液,经沉淀后分离得到的木质素[28]。Klason木质素是植物原料经浓度为72%的硫酸预处理和浓度为3%的稀硫酸水解去除碳水化合物后的残渣。Kraft木质素是在Kraft制浆工艺中用水、氢氧化钠和硫化钠的热混合物处理植物原料,使木质素与纤维素分离,是纤维素纸浆的副产品,所得溶液呈现黑色浆粕状[29]。酶解木质素是从生物酶水解秸秆等植物原料去除碳水化合物后的残渣中分离得到的木质素,具有多种活性基团和较好的反应活性。随着木质素的高值化开发利用,其在药物缓释微胶囊、抗老化剂、碳基电极材料等领域的应用开展了广泛研究[30-31]。
为了深入进行木质素的相关研究,在科研中通常会使用木质素的模型化合物,其结构简单并能部分体现天然木质素的化学结构及特性,可以为天然木质素的研究提供借鉴,更好地丰富木质素的相关理论[32-33]。根据聚合度不同,分为单体、二聚体、三聚以及多聚体木质素模型化合物。单体模型化合物是最简单的木质素模型物,常用的木质素单体模型化合物有愈创木酚、紫丁香酚、香草醛等,使用此类化合物可以简化木质素的相关研究,如木质素降解、改性和合成等。在木质素降解微生物的筛选中,通常使用愈创木酚作为指示剂[34]。二聚体模型化合物既有单体模型化合物中没有的木质素亚单元间的连接键,相较三聚体和多聚体又有结构简单的优点,用此可以更为容易地进行木质素降解机理、各种键型断裂方式及难易程度等研究,因此对二聚体模型化合物的研究也较多[35]。较为简单的木质素二聚体模型化合物有苯乙基苯基醚,其为β-O-4型连接木质素。目前对木质素三聚体及以上的模型化合物的研究则较少。
3 降解秸秆木质素的微生物及酶
3.1 木质素降解真菌
白腐菌包括大多数担子菌和少数子囊菌,白腐菌中有些种类可以同时降解纤维素、半纤维素和木质素,如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、红松腐霉菌(Heterobasidion annosum)和白囊耙齿菌(Irpex lacteus)等;有些种类则特异性降解木质素而不降解纤维素,如虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、松木层孔菌(Phellinus pini)、灵芝(Ganoderma lucidum)和胶质射脉革菌(Phlebia tremellosa)等[39-40]。黄孢原毛平革菌是降解木质素的模式白腐菌,该菌2004年完成了全基因组测序,已被应用于木质纤维素生物质的生物预处理。Sosa-Martínez等[41]以农业废弃物玉米芯为底物,对该菌木质素降解酶的固态发酵工艺进行了改进;Sun等[42]用其预处理玉米秸秆,5周后木质素降解31.8%。褐腐菌能够快速水解纤维素和半纤维素组分,仅部分氧化木质素,留下深褐色的木质素残留。有研究报道,褐腐菌是由腐食营养的白腐菌进化而来,丢失了一些编码木质纤维素降解酶的必需基因[38]。部分软腐菌也能够产生木质素降解酶,但其降解能力通常较差。
木质素降解真菌及其分泌的酶在生物制浆、制浆造纸废水处理、有毒芳香族化合物去除以及生物好氧堆肥等方面都有应用,但在饲料中的应用却仍较少。《饲料添加剂品种目录》中除酵母菌外,只有黑曲霉和米曲霉2种真菌,鉴于真菌在秸秆木质素降解中的重要作用,应针对性的开发更多安全、高效降解木质纤维素的真菌,以促进秸秆资源绿色低成本的饲料转化。
3.2 木质素降解细菌
细菌对木质素解聚主要发生在有氧条件下,放线菌门细菌有较强的木质素降解能力,其中的链霉菌属(Streptomyces)和红球菌属(Rhodoccocus)是降解木质素的典型细菌。绿色链霉菌(Streptomyces viridosporus)T7A菌丝形态与真菌相似,能够分泌胞外酶分解木质素,使小麦秸秆中的木质素愈创木基单元减少[45]。用绿色链霉菌T7A和西唐链霉菌(Streptomyces setonii)共同发酵针叶木、阔叶木和草,可去除30%~45%的木质素[46]。变形菌门的一些细菌也可进行木质素解聚,如假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和潘多拉菌属(Pandoraea)等。以芽孢杆菌属(Bacillus)为代表的一些厚壁菌门细菌也具有木质素降解能力,并且芽孢杆菌属的几种细菌,如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等,在我国《饲料添加剂品种目录》中。Yadav等[47]从污泥中筛选得到的枯草芽孢杆菌对Kraft木质素的降解率为39%。Huang等[48]从秘鲁热带雨林土壤中分离出的短小芽孢杆菌有较高的木质素降解能力。
不同于好氧细菌,一些厌氧细菌可将木质素及其衍生的芳香烃转化为甲烷和二氧化碳,天然木质素在厌氧条件下的降解缓慢,但高度甲氧基化的木质素则相对容易降解[49],目前关于木质素厌氧降解的研究仍较少。另外,一些细菌可以耐受极端环境,如耐热、耐冷,在某些条件下对木质素的降解和利用更具竞争力。目前我国《饲料添加剂品种目录》中的细菌绝大部分是乳酸菌,其种类远不能满足秸秆木质纤维素的高效饲用转化。
3.3 木质素生物降解代谢途径及相关酶
微生物的木质素降解过程主要分为3个阶段,首先是天然木质素的解聚,微生物分泌的多种胞外酶协同作用将异质大分子木质素高聚物解聚为各种低分子量片段,此过程的相关酶有木质素修饰酶(如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、多功能过氧化物酶、染料脱色过氧化物酶、漆酶)和木质素降解辅助酶(如乙二醛氧化酶、芳醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、酚氧化酶、过氧化氢酶、新阿魏酰酯酶);然后是芳香族化合物的分解代谢和裂解开环,木质素衍生的异构芳香族化合物分解代谢为主要中间体,如原儿茶酸、儿茶酚、龙胆酸和丁香酸等,继而中间体的芳香环被打开,此过程涉及到的酶有去甲基化酶(如细胞色素酶P450、Rieske加氧酶和四氢叶酸依赖型的脱甲基酶)、羟基化酶(如双加氧酶、单加氧酶、酚氧化酶和过氧化物酶)、脱羧酶(如脱羧酶、羧化酶)和双加氧酶(如儿茶酚双加氧酶)等;最后这些开环后的中间体通过芳香族中心代谢途径进入三羧酸循环为微生物提供能量,此阶段发挥作用的酶有原儿茶酸3,4-双加氧酶、阿魏酰辅酶A合成酶、阿魏酰辅酶A裂解酶、阿魏酸脱羧酶、香草酸脱甲基酶、没食子酸加双氧酶等[50-51]。自然环境中,具有不同木质素降解酶和芳香化合物分解代谢途径的微生物协同作用达到完全降解木质素的效果。
木质素解聚主要由微生物分泌的胞外氧化酶进行,在氧化过程中,氧化酶产生的不稳定自由基可以攻击木质素,使化学键断裂,将木质素大分子聚合物解聚为低分子量芳香化合物。木质素降解酶系主要包括木质素修饰酶和木质素降解辅助酶。木质素修饰酶在木质素解聚中起着关键作用,通过产生苯氧自由基和断裂各种连接直接降解木质素,主要有过氧化物酶(主要指木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、多功能过氧化物酶和染料脱色过氧化物酶)和多酚氧化酶(主要是漆酶)。锰过氧化物酶只能氧化降解酚类木质素,木质素过氧化物酶能够氧化不同的酚类芳香族化合物和各种非酚类木质素,多功能过氧化物酶则具有广泛的木质素降解功能,染料脱色过氧化物酶是一种新型过氧化物酶,作用底物广泛。漆酶是一种含铜多酚氧化酶,催化底物具有广泛性。这些主要的木质素降解酶的分子结构、性质及其酶学机制已经有系统的研究[52⇓⇓⇓-56]。木质素降解辅助酶不能降解木质素,但对微生物完成木质素降解过程是必需的,它通过氧化小分子化合物产生过氧化氢间接参与木质素降解。这些产生自由基的辅助酶有乙二醛氧化酶、芳醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、酚氧化酶、过氧化氢酶、新阿魏酰酯酶等。在分子氧的参与下,木质素降解辅助酶通过氧化不同类型的小分子底物生成过氧化氢,从而作为电子受体激活过氧化物酶,启动木质素降解酶的催化循环。
木质素解聚生成的芳香族化合物的分解代谢和开环过程涉及脱甲基、羟基化、脱羧和双加氧酶介导的开环等多种反应[54]。木质素在微生物作用下发生解聚生成的低分子量非均相混合芳香族化合物具有一定的毒性,抑制微生物生长。这些芳香族化合物通常含有多个官能团,阻碍了其在体内的进一步降解。大多数木质素降解微生物具有多种去甲基化酶,如细胞色素酶P450、Rieske加氧酶和四氢叶酸依赖型的脱甲基酶[54]。与脱甲基化的功能类似,羟基化和脱羧反应的目的也是活化木质素的芳香环以便后续的开环反应。与芳香族化合物羟基化相关的酶大致可分为双加氧酶、单加氧酶、酚氧化酶和过氧化物酶。脱羧酶可分为四大类,分别为脱羧酶、羧化酶、催化对羟基苯乙烯侧链β-碳羧化反应的酶和催化杂环芳烃羧基化的酶。经过脱甲基化、羟基化和脱羧等一系列反应后,木质素类芳香族化合物通常被转化为一些共同的单体,如原儿茶酸、儿茶酚、龙胆酸和丁香酸等,随后芳香环被打开,双加氧酶是催化开环反应的关键酶,如代表性的儿茶酚双加氧酶。
开环后的木质素类芳香族衍生物通过一系列中心代谢途径生成三羧酸循环中间体,进入三羧酸循环,为微生物的生长提供能量。在木质素来源的芳香族化合物代谢中发挥关键作用的最常见的途径有β-酮己二酸途径、尿黑酸途径、苯乙酸途径等。目前相关代谢途径的解析大多数集中在代表性木质素降解细菌,如有研究显示恶臭假单胞菌可以利用β-酮己二酸通路将原儿茶酚和儿茶酚的开环产物转变为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A,最后通过三羧酸循环实现木质素类芳香族化合物的利用[55]。
4 秸秆木质素的微生物降解
秸秆饲料化过程的主要瓶颈之一为木质素的存在使木质纤维素难以被动物转化利用。木质素降解方法目前主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括切短、揉丝和微波等,物理法虽然效率高、生成的副产物少、污染少,但耗能大、成本高。化学法需要使用酸、碱、氧化剂和有机溶剂等,虽然该方法能有效降解木质素,但所用酸、碱对设备的腐蚀较大、污染严重,另外酸或碱处理后的秸秆不能直接饲喂动物,后续还需调节pH,这些都增加了成本。相比之下,生物法耗能低、化学副产物少、环境友好,应用潜力较大[8]。生物降解秸秆木质素的方法有酶解法和微生物发酵法,酶解法一般仍需先对秸秆进行物化预处理,再加酶进行反应,且木质素降解酶成本高、易失活;而微生物发酵法则是直接将秸秆与木质素降解菌共同培养,使微生物增殖并产酶实现对木质素的降解,操作相对简单、成本低、绿色可持续,越来越受到关注,是有巨大应用前景的秸秆木质素降解途径,因此本文重点讨论微生物发酵法。
4.1 单一菌种发酵
真菌白腐菌因高产木质素降解酶被视作高效的秸秆木质素降解微生物,研究显示白腐菌虫拟蜡菌对木质素的降解有较强的选择性,对纤维素的降解相对较少,能更多的保留纤维素多糖,是制备生物燃料和生物制浆中常使用的微生物。Van Erven等[56]使用虫拟蜡菌对小麦秸秆进行脱木质素,经过7周的降解作用,使用定量热裂解气相色谱质谱法测定小麦秸秆的木质素去除率可达到66.4%,而90%以上的木质纤维素多糖均能保留下来,该菌主要通过Cβ-O-芳基的断裂降解大部分的β-O-4醚键以脱除草本植物中的木质素。虫拟蜡菌对木质素的有效降解主要依赖锰过氧化物酶和产生过氧化氢的芳基醇氧化酶,部分依赖于漆酶,而缺少在其他白腐菌中普遍存在的木质素过氧化物酶和多功能过氧化物酶[57]。Nakazawa等[58]对虫拟蜡菌成功进行了CRISPR/Cas9系统的基因编辑,这将有助于对该菌木质纤维素降解系统的研究。许多广泛栽培的食用菌如平菇(Pleurotus ostreatus)、凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)、香菇(Lentinula edodes)也属于白腐菌,有丰富的木质素降解酶系,能很好地降解秸秆木质素。利用食用菌降解秸秆木质素,既得到了更高价值的菌体蛋白,又降解了秸秆木质纤维素中最难以被动物利用的木质素,提高了秸秆的营养价值,是将废弃生物质转化为饲料的一种有效方法。陈莎等[59]以我国广泛栽培的20株食用菌(平菇、姬菇和杏鲍菇)为材料,先以产生漆酶和木质素过氧化物酶的能力、在稻草基质中的生长速度,再以稻草木质素降解能力为指标,筛选得到1株木质素降解率最高达到36.4%的平菇。
目前自然界中主要的木质素降解微生物虽然是白腐菌,但其降解周期较长,在生产应用中受到了很大限制。因此,近些年研究者在不断开发寻找脱木质素周期相对更短的微生物。细菌的木质素降解能力虽然普遍比真菌弱,但其具有繁殖迅速且适应性强的优点。Wu等[60]从稻田土壤中分离出1株细菌为伊朗纤维素单胞菌(Cellulomonas iranensis),有很好的降解木质纤维素的能力,4 d能将水稻秸秆的木质素降解29%,并且在有氧和厌氧条件都能进行木质纤维素的降解,有广泛的应用潜力。
由于秸秆的种类不同,所含木质素的化学组成、结构及含量也会有所差异,因此菌株的筛选应有底物针对性,通过不同的分离筛选方法进行评估,并以底物中木质素的实际降解率为最终筛选标准。Jain等[34]通过多种方法分离筛选获得了针对水稻秸秆木质素降解能力较好的菌株:首先以硫酸盐木质素、亚甲基蓝和愈创木酚为全碳源,从12种不同的传统有机肥中分离出27株木质素降解菌(LDB-1~27),通过定性和定量的方法评估了它们的木质素降解潜力,在对水稻秸秆的生物降解的研究中,菌株LDB-8[路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)]的木质素降解率最高(52.86%),其次为LDB-25[变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)](52.69%)、LDB-20[水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)](48.01%)、LDB-9[拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)](45.99%)。
4.2 复合菌种发酵
单个微生物分泌的酶系有限,而木质素是生物大分子,要更快速的降解为小分子则需要多种酶的共同参与,因此多种微生物的协同作用可以弥补单一菌种的木质素降解酶系、增加木质素降解效果并增强菌种稳定性。Wang等[61]研究发现,毛栓菌(Trametes hirsuta)BYL-3、变色栓菌BYL-7和毛栓菌BYL-8这3种真菌协同降解水稻秸秆木质素的效果要优于任意单一菌株以及两者的组合,其中单一菌株中BYL-7的木质素降解率最高,为24.1%;两两组合中BYL-7和BYL-8组合的木质素降解率最高,为16.5%;三者复配的木质素降解率为30.4%,经过培养优化后能进一步提高到39.7%。Ma等[62]研究显示,毛头鬼伞(Coprinus comatus)和里氏木霉(Trichoderma reesei)共培养可增加木质素降解酶活性,共培养的最高漆酶活性是毛头鬼伞单独培养的2.6倍,并且提前3 d达到峰值;使用共培养粗酶液对玉米秸秆进行脱木质素,其木质素降解率为45.1%,大于2种单独培养粗酶液(毛头鬼伞为41.3%,里氏木霉为0.5%)。
菌种复配共培养发酵秸秆并不是简单机械地将2种或多种微生物放在一个培养体系,而是需要调节和促进它们之间的合作,以推进秸秆木质素降解的生物化学反应过程。不同菌株共培养时应考虑到是否存在相互拮抗作用。另外,因每种菌株自身特性及生长条件有所差异,需优化共培养的温度、时间、混合比例等因子,以达到多种菌株协同高效降解木质素效果。Chen等[63]在使用黄孢原毛平革菌与绿色木霉(Trichoderma viride)共同降解水稻秸秆时,黄孢原毛平革菌生长快于绿色木霉,两者不适合同步共培养,考虑到前者是降解木质素的主效菌,则先接种前者再接种后者,最后确定最佳共培养模式为先接种黄孢原毛平革菌培养4 d,再接种绿色木霉,2种真菌共培养4 d;进一步优化后的最佳发酵条件为:接种量14%,2种真菌等量接种,培养温度30 ℃,料液比1∶1.4,此时木质素和纤维素的降解率分别为26.38%和33.29%。
菌株进行人工复配可针对性地提高秸秆木质素的降解效果,传统的菌株复配一般是先进行单一菌株筛选,然后进行多菌组合,构建出高效木质素降解菌系。近些年组学技术得到快速发展,研究者开始通过多组学技术进行菌种复配。Chen等[64]将3种不同环境中的微生物经高通量测序及分析后最终确定了功能菌株悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)、绿色木霉、黑曲霉和枯草芽孢杆菌8种菌株作为核心菌株,构建木质纤维素降解的复合菌系进行混菌发酵玉米秸秆,通过发酵条件优化,纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为34.91%、45.94%和23.34%,并进一步利用蛋白质组学技术解析了其降解机制。
4.3 微生物群落发酵
自然界中木质素的降解是天然微生物群落中多种微生物共同作用的结果,群落中微生物之间通过代谢系统的相互作用形成代谢互补或营养依赖,因此微生物群落通常能抵抗外部营养条件的波动,适应不同的环境。从芦苇池塘污泥中筛选得到木质素降解菌群LDC,在30 ℃静态培养条件下,15 d可以降解芦苇中60.9%的木质素[65];7 d可以降解水稻秸秆中31.18%的木质素,而纤维素则只有5.70%被降解,且不同培养阶段的微生物群落结构差异较大,假单胞菌属(Pseudomonas)、索氏菌属(Thaurea)和梭菌属(Clostridium)微生物与水稻秸秆木质素的降解高度相关,木质素降解酶Ⅱ型过氧化物酶(AA2)、香草醇氧化酶(AA4)和1,4-苯醌还原酶(AA6)在培养48 h的表达量较24 h时显著上调,其中42.86%的AA2来自索氏菌属,100%的AA4来自梭菌属,62.5%的AA6来自假单胞菌属[66]。
从特殊生境中获得的菌群往往会有某种特质,腐朽的木质文物中易于微生物利用的纤维素、半纤维素等化合物在长期埋藏过程中被大量分解,从而形成富含木质素的环境,更易于分离出木质素降解微生物。研究者从腐朽木制古董中筛选出4个具有木质素降解能力的微生物,J-6在初始碱木质素浓度为0.5 g/L、pH 4、转速200 r/min的条件下,48 h后木质素降解率达到54%,菌群中主要真菌有酵母目(Saccharomycetales,98.92%)和子囊菌门(Ascomycota,0.56%),主要细菌为申氏杆菌属(Shinella sp.,47.38%)、贪铜杆菌属(Cupriavidus sp.,29.84%)和包西氏菌属(Bosea sp.,7.96%);J-6的最强降解性能与其组成相对应,其中酵母目微生物可能适应了体系并提高了木质素降解酶的活性,丰富的菌群加速了木质素的分解[67]。Zheng等[68]从寒冷的多年生森林土壤中获得了木质纤维素降解菌群LTF-27,在低温条件下对水稻秸秆木质素的降解可达12.5%,主要由副杆菌属(Parabacteroides)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、梭菌属以及一些未分类的未培养细菌组成。
4.4 物化预处理联合生物发酵
降解木质素的生物法因环境友好而备受关注,但也存在一些问题,其中降解时间长为生物法的主要缺点之一,特别是使用真菌发酵,周期更长,制约了秸秆生物降解在实际生产中的大规模应用。将物理、化学处理与生物发酵联合使用可缩短生物发酵时长,提高秸秆的生物转化效果,是一种很有前景的方法。
蒸汽爆破是目前常用的结合了物理和化学方法的秸秆预处理技术,利用高温高压蒸汽对物料进行处理,水蒸气进入秸秆木质纤维素组织间隙,瞬间释放压力使水蒸气急剧膨胀,从而实现物料的组分分离和内部结构变化[69]。蒸汽爆破处理可以为微生物提供更好的附着和生存空间,提升木质素生物降解效率。Zhang等[70]使用蒸汽爆破联合生物降解复合技术对3种生物质(桉树根、甘蔗渣、玉米秸秆)进行木质素降解研究,将3种生物质经蒸汽爆破后使用J-6和J-1菌群进行发酵,结果显示联合处理的木质素降解率均高于单独进行爆破处理或微生物发酵,其中桉树根蒸汽爆破后经J-1菌群发酵木质素降解率为35.35%,蒸汽爆破后经J-6菌群发酵木质素降解率为34.36%;甘蔗渣蒸汽爆破后经J-1菌群发酵木质素降解率为37.61%;玉米秸秆蒸汽爆破后经J-6菌群发酵木质素降解率为44.24%;酵母菌、罗尔斯顿氏菌和假单胞菌是生物质降解系统中的优势微生物。而Guo等[71]采用蒸汽爆破、氢氧化钠浸泡和米曲霉发酵的方法进行玉米秸秆的降解,蒸汽爆破、氢氧化钠浸泡以及两者的联合处理均可降低秸秆木质素、纤维素和半纤维素含量;而将联合处理后的秸秆进行米曲霉发酵,纤维素和半纤维素可进一步降解,但木质素却没有得到进一步降解,推测所用的米曲霉不能分泌木质素降解酶。这与Chang等[72]的研究结果一致,其使用米曲霉发酵蒸汽爆破后的玉米秸秆,纤维素和半纤维素含量进一步降低,而木质素含量却没有进一步降低。由此可见,并非预处理手段越多木质素的降解越好,还需针对发酵原料、微生物种类以及生产成本等具体情况而定,优化设计找出最优方案。
5 秸秆木质素生物降解对促进秸秆饲料化的作用
5.1 木质素的生物降解提升了秸秆饲料的营养价值
微生物在降解秸秆木质素的同时自身也会生长繁殖增加菌体生物量产生菌体蛋白,也叫单细胞蛋白(SCP),进而增加了秸秆的优质蛋白质含量。SCP附加值高,能在一定程度上填补我国饲料蛋白质的空缺。用于秸秆生物发酵的微生物多为真菌和细菌,其菌体中营养物质丰富,有较高的蛋白质含量,同时富含脂类、酶类、维生素、矿物质及多种生物活性物质。真菌SCP的蛋白质含量一般在30%~50%,细菌SCP一般在50%~80%[73]。Li等[74]使用葱色串孢菌(Torula allii)和青霉属(Penicillium sp.)真菌共同发酵氨化玉米秸秆5 d,混合物料的真蛋白质和粗蛋白质含量分别达到29.66%和35.41%;小鼠毒理学评价结果显示该发酵产物不会产生毒性作用,作为反刍动物饲料使用是安全的。秸秆降解菌与酵母菌混合培养发酵秸秆能进一步提高秸秆的蛋白质含量,提高饲用价值。拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae)、篮状菌(Talaromyces radicus)、枯草芽孢杆菌、绿色木霉混合发酵稻草秸秆,粗蛋白质含量由原秸秆的3.11%增至30.46%,粗纤维含量由原秸秆的49.67%降至14.15%,显著改善了稻草秸秆的饲料品质[75]。
秸秆经微生物发酵后木质素含量降低,纤维素和半纤维素更易被微生物分泌的酶系降解,秸秆中来源于纤维素降解产生的葡萄糖和相关寡糖以及来源于半纤维素降解产生的木糖、阿拉伯糖和相关寡糖的含量会显著增加,这些糖类更易被生物体利用,其中一部分可作为优质碳水化合物为畜禽提供能量,另一部分可作为发酵菌株的优质碳源[76]。
5.2 秸秆饲料中木质素生物降解后对畜禽生产性能的影响
秸秆作为饲料目前主要用于反刍动物,其可以消化利用秸秆中的纤维素和半纤维素,但利用木质素的能力有限。秸秆虽然可以作为反刍动物的饲料,但其营养价值低、适口性差。木质素经微生物发酵降解有助于木质纤维素的整体降解,经发酵后秸秆营养价值和适口性均提升,饲喂动物可提高饲料利用率和生产性能。平菇联合氨化预处理水稻秸秆,木质素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均显著降低,粗蛋白质含量由2.05%增至6.58%。体外瘤胃发酵试验结果显示,其体外干物质消化率、总挥发性脂肪酸含量、产气量均显著升高[77]。陈灵等[78]研究了微生物(塔宾曲霉、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)发酵小麦秸秆不同比例替代普通小麦秸秆对肉牛生长性能和屠宰性能的影响,结果表明饲喂微生物发酵小麦秸秆组料重比降低、日采食量、日增重以及肌肉的粗蛋白质、粗脂肪含量与大理花纹评分均提高,肌肉的熟肉率、失水率、肉色、嫩度无显著差异,提高了肉牛的生长性能和肉品质。黄丽琴等[79]使用水稻秸秆与平菇菌糠共发酵料饲喂山羊,与饲喂等量水稻青贮料或玉米青贮料相比,共发酵料可提高山羊的平均日增重,降低料重比,同时提高血清白蛋白含量和碱性磷酸酶活性。研究还发现,饲喂白腐菌发酵的玉米秸秆能显著改善感染了胃肠道线虫羔羊的肉品质和健康[80]。
单胃动物没有反刍动物那样适合消化代谢木质纤维素的瘤胃系统,因此利用木质纤维素的能力较弱,不能大量使用秸秆作为饲料。鉴于此,秸秆需经过更为深度的加工后才能饲喂单胃动物。王宣力等[81]使用由白腐菌、康氏木霉和酵母复合菌剂发酵的玉米秸秆部分替代玉米,可增加生长期猪血液中磷和三酰甘油含量,降低育肥期猪血液中碱性磷酸酶活性,促进猪的生长发育,降低饲养成本。饲粮中添加5%的发酵玉米秸秆粉,与对照组相比,肉仔鸡日增重提高、料重比降低,各项血液生化指标均差异不显著,说明发酵秸秆饲料不影响肉仔鸡的生长性能,但能降低养殖成本[82]。王全等[83]使用复合菌剂发酵玉米秸秆,检测发现其饲用营养价值大大提高,粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量显著下降,粗蛋白质、有机酸含量与总能显著增加;使用此发酵玉米秸秆粉不同比例替代常规饲粮饲喂肉鹅,平均日增重提高、料重比下降,肠道益生菌数量明显增加,大肠杆菌得到有效抑制,显著促进了肉鹅生长,降低了养殖成本。
6 小结
现阶段秸秆饲料化的比例仍较低,去除木质素是推动秸秆饲料化的关键之一。木质素的生物降解是一种绿色、低成本的处理方式,但生物降解所涉及的微生物发酵尤其是多种菌株或菌群的混合发酵是极为复杂的生化过程,发酵效果不仅与所用秸秆种类、菌株种类有关,还受到温度、时间、培养基成分和菌种接种量等多种因素影响,而饲用效果更是受到畜禽种类、生长阶段和添加量等诸多因素影响,导致有关木质素生物降解效果和秸秆饲喂效果的报道结论不一。因此,应进一步加强木质素生物降解相关机制的研究,探究针对不同秸秆种类高效脱木质素的菌种、菌群以及物化生联合的处理方法,优化发酵工艺条件,探索出可以大规模生产、批次稳定的生物发酵模式。此外,应加强秸秆饲料在畜禽养殖效果方面的研究,尤其是目前应用较少的单胃动物。从能量饲料替代、蛋白质饲料替代、调节动物机体健康、节本增效等多方面探索木质素生物降解后秸秆饲料对动物的作用与机制,提高秸秆在动物养殖中的占比。
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