断奶仔猪腹泻是当前全球养猪产业高发的疾病。断奶仔猪腹泻往往在仔猪断奶之后的1~2周内发生,其高发病率和高死亡率对养猪行业造成了较大的经济损失[1]。自2020年1月1日起,我国禁止在饲料中使用抗生素,面对这一现状,防治断奶仔猪腹泻又迎来新的挑战,而当前研究用于预防断奶仔猪腹泻的饲料添加剂包括有机酸制剂、植物提取物和中药等都在一定程度上取得了成效[2⇓-4]。
自然界中存在大量的微生物,简单的将对宿主生命活动有无影响作为区分条件,可将这些微生物分为有益微生物和有害微生物。益生菌是严格选择的微生物菌株,如果给予足够的量,能够为宿主带来额外益处[5]。然而,并非所有的有益菌都属于益生菌,成为益生菌须具备以下条件:1)对宿主的生命活动具有帮助作用,无毒性及致病性,且能够耐受含有胃酸、胆盐等的生存环境;2)在宿主体内能够以活菌的形式增殖并发挥作用;3)能够产生对宿主健康有益的代谢物,或通过改善宿主体内的微生物群落结构,间接对宿主健康产生积极作用[6]。益生菌可以单独使用或伴随饲粮喂食动物,起到预防及治疗断奶仔猪腹泻的作用,并且其成本较低,伴随饲粮广泛使用时可作为抗生素的代替物,在预防断奶仔猪腹泻方面具有较大的优势。近年来,益生菌作为治疗和缓解动物腹泻、促进动物健康生长的微生物制剂已经受到国内外的普遍关注。
1 益生菌来源和种类
1.1 益生菌来源
绝大多数益生菌常见于宿主本身,按照来源可分为生理性优势细菌、非常驻的共生菌和生理性真菌[7]。生理性优势细菌一般是宿主体内所具有的微生物,作为益生菌使用可直接帮助增加宿主消化道内的菌群数量。生理性优势细菌多由粪便或肠道内容物中筛选,这类益生菌一般并不会对宿主造成有害影响,其中粪菌移植作为为宿主接种益生菌的手段也越发常用于预防和治疗动物消化道疾病[8]。常见的生理性优势细菌包括双歧杆菌、乳酸菌和粪肠球菌等。非常驻的共生菌不同于生理性优势细菌,其往往来源于宿主肠道菌群外,非常驻的共生菌作为益生菌为宿主使用后,往往可帮助宿主肠道内本身的微生物增殖,起到促进生理性优势细菌生长与繁殖的作用,这类微生物往往能够产生一些有助于其他微生物增殖的代谢物,非常驻的共生菌包括芽孢杆菌、枯草杆菌等。
除过宿主消化道的益生菌以外,自然界中的微生物往往也能够作为益生菌为宿主提供帮助。在发酵产品中常可筛选到能够作为益生菌的微生物,这主要是由于发酵类产品本身在发酵过程中就处于厌氧条件下,最终存留的微生物也多为厌氧微生物。在发酵后期的极端环境下,能够最终保持较高活性的微生物,往往更能够适应胃肠道的生存环境。自然界中的微生物极其丰富,由合适的来源筛选微生物,往往能够减少研究工作量,提高寻找益生菌的可能性。
1.2 益生菌种类
目前,益生菌在畜牧行业被广泛使用,而我国在2018年正式实施生物饲料的团体标准——《生物饲料产品分类》(T/CSWSL 001—2018)中规定,微生物饲料添加剂可使用的微生物菌种应在乳酸菌、丙酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、霉菌和光合细菌六大类之内。在全球范围内,常见于仔猪饲粮的益生菌集中在乳杆菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属和片球菌属内。其中,乳杆菌属的使用较为常见,主要应用的菌种包括植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和布氏乳杆菌等;肠球菌属中粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸肠球菌较为常见;芽孢杆菌属中地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等也愈发多见于在饲料中添加,不同种类的益生菌无论是单独使用还是联合使用,都能在一定程度上减轻断奶仔猪腹泻症状[9]。不同种类的益生菌作用于仔猪肠道后,减轻断奶仔猪腹泻的机制也不尽相同。无论是在调节肠道稳态、肠道屏障或是动物机体自身免疫能力等方面,对益生菌缓解断奶仔猪腹泻的机制都开展了广泛的研究[10]。
2 益生菌通过调节肠道稳态缓解仔猪腹泻
2.1 益生菌通过自身增殖或促进其他微生物增殖缓解仔猪腹泻
肠道稳态是动物肠道组织、肠道内环境以及营养与代谢物等共同构成的动态稳定平衡状态,肠道稳态对于仔猪的肠道健康和营养物质吸收有着至关重要的作用[11]。益生菌往往依靠自身增殖或促进其他有益微生物增殖从而达到改善和加强肠道稳态的作用[12-13]。益生菌在自身的增殖过程中产生的代谢物如短链脂肪酸、抗菌肽等可在一定程度上帮助肠道内其他微生物增殖和定殖[14];另外,也有一些微生物的代谢物能够对其他微生物直接产生杀伤作用,直接杀伤有害微生物[15],如乳杆菌属对于动物胃肠道损伤时的肠杆菌科没有显著的抑制效果,但是添加乳杆菌属可帮助动物肠道内有益菌梭菌目的增殖,这主要是由于乳杆菌属产生的代谢物乳酸可作为梭菌目增殖的底物,且梭菌目在增殖过程中产生的丁酸盐可通过诱导结肠细胞中的过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ),限制氧和硝酸盐的含量从而抑制肠杆菌科的增殖[16]。有机酸及有机酸盐这类代谢物主要通过作用于肠道内分泌细胞表面的特异性G蛋白偶联受体来刺激肠道内黏液及抗菌物质的分泌,这些受体一般在肠道末端回肠和结肠中特别丰富,益生菌依靠这一过程,起到对其他微生物的抑制[17]。
有机酸是微生物在肠道增殖过程中产生的较为常见的代谢物,一般肠道内微生物能够产生的有机酸含量并不多,而通过筛选的益生菌往往拥有较好的产酸能力和快速降低肠道pH的能力,这种较低的pH环境在一定程度上能够阻碍有害微生物的增殖[18]。不同的有机酸往往对肠道内微生物产生的影响也不尽相同,其中乳酸和乙酸可以抑制肠道内多种病原菌的增殖,乳酸可作用于肠道内革兰氏阴性菌的细胞膜,增加细胞膜的通透性,通过在微生物胞质内积累有机酸和抑菌化合物降低胞质内pH,从而杀伤微生物[19-20]。除此之外,益生菌在增殖过程中还会产生细菌素、过氧化氢和铁载体等代谢物[21],通过多种机制对肠道内病原菌进行抑制,丰富的微生物代谢物也进一步说明益生菌的抑菌机制往往并不是单一的,对于抑菌机制的分析应当完整的关注肠道组织与微生物变化情况进行系统的分析,充分考量多种因素影响下的抑菌机制。
2.2 益生菌通过竞争性排斥有害微生物缓解仔猪腹泻
益生菌在肠道内增殖往往会竞争性的争夺生态位与营养物质,这种竞争作用增强了益生菌在肠道内的增殖,并且抑制了病原菌对肠道组织的进一步侵袭[22]。Pereira等[23]研究表明,当动物肠道内营养物质稀缺时,病原菌难辨梭状芽孢杆菌在动物肠道内增殖主要是利用动物肠上皮黏液层中的黏蛋白作为营养来源,黏蛋白中的N-乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine,GlaNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是难辨梭状芽孢主要利用的物质,而对动物添加复合益生菌制剂,可以起到与病原菌竞争GalNAc和GlcNAc的作用,减少病原菌可利用的营养物质,降低病原菌丰度。相似的研究表明,在仔猪饲粮中添加约氏乳杆菌可有效抑制沙门氏菌在肠黏膜表面的黏附聚集,这可能与约氏乳杆菌的胞外多糖和表层蛋白等有关,通过竞争性抑制缓解沙门氏菌引起的仔猪腹泻,缓解动物肠道疾病症状[24]。益生菌在肠道内的定植与增殖速度,往往决定了其对于有害微生物竞争性排斥的效果,快速消耗肠道内其他微生物增殖所必须的营养物质,就能够在较短时间内阻碍动物腹泻症状的进一步加剧。
细菌黏附在动物肠道内,往往是通过细菌的一些表面蛋白与肠道黏液层上的黏蛋白结合,从而起到占据位点的作用[25],这些表面蛋白包括黏液结合蛋白、纤连蛋白结合蛋白、表层蛋白以及菌毛等,益生菌黏附在肠道后,除了会占据位点,还会诱发一系列肠道免疫反应[26]。Zegarra-Ruiz等[27]研究表明,为动物添加分段丝状细菌可黏附在小肠上皮细胞,并且诱导辅助性T细胞17(Th17)产生免疫反应,在该过程中,分段丝状细菌的黏附是激活该过程的关键步骤,伴随着免疫反应的发生,动物胃肠道内病原菌丰度下降。除此以外,沙门氏菌在动物肠道内可增加肠上皮氧合为自己营造生长环境,但一些动物肠道内的肠杆菌科可以通过占据位点,并逐渐消耗肠道内氧气以抑制肠道内沙门氏菌的增殖,通过这种方式可以使得肠杆菌科拥有更加适宜的生长空间与环境,缓解动物因病原菌引起的疾病症状[28]。
微生物在肠道内的黏附增殖往往是其发挥作用的第1步,肠道内环境复杂多变,轻微变化往往就会引起肠道内增殖的微生物群发生改变,因此加深对微生物在肠道内增殖机制的研究是有必要的。
2.3 益生菌通过产生代谢物缓解仔猪腹泻
短链脂肪酸主要由丁酸、丙酸和乙酸组成,作为肠道中最为常见的微生物代谢物,往往可在多种环节调节动物肠道疾病。有机酸一般可直接作用于细菌造成细菌死亡,但目前大多数研究聚焦于有机酸对肠道细胞的作用,在短链脂肪酸中,丁酸盐因其对细胞能量代谢和肠道稳态的作用而备受关注[32-33]。由细菌产生的丁酸盐一般有2种途径:1)丁酰辅酶A被磷酸化形成丁酰基磷酸二氢酯,随后在丁酸激酶的作用下形成丁酸盐[34];2)丁酰辅酶A通过乙酰辅酶A转移酶转移至乙酸,形成丁酸盐与乙酰辅酶A[35]。丁酸盐不仅仅可以上调肠道内免疫因子的表达,还可以作用于肠道屏障从而增强肠道屏障作用。丁酸盐作用于肠道细胞可上调黏蛋白2(MUC2)的表达从而增强黏液层对肠腔的保护能力,增加病原菌在肠道黏液层增殖难度[36]。除此以外,丁酸盐还可增加肠道紧密连接蛋白的表达,增加肠道上皮细胞通透性,以保护肠道细胞免受病原菌侵袭。
微生物代谢物种类繁多,多种代谢物的联合作用与单一代谢物相比往往能起到更加显著的效果,不同代谢物对肠道及微生物的影响不尽相同,研究并分析多种代谢物之间的协同作用对于更加立体理解微生物与肠道间的关系是有必要的。
3 益生菌通过调节肠道屏障缓解仔猪腹泻
3.1 益生菌通过调节微生物屏障缓解仔猪腹泻
益生菌进入肠道后,会增殖在肠道内的黏液层,与其他微生物抢占肠道结合位点[43]。肠道内壁充斥着黏液,这些黏液是由杯状细胞产生的黏蛋白和潘氏细胞分泌的一些免疫因子组成,黏液层的存在有助于肠上皮的修整并且能作为屏障抵御微生物的入侵。黏液层一般分为2层,紧密且微生物数量稀少的内层与松散且黏附微生物数量庞大的外层。黏液内层一般含有较高数量的抗菌肽和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)[44]。肠道内微生物一般聚集在黏液外层,增殖在黏液外层的益生菌会占据病原菌的结合位点[45],例如一些肠道微生物的菌体物质会刺激含Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)的潘氏细胞和增强再生胰岛衍生蛋白3γ(regenerating islet-derived protein 3γ,Reg3γ)的上皮表达,而Reg3γ可靶向杀死革兰氏阳性菌,通过Reg3γ表达的增加,使得原本肠道内革兰氏阳性菌定殖的区域出现空缺,有益微生物便可抢占该结合位点[46];同样,分段丝状细菌在肠黏液层增殖后与肠上皮紧密结合传递特异性因子,并通过B细胞、血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)和Th17的分化,促使肠系膜相关淋巴组织产生促炎细胞因子和抗菌肽,以此杀灭黏液层内的其他微生物,抢占结合位点[47]。
除了通过竞争作用抢占肠道内微生物结合位点以外,益生菌还可以在肠道内的增殖过程中产生包括细菌素、有机酸以及过氧化氢等代谢产物,影响并杀伤其他微生物[48-49]。其中,细菌素可作为某些肠道微生物的增殖肽,促使这些细菌获得较强的竞争优势,以此在肠道增殖中占据空间[49]。肠道菌代谢的细菌素可在肠道内起到杀伤肽的作用,它们可以通过破坏细胞膜,并使得细胞膜出现孔隙,从而造成细胞内容物外泄,同时细菌素也可以进入细胞内部,影响基因表达与蛋白质合成,抑制被侵入细菌的活动[50]。益生菌产生的有机酸同样也具有抑菌作用,益生菌产生的有机酸能够在肠腔内形成较低的pH环境,也可以进入细菌细胞膜内发挥作用,这对多种细菌都具有抑制作用。有机酸一般都具有相对疏水性,它们可以在细菌细胞膜上扩散,扩散的同时有机酸会解离并进入细胞质,降低细菌内部细胞质的pH,从而中断细菌的代谢反应[20],解离后的有机酸会不断进入细菌的细胞质,并且在细胞质内聚集,这样的聚集导致细胞渗透压增加,造成细胞外液流入细胞内,最终造成细菌死亡[51]。
3.2 益生菌通过调节黏膜屏障缓解仔猪腹泻
化学屏障由肠黏膜上皮分泌的黏液、消化液和肠腔内正常寄生细菌产生的抑菌物质组成。潘氏细胞和杯状细胞有助于维持肠上皮屏障的免疫防御功能,潘氏细胞能够产生抗菌物质,如防御素和溶菌酶等,这些抗菌物质能够破坏细菌细胞壁或细胞膜以抑制或杀死病原菌并维持肠道黏膜屏障[53-54];除此之外,由杯状细胞产生的黏蛋白也可以形成肠道保护层,用以防止病原微生物对肠上皮细胞的损害。机械屏障由黏液凝胶层、肠上皮细胞以及肠上皮细胞之间的多种连接蛋白共同构成[55]。紧密连接结构是肠上皮细胞之间主要的连接方式,该结构主要是由闭合蛋白(claudin)、闭锁蛋白(occludin)、连接黏附分子和闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)等组成,对维持肠上皮细胞完整性及调节肠道通透性具有重要作用[56]。机械屏障的结构基于完整的肠上皮细胞和上皮细胞之间的紧密连接,机械屏障可以有效防止细菌和细菌产生的内毒素损害肠道并侵入血液,肠道中的微生物和肠上皮内的免疫细胞可以在必要时调节这些屏障,通过对肠道微生物的隔离和机体的免疫调节来避免对肠道益生菌产生不必要的免疫反应[57-58]。
仔猪断奶刺激或是致病菌侵染仔猪时,都会导致杯状细胞分泌的黏蛋白减少,从而使病原菌能够进一步对肠上皮细胞造成损伤[59]。Sheikh等[60]研究表明,产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)侵染小鼠肠道后,产生的丝氨酸蛋白酶能够降解肠道内的MUC2,引起黏液层出现空洞,从而侵染肠上皮细胞引发肠道疾病,并且ETEC还会在肠道中产生表面相关的脂蛋白YghJ,YghJ也可降解包括MUC2和黏蛋白3(MUC3)在内的黏蛋白。病原菌的入侵对仔猪肠道内化学屏障具有破坏效果,而对仔猪饲喂益生菌后,能增加仔猪肠道内MUC2 mRNA的表达,并且还能激活肠道对表达F4菌毛ETEC的免疫能力,从而保护肠道黏膜屏障。同样有研究表明,为仔猪饲喂罗伊氏乳杆菌提高了猪β防御素(porcine beta defensin,pBD)2、pBD3、pBD114、pBD129在仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2中的表达,从而增加肠道黏膜内免疫因子量以抵御病原菌入侵[61]。
还有许多研究报告表明,益生菌也可通过提高claudin、occludin、ZO-1的表达从而提高肠道机械屏障对肠道的保护能力。Fu等[62]研究表明,丁酸梭菌可提高断奶仔猪肠道内claudins、occludin和ZO-1的蛋白表达量,并且还可增强TLR2-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)-核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路,提高抗炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-2的表达,从而进一步增强肠道机械屏障的保护能力。Di Vito等[63]研究也表明,添加鼠李糖乳杆菌LR32、乳双歧杆菌BL04和长双歧杆菌BB536可提高仔猪肠道内紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达,增强肠道黏膜的完整性,保护肠道免受病原菌侵害。
3.3 益生菌通过调节免疫屏障缓解仔猪腹泻
图2 肠道适应性免疫sIgA:分泌型免疫球蛋白A secretory immunoglobulin A;BAFF:B细胞活化因子 B cell activating factor;APRIL:增殖诱导配体 a proliferation-inducing ligand;TSLP:胸腺基质淋巴细胞生成素 thymic stromal lymphopoietin;IL:白细胞介素 interleukin;TGF-β:转化生长因子-β transforming growth factor-β;IgA:免疫球蛋白A immunoglobulin A;iTreg:诱导型调节性T细胞 induced regulatory T cell;RA:维甲酸 retinoic acid;TH:辅助性T细胞 helper T cell;IFN-γ:干扰素-γ interferon-γ。 Fig.2 Intestinal adaptive immunity |
在仔猪免疫系统发育的初级阶段,益生菌的添加可以帮助仔猪建立适应益生菌的免疫系统。仔猪肠道在遭遇微生物入侵后,肠上皮细胞可表达TLR2、TLR3、TLR4和TLR5并且分泌细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-15、IL-8等,帮助仔猪建立初次免疫。例如,饲喂大肠杆菌Nissle 1917可提高断奶仔猪空肠黏膜的免疫参数,包括下调血清IL-8、TNF-α、IL-17和IL-12含量,以及提升TLR9和TLR3的表达,帮助仔猪增强对病原菌的免疫力[67]。Yang等[68]研究也表明,饲喂仔猪植物乳杆菌可能通过下调丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)表达和NF-κB途径,抑制病原菌引起的炎症和炎性细胞因子IL-8和TNF-α表达,并且可减弱大肠杆菌感染下的IL-8和TNF-α上调。仔猪免疫建立后,添加益生菌可改善病原菌侵染导致的免疫失调。例如,饲粮添加罗伊氏乳杆菌可通过芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路刺激T细胞分泌IL-17,以此减轻肠道炎症并且增强免疫能力[69]。同样,对仔猪饲喂分段丝状细菌后,分段丝状细菌在仔猪肠道黏膜的黏附会刺激上调SAA含量,进而促进CD11c+树突状细胞产生IL-6和IL-23,并随后诱导Th17分化,提升仔猪免疫应答能力,改善肠道的免疫失调[70]。
益生菌自身或产生的代谢物都能在一定程度上对肠道的免疫细胞及肠上皮细胞发育产生影响,当益生菌通过黏液屏障与肠道细胞产生接触后,肠上皮细胞和树突状细胞识别细胞表面受体所传递的信号,通过微生物相关分子模式(microbe-associated molecular patterns,MAMPs)进一步汇集B细胞与T细胞,在B细胞与T细胞的作用下使得隐斑发育为成熟的肠上皮细胞,肠上皮细胞在T细胞的作用下可产生分泌IgA的浆细胞至固有层[71-72]。微生物同样可借由M细胞进入派氏淋巴结(Peyer’s patches,PP),随后PP内所带有的树突状细胞与淋巴细胞便会获取微生物信息,从而诱导T细胞分化以及与T细胞相关的B细胞成熟,增强动物的肠道免疫屏障功能,同时PP还会借由T细胞的分化从而产生分泌特定IgA的浆细胞至固有层,这些浆细胞可将二聚体IgA分泌至肠腔以对微生物产生免疫作用[73]。
总体而言,在肠道免疫屏障方面,益生菌通过触发一系列免疫防御机制来预防并减轻仔猪腹泻,包括促进肠道免疫细胞的分化,促进sIgA和细胞因子的产生。从益生菌对断奶仔猪肠道免疫屏障调控作用的研究现状来看,益生菌在仔猪腹泻的防治中也发挥着重要作用。益生菌及其代谢产物可作为免疫激活剂,激活断奶仔猪的免疫系统,帮助仔猪建立适应性免疫,增强仔猪对病原菌的抵抗力,从而预防仔猪腹泻,此外,益生菌也可保护肠道免受病原菌引起的相关炎症损害。因此,使用益生菌帮助仔猪建立适应性来预防仔猪腹泻,能够产生较好的效果。
4 益生菌通过作用于肠道细胞缓解仔猪腹泻
4.1 益生菌通过影响细胞炎症通路缓解仔猪腹泻
当仔猪遭受病原菌入侵并诱发腹泻症状时,肠道内细胞的炎症通路往往会由于病原菌的刺激而激活,诱发肠道出现炎性症状,在炎症反应的发生过程中,一系列复杂的调节网络均会被激活,其中涉及促炎性细胞因子、促炎性细胞因子释放细胞以及促炎性细胞因子靶细胞[74]。各种炎性细胞因子由专门的免疫细胞产生,尤其是巨噬细胞、肥大细胞及一些存在于局部组织中的免疫细胞,这些细胞因子在炎症反应中具有各自的功能,按功能分类可分为促炎细胞因子,如IL-1、IL-6、IL-15、IL-17、IL-23、TNF-α、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ);抗炎细胞因子,如IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)。肠道细胞表面的TLR、NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)以及维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(retinoic acid-inducible gene Ⅰ-like receptor,RLR)家族是肠道细胞感应肠道内病原体并诱发免疫反应的主要效应器[75]。目前,已知的一些致病性或内源毒性物质与这些受体结合便可激活下游的多种细胞信号通路,从而释放出大量促炎介质。这些受体中,TLR家族可识别细菌、真菌、病毒,NLR家族识细菌,而RLR家族一般识别病毒,这些免疫受体对保护宿主肠道细胞免受细菌、真菌、病毒的侵害以及缓解肠道细胞被侵袭的应激状态具有至关重要的作用。
益生菌一般在肠道内会被TLR识别菌体本身及其代谢物,随后便会激活下游信号通路,包括MyD88、白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associated kinase,IRAK)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)、转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1,TAK1)、转化生长因子-β激活激酶结合蛋白1(transforming growth factor-β activated kinase binding protein 1,TAB1)和转化生长因子-β激活激酶结合蛋白2(transforming growth factor-β activated kinase binding protein 2,TAB2);TLR信号转导中一般涉及MyD88依赖性和MyD88非依赖性2种方式,TLR3和TLR4均可与TIR结构域衔接蛋白(TIR domain containing adaptor protein,TIRAP)和TIR结构域衔接分子(TIR domain containing adaptor molecule,TRIF)相互作用,并不依赖于MyD88转导细胞信号[76]。而依赖MyD88的TLR信号转导一般通过招募激活MyD88衔接分子促进IRAK4和IRAK1磷酸化,而部分益生菌可减少TLR对MyD88的激活作用从而调节下游的免疫因子信号,减轻肠道细胞的应激状态及炎症反应[77-78]。而磷酸化的IRAK4和IRAK1会进一步使IRAK1与TRAF6相互作用,在这一过程中,一些益生菌会在一定程度上减少TRAF6的表达量,从而减少最终产生的炎性因子数量,缓解炎症症状[79]。IRAK1与TRAF6形成的复合物可使TAK1和TAB2磷酸化,TAK1被证明可与核因子-κB抑制因子激酶(inhibitor of nuclear factor-kappa B kinase,IKK)形成复合物,从而激活NF-κB转录因子,促进炎性细胞因子产生,绝大多数能够改善肠道炎症症状的益生菌都能够减少炎性信号通路对NF-κB转录因子的激活,从而中断炎性信号通路,减轻细胞炎症反应[80⇓-82]。
除TLR外,NLR也可识别细菌从而传递炎性信号,NLR分布于动物机体内多种组织细胞中,包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、小肠树突状细胞和潘氏细胞[83]。研究表明,细菌的特定组分可激活NOD1和NOD2,随后通过半胱天冬酶募集结构域(Caspase recruitment domain,CARD)-CARD相互作用招募受体相互作用蛋白(receptor interaction protein,RIP),从而激活NF-κB和MAPK信号通路,促进炎症反应;益生菌的使用在一定程度上可抑制由病原菌引起的NOD1、NOD2的激活,调节细胞应激,终止炎症反应[84]。此外,大量NLR可形成炎性小体,对IL-1β、IL-18、IL-33和其他促炎细胞因子产生影响,并参与天然免疫系统的激活,目前有相当多的研究表明,益生菌对减少炎性小体的形成具有一定作用,尽管作用方式不尽相同,但都能在一定程度上抑制炎症通路,减轻在炎症反应的发生[85⇓⇓-88]。
4.2 益生菌通过影响细胞凋亡缓解仔猪腹泻
细胞凋亡一般有2条途径,包括外源性途径和内源性途径。内源性途径主要通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活半胱天冬酶(Caspase),这些活化的Caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞的凋亡。而外源性凋亡途径主要由细胞表面的死亡受体结合细胞外配体引发细胞凋亡,通过Caspase-8传递凋亡信号,而一些肠道内微生物可作用于此步骤,抑制Caspase-8向下游传递信号,当Caspase-8被抑制时,则可能发生坏死性凋亡[89]。引发细胞外源性凋亡的配体和死亡受体包括凋亡相关因子配体(factor-related apoptosis ligand,FASL)与凋亡相关因子(factor-related apoptosis,FAS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)或淋巴毒素-α(lymphotoxin-α,LT-α)与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、肿瘤坏死因子样细胞因子1A(tumor necrosis factor-like cytokine 1A,TL1A)与死亡受体3(death receptor 3,DR3)以及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor,TRAILR)[90]。除死亡受体外,细胞外源性凋亡同样可被TLR3、TLR4等受体激活,其中TLR3可被双链RNA激活,TLR4则被细菌细胞壁LPS成分激活,TLR3、TLR4信号一般主要激发炎性信号通路,但当细胞暴露于某些死亡配体或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)且受到刺激时,这些刺激一旦作用在炎性信号转导的关键信号组件上,TLR3、TLR4信号则可将下游基因信号的表达由炎性转变为外源性凋亡或坏死[91]。
细胞外配体与细胞膜表面受体的结合,往往是激活细胞凋亡的初始信号。TNF可通过与细胞表面的肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)结合激活MAPK和NF-κB通路,加重肠道内炎症情况,这一结合同样也会诱导细胞凋亡从而进一步促进肠道炎症症状。肠道内的炎症一般会导致较多数量的细胞死亡,但这种细胞死亡在肠道损伤的初期一般难以出现,这主要是由于细胞死亡后释放产生的细胞内成分虽然可与周边的细胞表面受体结合,诱导周边细胞的促炎性基因表达;但即使TNFR1被激活,也需要通过多个关键信号节点才可使细胞死亡,这其中包括IKK、NF-κB、Caspase-8这3个节点,当这些信号节点都被激活时,细胞死亡才会发生[92]。而益生菌一般可抑制细胞内的NF-κB和Caspase-8信号转导,从而起到减少炎性细胞因子表达,中断细胞凋亡信号[93⇓-95]。肠道内微生物对细胞凋亡的影响目前已有较多研究,但其主要作用的物质及对应靶点尚不清晰,相对应的具体机制仍需进一步探索。
不同于TNF与TNFR1结合诱导的细胞凋亡信号,FASL和TRAIL在分别与死亡受体FAS、TRAILR1或TRAILR2结合后,都可形成死亡诱导信号复合体(death-inducing signaling complex,DISC),DISC中包含有带有死亡结构域的Fas结合蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)和Caspase-8酶原,而Caspase-8酶原可以形成具有活性的Caspase-8以此引发下游的凋亡反应,在这一过程中,益生菌的一些表面成分或代谢物能够中断Caspase-8的激活,从而抑制细胞的凋亡[96]。这种抑制作用往往需要益生菌直接接触或通过代谢物接触肠道细胞,与肠道细胞表面的受体产生作用后才能够实现,因此只有在肠道黏液屏障被破坏,细胞直接暴露于肠道内微生物环境时才可能发生。因此,益生菌的使用,如果能在仔猪早期还未出现腹泻症状时直接或间接与肠道细胞接触,这样对于预防仔猪腹泻病症的作用有可能会更加有效。
5 小结
虽然益生菌对断奶仔猪腹泻能够产生一定改善缓解效果,但是益生菌的整体作用往往受到菌株的性质、试验整体的设计、益生菌作用持续时间以及试验对象健康状况、生理机能、肠道内益生菌输送时间和其他环境因素等的影响。为消除这些影响因素,提高菌株的益生效果,需要不断挖掘安全高效的益生菌株,并进一步开展动物试验,采用多组学分析技术结合使用,探索益生菌对动物的各种生物代谢与系统循环的作用机制,从而不断开发和获得更多的功能性益生菌,降低畜禽发病率,提高养殖效益,为人类提供更加安全和健康的畜产品。
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