禽大肠杆菌病是指由一些特定血清型如O1、O2、O35、O78等的禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)感染所引起的局灶性和全身性感染的疾病。禽大肠杆菌病在全球范围内均有发生,不同日龄、品种的鸡全年均有可能感染此病,空气、水、饲料和相关器械均能成为该病的传播介质,禽大肠杆菌病粗略估计每年给全球家禽业造成约数亿美元的经济损失[1]。因此,禽大肠杆菌病的综合有效防控是养鸡业面临的重大挑战。
1 禽大肠杆菌病的特征及其危害
禽大肠杆菌病是一种条件性疾病,经常因合并感染(如鸡新城疫、禽流感H9N2、传染性支气管炎、败血性支原体等)或过度接触不良环境条件(如鸡舍内氨气、二氧化碳等有毒有害气体浓度过高、鸡舍粉尘浓度过高、鸡舍通风不良、鸡舍卫生太差或冬季鸡低温应激等)而感染,感染途径一般为黏膜、消化道和呼吸道,受损的宿主防御系统表现出不同发病症状,如大肠杆菌败血症、脐炎、卵黄性腹膜炎、上呼吸道炎、肠炎、全眼球炎、纤维素性气囊炎、肝周炎和心包炎、肿头综合征、蜂窝织炎、关节炎、滑膜炎、脑炎、大肠杆菌肉芽肿、卵黄性腹膜炎和输卵管炎等。雏鸡早期感染APEC多表现较高的感染率和死亡率;肉鸡感染APEC则生长缓慢,腹泻,逐渐脱水消瘦死亡;产蛋鸡感染APEC多表现零星死亡、产蛋率下降和蛋品质降低[2]。APEC易变异、血清型多、各血清型之间抗原性差异大,限制了疫苗的研发和应用。在没有减少和禁止抗生素在养殖领域的使用前,抗生素在预防和治疗APEC感染和发病中发挥了重要作用。然而,研究表明,正是这些抗生素的应用加速了多重耐药细菌的出现[3]。据报道,在中国耐受头孢菌素类抗生素的禽大肠杆菌菌株的流行率约为66.1%[4]。Bastidas-Caldes等[5]对1 278项有关大肠杆菌黏菌素耐药基因的研究进行了荟萃分析,发现耐黏菌素大肠杆菌在世界范围内的流行率为6.51%,鸡作为耐黏菌素大肠杆菌感染的主要宿主感染率高达15.8%。另外,研究发现,APEC存在人畜共患的风险,耐药菌可通过食物链传播给人类,对人类健康造成严重威胁。因此,研发有效控制APEC感染的抗生素替代物或饲用抗生素替代物已经成为家禽科学的重要研究课题。本文重点综述了饲用抗生素替代物在预防和控制APEC感染中的作用效果和作用机制。
2 禽大肠杆菌病非抗生素物质防治研究进展
2.1 有机酸
有机酸按照碳原子的数量分为短链、中链和长链脂肪酸,研究发现短链和中链脂肪酸具有很好的抗菌功能[6]。Emami等[7]在雄性罗斯肉鸡7日龄时使其感染APEC[口服1 mL大肠杆菌K88(1×108 CFU/mL)],通过在饲粮中添加复合有机酸(甲酸和丙酸及其盐类),显著提高了其生长性能和免疫功能,并刺激了肠黏膜的生长,促进了肠绒毛的发育,改善了回肠形态,增加了盲肠中乳酸菌数量,减少了大肠杆菌的数量。Peng等[8]以1日龄雄性海兰褐鸡为试验动物,攻毒前5 d在饮水中添加100 mmol/L的乙酸钠,然后经气管内接种APEC_O78(2×109 CFU/mL),结果发现乙酸钠可使游离脂肪酸受体2(free fatty acid receptor 2,FFAR2)在肺脏组织中的表达量升高,肠道菌群代谢所产生的醋酸盐在APEC感染过程中发挥了保护介质的作用,显著抑制APEC感染引起的肺部炎症反应,降低因APEC感染造成的气血屏障通透性升高。Warsito等[9]以28周龄的ISA褐系蛋鸡为试验动物,通过口服1×108 CFU/mL大肠杆菌分离株,使蛋鸡感染APEC,并连续4周在饮水中添加柠檬酸-葡萄糖(每3.75 L饮用水添加1 g柠檬酸-葡萄糖),柠檬酸-葡萄糖可通过降低肠道pH,提供能量,创造肠道酸性环境,有利于乳酸菌的生长,抑制大肠杆菌的增殖,进而提高APEC感染蛋鸡的产蛋量,改善饲料转化效率。以上研究表明饲粮中添加有机酸能提高APEC感染鸡的生长性能,刺激肠黏膜生长,增强肠道免疫屏障,减轻大肠杆菌引起的肠道损伤,维持肠道菌群的稳定,促进有益菌如乳酸菌的增殖。Roth等[10]在1日龄罗斯708肉鸡饲粮中添加2 g/kg的有机酸复合剂(400 mg/kg甲酸、200 mg/kg乙酸、100 mg/kg丙酸和50 mg/kg肉桂醛复合物),在试验第1天灌胃0.1 mL APEC_X-7122 (4×106 CFU/mL),APEC_X-7122对氨苄西林、头孢氨苄和萘啶酸具有耐药性,结果表明添加有机酸复合剂不会增加肉鸡盲肠中耐抗生素大肠杆菌的丰度;除此之外,Roth等[11]的另一项研究发现,在1日龄罗斯308肉鸡饲粮中添加短链脂肪酸(400 mg/kg甲酸、200 mg/kg乙酸、100 mg/kg丙酸)和50 mg/kg肉桂醛复合物,与对照组相比,能提高肉鸡的生长性能,降低盲肠中耐氨苄西林和四环素的大肠杆菌数量。这些研究结果表明有机酸可以作为抗生素替代品在不增加抗药性大肠杆菌数量的情况下治疗禽大肠杆菌病。
2.2 植物提取物
植物精油(essential oils,EOs)是研究最多的植物提取物之一,作为植物产生的次生代谢产物,具有很高的抗菌活性,可作为动物生产中抗生素的潜在替代品。Peñalver等[15]的体外研究表明,牛至精油对家禽源大肠杆菌菌株具有很高的抗菌活性,这种有效的抗菌活性可归因于植物精油中的2种主要活性成分:百里香酚和香芹酚。胡永涛等[16]在1日龄雄性海兰鸡饮水中添加1/2 000的2.5%牛至油乳液,通过肌肉注射0.2 mL大肠杆菌(4×109 CFU/mL)感染APEC,结果表明牛至油能在不影响鸡只增重的条件下,降低海兰鸡的死亡率,且其效果较卡那霉素更佳。此外,大肠杆菌对迷迭香精油敏感,迷迭香提取物对缓解大肠杆菌感染造成的氧化损伤和肠道黏膜损伤具有重要作用。研究表明,饲粮中添加400 mg/kg的迷迭香提取物能提高口服感染大肠杆菌K88(1×109 CFU/mL)肉鸡血清中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶活性(catalase,CAT)活性与总抗氧化能力,并降低回肠隐窝深度,提高绒隐比,缓解肉鸡肠道和肝脏损伤[17]。Ding等[18]在30周龄雄性白来航鸡饲粮中添加400 mg/kg八角茴香油,在试验第15~27天,每隔1 d口服1 mL大肠杆菌O1(0.5×104 CFU/mL),饲粮中添加八角茴香油提高了白来航鸡血清和肝脏中GSH-Px、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、CAT活性以及核因子E2相关因子2(nuclear factor -E2-related factor 2,Nrf2)基因的表达,降低了丙二醛的含量,进而增强了鸡对APEC感染引起的氧化应激的抵抗能力。由此可见,植物精油可通过增强体内抗氧化酶的活性来提高感染肉鸡的抗氧化能力,并缓解大肠杆菌引起的肠道和肝脏损伤。大蒜油与头孢喹诺联合使用对大肠杆菌具有很好的抗菌作用,大蒜油可增强大肠杆菌对头孢喹诺的敏感性,提示大蒜油可能是一种潜在的抗生素增强剂[19]。肉桂醛及其衍生物通过降低LuxR蛋白的DNA结合能力,干扰大肠杆菌中基于AI-2的群体感应系统,对大肠杆菌具有很高的抑菌活性,大肠杆菌对肉桂醛耐受性的增加会降低对抗生素的耐受能力,表明肉桂醛的使用可降低肠道中耐抗生素大肠杆菌的数量[20-21]。丁香酚作为丁香油的重要成分,具有抗氧化、抗菌和抗炎特性。Ibrahim等[22]在1日龄肉鸡饲粮中添加400 mg/kg丁香酚纳米乳,可提高口服感染APEC_O78(0.5 mL,3×108 CFU/mL)肉鸡的体增重、采食量、存活率和饲料转化率,调节细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6、IL-8和IL-10的表达,降低炎症反应,并上调消化酶基因(Amy2a、Cck、Cela1和Pnlip)的表达以及下调大肠杆菌毒力基因的表达,增加盲肠乳杆菌的相对丰度,减少肠杆菌科和拟杆菌科的数量。Bo等[23]给1日龄雄性黄羽肉鸡口服10 mg/kg茶树油纳米脂质体,并通过肌肉注射0.5 mL 4×109 CFU/mL大肠杆菌0419P1B1构建APEC感染模型,研究发现口服茶树油纳米脂质体可减轻感染肉鸡的机体损伤和肠道病变,降低感染肉鸡十二指肠和盲肠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)和核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的表达,对预防APEC感染具有很好的作用。除此之外,体外试验证明薰衣草精油对大肠杆菌也具有抗菌活性,其发挥抗菌作用的化学物质是芳樟醇[24]。肉桂皮油和生姜精油对大肠杆菌也具有很强的抗菌活性,肉桂皮油的应用引起了大肠杆菌细胞壁的有害变化,生姜精油可破坏细菌细胞膜[25-26]。总之,植物精油成分复杂,但各组分对大肠杆菌的抑制存在协同作用,有研究总结了植物精油的抑菌机制:破坏细菌细胞膜完整性和通透性;抑制细菌生物膜形成,消除细菌耐药性;影响细菌群体感应通路;抑制鞭毛合成,阻断鞭毛运动;破坏柠檬酸循环,干扰细胞的代谢活动,包括氨基酸代谢、能量代谢、核酸代谢、脂质代谢等[27]。在饲粮中添加适量植物精油能预防APEC感染,并提高感染鸡的生长性能、抗氧化和免疫功能,减轻肠道损伤,维持肠道菌群的稳定。
植物多酚在治疗APEC感染中也有诸多应用。Dakheel等[28]的体外试验表明,从红豆杉叶、天麻叶和刺槐叶中提取的浓缩单宁通过抑制大肠杆菌的游动、群集运动以及生物膜的形成,进而抑制大肠杆菌的增殖。单宁的抗大肠杆菌或其他细菌活性可能与它对酶的络合作用和“铁剥夺”,进而抑制病原菌的代谢有关[29]。石榴皮含有大量高浓度的酚类化合物,包括单宁(即石榴苷、石榴苷、鞣花酸和没食子酸)、黄酮等。Xu等[30]在1日龄817肉鸡饲粮中添加0.2%的石榴皮,在第14~21天通过每天口服1 mL APEC_O78(5×108 CFU/mL)构建APEC感染模型,研究表明感染APEC的鸡盲肠中拟杆菌门的相对丰度降低,厚壁菌门的相对丰度提高,添加石榴皮使肉鸡体重、平均日增重和绒隐比增加,还能调节肠道菌群组成,使肠道菌群维持在对宿主有利的状态,减少肠道菌群结构的异常变化。白藜芦醇通过调节双组分系统中的蛋白质水平,尤其是趋化蛋白质的水平来抑制大肠杆菌生物膜的形成[31]。Mohebodini等[32]在1日龄肉鸡饲粮中添加600 mg/kg白藜芦醇,在第7天口服1 mL 1×108 CFU/mL大肠杆菌PTCC 1399,与阴性对照组相比,饲粮中添加白藜芦醇能提高感染肉鸡的体增重,降低饲料系数和盲肠中大肠杆菌数量,改善肠道形态,降低丙氨酸转氨酶活性,提高血清中SOD的活性和免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)的含量,增强肉鸡的抗氧化和免疫能力。芦荟因含有黄酮、单宁、甾醇等生物活性物质而对大肠杆菌具有抑制作用。Kumari等[33]在科宝肉鸡饮水中添加芦荟叶凝胶提取物(20 mL/L水),在8日龄腹腔注射0.5 mL含1×107 CFU大肠杆菌O78的生理盐水,与对照组相比,添加芦荟叶凝胶提取物通过提高血清中GSH-Px和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性以及大肠杆菌特异性抗体滴度和淋巴细胞刺激指数增强感染肉鸡抗氧化和抗APEC感染的能力。
此外,生物碱在治疗APEC感染中也取得了诸多进展。张玥等[34]在14日龄苏新1号蛋鸡公雏饲粮中添加3%博落回生物碱(原阿片碱、别隐品碱和血根碱),通过气管接种0.5 mL APEC_O78使其感染APEC,与阳性对照组相比,添加博落回生物碱能降低雏鸡的死亡率,提高料重比。Kumari等[35]在1日龄科宝肉鸡饮水中添加20%苦参根提取物,通过腹腔注射0.5 mL APEC_O78(1×107 CFU/mL)建立APEC感染模型,添加苦参根提取物能降低肉鸡的死亡率,提高血清中SOD、CAT、GSH-Px和GST活性,降低丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激酶活性,减轻心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏的病理损伤。
复合中药配方也对APEC感染具有较好的治疗效果。宇凌[36]在1日龄恒立510肉鸡饲粮中添加0.5%玉屏白头超微粉(黄芪、白术、防风、白头翁、川黄连、黄柏、秦皮、甘草),通过肌肉注射0.3 mL大肠杆菌O18(4.5×109 CFU/mL)使其感染APEC,研究发现玉屏白头超微粉可提高肉鸡的存活率,促进免疫器官(胸腺、法氏囊、脾脏等)的生长发育,增强B细胞和T细胞的免疫功能,进而提高其体液免疫和细胞免疫的能力。Song等[37]在1日龄雄性海兰褐鸡饲粮中添加1 g/kg小柴胡汤剂(柴胡∶黄芩∶半夏∶党参∶生姜∶红枣=5∶2∶2∶2∶2∶2),并通过胸肌注射0.4 mL APEC_O78(1×108 CFU/mL)构建APEC感染模型,研究发现饲粮中添加小柴胡汤可提高感染鸡的存活率,改善感染鸡的临床症状,降低脏器指数和脏器细菌负荷,抑制血清和肺中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。Farouk等[38]报道,在给科宝肉鸡鼻腔接种4×106 CFU/mL APEC_O78菌株的同时在饲粮中添加0.5%的葫芦巴提取物,降低了感染肉鸡的死亡率、血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性以及促炎细胞因子IL-6含量,增加了肉鸡血清中IgG含量,并通过改善肉鸡的整体健康状况来减轻大肠杆菌感染对肉鸡生长性能和组织的不利影响。
植物提取物也可与其他物质配合使用来防治APEC感染。Pham等[39]在通过气管注射0.5 mL APEC_O78菌株(1×106 CFU/mL)感染APEC的雄性爱拔益加(AA)肉鸡饲粮中添加500 mg/kg包被精油和有机酸(含4%百里香、4%香芹酚、0.5%己酸、3.5%苯甲酸、0.5%丁酸)混合物(EOA),可提高肉鸡的饲料转化率,降低病变评分和盲肠中大肠杆菌数量,提高肠杯状细胞数量和血清中IgG含量,并有降低血清中IL-12含量的趋势,对气管内感染APEC_O78的肉鸡产生轻微的健康改善作用,总之,补充EOA可以轻度减轻大肠杆菌引起的肠道损伤和炎症。张玥[40]将生物碱与姜黄粉、黄芩提取物配合(博黄姜),给14日龄苏新1号蛋鸡公雏按照每天每100 g体重1 mL的剂量口服博黄姜,通过胸肌注射0.5 mL 7.5×108 CFU/mL APEC_O78菌株感染APEC,与阳性对照组相比,添加博黄姜能降低雏鸡的死亡率,且其效果优于金霉素治疗。
上述研究表明,植物提取物在预防、治疗和控制APEC感染方面具有积极作用,且在与其他替抗物质配合使用时效果更佳,可以考虑更多的配合方案,例如与有机酸、益生菌和益生元等配合使用。但多数植物提取物的潜在作用机制尚不清楚,需要更深入的研究。
2.3 噬菌体
噬菌体广泛存在于土壤、空气和水中,是地球上丰度最大、种类最多的生物,是能感染的细菌、真菌、放线菌或螺旋体等多种微生物的病毒[41]。溶解性噬菌体是无害的病毒,它们可以在宿主体内自我复制,并在摧毁目标细菌时增加自身数量[42]。Lau等[43]在1日龄罗斯肉鸡饮水中添加1010 PFU/mL噬菌体EC1,然后通过气管注射感染APEC_O78(109 CFU/mL),发现在饮水中添加噬菌体EC1能降低肉鸡肝脏、心脏和脾脏中大肠杆菌载量和死亡率(由83.3%降至13.3%)。Tang等[44]通过肌肉注射0.1 mL APEC_SD-C888(1.5×107 CFU/mL)使7日龄哈伯德肉鸡感染APEC,在攻毒后2 h肌肉注射噬菌体CE1(108 PFU/mL,0.1 mL),噬菌体CE1对大肠杆菌具有较高的杀菌活性,对APEC攻毒的肉鸡具有良好的保护作用。通过口服给药的方式对T4样大肠杆菌噬菌体(107 PFU/mL)负载壳聚糖纳米粒(C-ΦKAZ14 NPs)在1日龄气管内注射感染APEC(O1:K1:H7,109 CFU/mL)科宝500肉鸡中的作用效果进行了评估,C-ΦKAZ14 NP处理降低了肉鸡的死亡率和排便率以及大肠杆菌肠道定植率,改善了鸡的临床体征和症状,使鸡的体重增加[45]。除了采用单一噬菌体治疗外,利用噬菌体混合物治疗APEC感染能取得更佳的效果。Huff等[46]通过喷雾和肌肉给药2种方式评估了噬菌体混合物SPR02和DAF6对APEC(O2,6×104 CFU/mL,气囊注射)感染肉鸡的作用,在大肠杆菌攻毒前3 d用噬菌体处理可显著降低肉鸡的死亡率(由40%降至3%),同样,在攻毒后24 和48 h用噬菌体处理也降低了肉鸡的死亡率(由55%降至20%以下),噬菌体可通过识别细菌表面的特定附着位点吸附到细菌上,将核酸(DNA或RNA)注射到细菌中,在细菌中实现复制,导致细菌裂解死亡。Oliveira等[47]通过口服或喷雾给药的方式给予口服感染APEC_O78的罗德岛红蛋鸡噬菌体混合物(含3种噬菌体:phi F78E Myoviridiae、phi F258E Siphoviridae和phi F61E Myoviridae),研究发现,噬菌体混合物中添加109 PFU/mL的phi F78E Myoviridiae可使鸡的死亡率和发病率分别降低25%和43%,低滴度噬菌体混合物(107 PFU/mL)在不超过3周的时间内能显著降低感染APEC鸡的死亡率;同样,对感染APEC_O78和APEC_O2(108 CFU/mL,静脉注射)的1日龄日本鹌鹑,通过肌肉注射给药的方式给予另一种噬菌体混合物(TM1、TM2、TM3和TM4,1010 PFU/mL)降低了鹌鹑的死亡率(由46.6%降至13.6%)、肺脏中大肠杆菌负荷以及肺脏、肝脏和心脏中APEC引起的病变,且噬菌体之间可能存在协同作用,混合使用的治疗效果更佳[48]。总之,噬菌体是治疗禽大肠杆菌病的有效手段,但因其使用过程中的诸多限制,在实际应用中有待深入挖掘。
2.4 益生菌
2.4.1 乳酸杆菌
多种乳酸杆菌对APEC感染具有防治作用。乳酸杆菌的抗菌作用通常归因于细菌素的分泌或有机酸的产生。Ding等[51]的研究表明,口服感染APEC_O78(1×108 CFU/mL)的1日龄AA肉鸡,与口服感染APEC_O78组相比,基础饲粮中添加植物乳杆菌15-1在第14天和第21天降低了肉鸡血清中二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)含量;在基础饲粮补充植物乳杆菌15-1和果寡糖提高了肉鸡血清中IgA和IgG含量以及盲肠中短链脂肪酸含量,减轻了APEC_O78造成的损伤,增强了免疫应答能力。Wang等[52]的试验结果表明,对口服感染APEC_K88(1 mL,2×108 CFU/mL)的AA肉鸡,在基础饲粮中添加植物乳杆菌B1(2×109 CFU/kg)可显著提高回肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)含量和盲肠中乳酸杆菌数量,并降低盲肠中大肠杆菌数量和回肠中IL-2、IL-4、γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、TNF-α含量,提高肉鸡的生长性能。Kathayat等[53]研究显示,给1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)来航鸡口服鼠李糖乳杆菌GG(108 CFU/鸡)可显著减少因口服APEC_O78(7.5×107 CFU/只)而感染APEC鸡盲肠中大肠杆菌的定植,降低盲肠中变形菌门的丰度,尤其是肠杆菌科的丰度,调节由APEC引起的鸡盲肠微生物群落的改变。Wu等[54]在1日龄雄性科宝肉鸡饲粮中添加嗜酸乳杆菌(5×108 CFU/kg),通过口服大肠杆菌KO157(0.5 mL,3×108 CFU/mL)感染APEC,结果发现添加嗜酸乳杆菌能增加肉鸡的体重、平均日增重、平均日采食量以及空肠和回肠的绒隐比,降低大肠杆菌攻毒肉鸡的死亡率以及血清中C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、DAO和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)含量,上调空肠和回肠紧密连接蛋白mRNA表达,下调空肠诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、IL-8和IL-1β mRNA表达。杨楠[55]在1日龄黄羽肉鸡饲粮中添加4%嗜酸乳杆菌冻干粉(≥1×108 CFU/g),通过口服大肠杆菌O1(1.5×109 CFU/只)感染APEC,添加嗜酸乳杆菌冻干粉可以增加肉鸡肠道肠胶质细胞的数量以及感染鸡肠道黏膜层IL-1β、IL-2和IFN-γ的表达,嗜酸乳杆菌在感染过程中发挥了免疫增强的作用。
2.4.2 芽孢杆菌
芽孢杆菌能产生细菌素和抗菌肽等活性物质,具有良好的抗菌活性,对抑制大肠杆菌的增殖具有重要作用[56]。有关芽孢杆菌的报道目前主要集中于枯草芽孢杆菌。La Ragione等[57]的研究表明,在胃内插管灌服大肠杆菌O70∶K80(1×105 CFU/mL),攻毒前24 h通过口服给予1日龄白来航鸡2.5×108 枯草芽孢杆菌PY79hr孢子,可显著减少大肠杆菌O78∶K80在盲肠和深层组织中的定植。肖建根[58]通过灌服大肠杆菌(1×108 CFU/mL)让肉鸡感染APEC,在饲粮中添加枯草芽孢杆菌PB6(107 CFU/kg)后,能显著提高肠道内乳酸杆菌数量,降低感染APEC肉鸡的死亡率,提高肉鸡的生长性能。徐丽娜等[59]给20日龄罗斯肉鸡灌喂1mL枯草芽孢杆菌E-8(1×108 CFU/mL),通过口服产肠毒素大肠杆菌(1×108 CFU/mL)感染APEC,发现灌喂枯草芽孢杆菌E-8可明显抑制大肠杆菌导致的腹泻,提高感染肉鸡的饲料利用率和机体免疫力,同时提高感染肉鸡血清中IgA、IgG和十二指肠黏膜中IL-2、sIgA含量以及十二指肠的绒毛高度和绒隐比,小肠绒毛形态得到一定程度的修复。在口服大肠杆菌K88(2×109 CFU/mL)感染APEC的7日龄雄性罗斯肉鸡饲粮中添加木聚糖双芽孢杆菌ysm1(1×109 CFU/kg)能使空肠黏膜中sIgA含量升高,盲肠大肠杆菌数量减少,木聚糖双芽孢杆菌ysm1可通过调节肠道形态、增强免疫反应和减少盲肠内大肠杆菌数量来提高肉鸡的生长性能[60]。芽孢杆菌还可以与其他物质配合使用治疗APEC感染。谢全喜等[61]将枯草芽孢杆菌B7348(2×109 CFU/g)与鼠李糖乳杆菌发酵的中草药混合,在感染大肠杆菌(大肠杆菌O1、O2、O26和O78等比例混合,1 mL,1×1010 CFU/mL)的黄羽肉鸡饲粮中添加1%的该复合物,可使脾脏和法氏囊正常发育,肠道有益菌数量增加,抑制大肠杆菌的繁殖,促进盲肠中sIgA和IL-2的表达,减少抗炎因子IL-6的释放,进而增强肉鸡的免疫力,使死亡率下降。Liang等[62]将枯草芽孢杆菌(1×106 CFU/kg BW)与嗜酸乳杆菌以及蒲公英、黄芪提取物混合,在1日龄雌性中国黄肉鸡饮水中添加,饲喂7 d后通过颈部皮下注射大肠杆菌O78(0.4 mL,1×108 CFU/mL)构建APEC感染模型,发现添加该复配物能提高肉仔鸡体增重,降低腹泻率和死亡率,缓解肠道和肝脏病理改变,增加IL-2和IL-10 mRNA的表达,抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的mRNA表达。此外,除了枯草芽孢杆菌之外,由解淀粉芽孢杆菌R3产生的具有氨基酸和羟基脂肪酸的生物表面素对多重耐药的APEC也具有广谱的抗菌活性[63]。
2.4.3 其他菌株
黄丽卿等[64]在1日龄雌性罗斯肉鸡饲粮中添加200 mg/kg屎肠球菌(8.2×1012 CFU/kg),通过气囊接种禽大肠杆菌O78(0.2 mL,1×104 CFU/mL),发现添加屎肠球菌可提高肉鸡的体重,降低感染肉鸡的死亡率,屎肠球菌通过调节肠道菌群结构和机体氧化状态来减轻大肠杆菌感染造成的肉鸡生理失衡,具体表现在盲肠中大肠杆菌数量减少,血清中丙二醛含量降低、GSH-Px活性提高等。曹广添等[65]在1日龄白羽肉鸡饲粮中添加屎肠球菌(1×109 CFU/kg),在7日龄时口服感染大肠杆菌K88,结果表明添加屎肠球菌可提高大肠杆菌感染肉鸡的体重和日增重,提高血清中IgA、IgG和溶菌酶的含量,改变盲肠菌群的组成。Cao等[66]给1日龄雄性科宝肉鸡饲喂含脱水粪肠球菌(1×109 CFU/kg)的基础饲粮,通过口服大肠杆菌K88(1×108 CFU/mL)感染APEC,结果发现在饲粮中添加粪肠球菌能提高肉鸡的生长性能,改善肠道形态,并有利于控制盲肠菌群,表现在空肠绒毛高度增加、隐窝深度降低、黏膜TNF-α和IgA分泌量增加,盲肠大肠杆菌、产气荚膜梭菌数量下降,双歧杆菌数量上升。Zhang等[67]研究显示,在1日龄雄性科宝肉鸡饲粮中添加丁酸梭菌(2×107 CFU/kg)可以提高大肠杆菌K88(0.5 mL,2×108 CFU/mL)感染肉鸡的生长性能和免疫功能,改善盲肠菌群组成,使血清中IgA和卵黄抗体(immunoglobulin of yolk,IgY)含量增加,空肠黏膜中IgA含量增加,盲肠中乳酸菌和双歧杆菌数量增加。
2.5 抗菌肽
抗菌肽是一种普遍存在的由基因编码的天然抗生素,许多抗菌肽通过破坏细胞膜完整性来杀死细菌,几乎不引起细菌耐药性,因此抗菌肽作为新型抗菌药物备受关注[70-71]。陈号等[72]给15日龄艾维茵肉鸡饲喂2 mL腹泻鸡粪便培养蝇蛆粗提抗菌肽,并灌服大肠杆菌(1 mL,5×107 CFU/mL),与对照组相比,蝇蛆抗菌肽组血液中红细胞、白细胞、淋巴细胞数量以及肠道细菌数量均显著下降,说明蝇蛆抗菌肽对大肠杆菌感染引起的肉鸡腹泻具有治疗作用。Cuperus等[73]在蛋鸡胚胎发育的第18天和孵化后第1、4天肌肉注射鸡抗菌素-2(D-CATH-2),在第7天通过气管接种大肠杆菌O78(107 CFU/mL),D-CATH-2治疗显著降低了发病率和呼吸道细菌负荷,提高了外周血中淋巴细胞和嗜异性粒细胞的百分比。林洋等[74]给1日龄蛋鸡口服不同来源的抗菌肽(攻毒前:100 μL/羽,攻毒后:200 μL/羽):羊淋巴细胞抗菌肽、Vero细胞抗菌肽、地衣芽孢杆菌素、K株链球菌素、蛋清溶菌酶,通过胸肌注射0.5 mL 5×108 CFU/mL大肠杆菌(大肠杆菌O1、O78、Ka和Kb的混合物)感染APEC,结果发现,细胞源抗菌肽对APEC感染的防治效果较好,细胞源抗菌肽抑制大肠杆菌生长的同时,细胞产生的细胞因子及代谢产物也提高了动物机体的免疫能力,而微生物源的抗菌肽效果较差,可能是微生物源抗菌肽的抗菌谱比较窄,作用单一,胃肠道对其影响较大。给颈部皮下注射大肠杆菌O78(0.2 mL,3×108 CFU/mL)感染APEC的鸡口服表面素(0.01 mg/g)并联合阿莫西林治疗能提高阿莫西林的疗效,使死亡率、肝脏细菌负荷和病变显著降低,并调节炎症因子的表达,表面素在阿莫西林对APEC感染的治疗中发挥了佐剂作用[75]。以上研究表明,抗菌肽既可以作为抗生素的替代品治疗APEC感染,也可以作为抗生素的辅助剂增强抗生素的疗效。
2.6 益生元
益生元是饲料中难以被宿主消化吸收,可调节肠道微生物群,选择性的促进有益菌的代谢和增殖的一类饲料添加剂。甘露寡糖、果寡糖和葡聚糖是3种最常用的益生元[76]。Jahanian等[77]在55周龄的海兰(W-36)单壳白蛋鸡饲粮中添加0.1%的甘露寡糖,通过口服0.5 mL大肠杆菌(大肠杆菌K1、O2、O77和O88的混合物,2×109 CFU/mL)感染APEC,结果发现添加甘露寡糖可提高母鸡日产蛋量和产蛋量,降低血清中甘油三酯和低密度脂蛋白含量以及回肠中沙门氏菌数量,增加乳酸杆菌数量,提高感染蛋鸡的生长性能。王莹等[78]在1日龄AA肉鸡饲粮中添加100 mg/kg β-1,3-葡聚糖,能降低口服感染大肠杆菌O78(0.5 mL,1×1010 CFU/mL)肉鸡的死亡率,缓解因大肠杆菌感染引起的生长速度降低,减轻肠道氧化损伤,增强肠黏膜抗氧化能力,显著提高感染后期肠道乳酸菌数量和感染后期血清特异性IgG含量。Yang等[79]在1日龄雄性科宝肉鸡饲粮中分别添加甘露寡糖(2 g/kg)和果寡糖(10 g/kg),甘露聚糖可减少口服感染致病性大肠杆菌(大肠杆菌E3、E30、E956和E133混合物,0.1 mL,1×107 CFU/mL)肉鸡空肠黏膜大肠菌群的数量,降低空肠隐窝深度,果寡糖可增加感染肉鸡空肠黏膜乳酸菌的数量,且甘露聚糖和果寡糖均可以提高回肠中乳酸含量,降低肠道pH,提高感染肉鸡的生长性能。Fuhrmann等[80]在1日龄罗斯308肉鸡饲粮中添加1 g/kg果寡糖和0.1 g/kg粪肠球菌DSM 7134(1×1010 CFU/mL),结果显示能提高口服感染大肠杆菌O1和O18(0.6 mL,3.24×107 CFU/mL)肉鸡的生长性能,改善肠道微生物组成,使盲肠pH和变形菌门的相对丰度降低,乙酸和乳酸含量提高。鼠李糖乳杆菌可以增加肠道中短链脂肪酸的产生,抑制耐多药的大肠杆菌感染,抑制炎症以及调节肠道菌群平衡;而岩藻聚糖作为新的海洋益生元,在8 mg/mL的最适浓度下,可显著增强鼠李糖乳杆菌的生长速度和抑菌能力,在今后研究中可考虑鼠李糖乳杆菌与岩藻聚糖联用的潜力[81⇓-83]。
2.7 卵黄抗体
蛋鸡在接受疫苗等外来抗原刺激后可形成免疫球蛋白,这种特异性免疫球蛋白可在蛋黄中沉积,形成卵黄抗体[84]。一项体外试验表明,在LB液体培养基中添加浓度大于5 mg/mL的特异性卵黄抗体对大肠杆菌K88的生长有显著抑制作用[84]。Kariyawasam等[85]给肉鸡分别接种活大肠杆菌、灭活大肠杆菌、大肠杆菌抗原、LPS、1型菌毛黏连素(FimH)、P菌毛年连素(PapG)和好氧肌动蛋白外膜受体(IutA),然后从各组鸡蛋中纯化卵黄抗体,将卵黄抗体(100 mg)肌肉注射于11日龄肉鸡,3 d后通过气囊分别接种大肠杆菌O78、O1和O2,发现抗PapG卵黄抗体对这3种血清型大肠杆菌感染均具有较好的保护作用。然而,目前有关卵黄抗体抑制大肠杆菌的研究主要集中在猪上,在鸡上的相关研究较少,需要更多的研究工作来挖掘卵黄抗体在治疗禽大肠杆菌病方向的潜力。
2.8 其他物质
除了上述的抗生素替代物之外,酶制剂、维生素和某些氨基酸也对APEC感染具有抑制作用。朱瑞娟等[86]在1日龄罗斯肉鸡饲粮中添加3.0 g/kg的溶菌酶肠溶微球,在14日龄时通过胸肌注射感染大肠杆菌(0.2 mL,2.3×109 CFU/mL),结果发现添加溶菌酶肠溶微球可提高肉鸡的生长性能,降低死亡率,降低盲肠中大肠杆菌数量,提高乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、芽孢杆菌数量。维生素A过量或者不足也会影响鸡对大肠杆菌的免疫应答,维生素A以视黄酸的形式直接调节免疫细胞的增殖和分化,维生素A过量会抑制机体的免疫力,缺乏会引起淋巴器官和胸腺萎缩,使循环淋巴细胞数量和抗体产生减少;维生素E可增强B淋巴细胞介导的抗原抗体反应,并影响T淋巴细胞介导的免疫应答,缺乏维生素E会使T细胞的活化、增殖和分化水平下降[87]。Tengerdy等[88-89]在1日龄肉鸡饲粮中添加维生素E(300 mg/kg)或维生素A(60 000 IU/kg),通过气囊接种和静脉注射大肠杆菌的方式感染APEC,结果显示补充维生素E和维生素A对感染肉鸡均具有保护作用,能降低肉鸡的死亡率,增强肉鸡的体液免疫和免疫细胞的吞噬能力,促进抗体的生成。Likoff等[90]对维生素E的作用机制进行了探究,他们在肉鸡饲粮中添加300 mg/kg维生素E,通过静脉注射或气囊接种感染大肠杆菌B028,发现维生素E通过抑制前列腺素的生物合成激活肉鸡的体液免疫和吞噬作用,降低肉鸡的死亡率。关于氨基酸,有研究表明,可通过阻断甲硫氨酸LuxS/pfs代谢通路使APEC的致病能力急剧减弱[91]。
3 小结与展望
APEC是一种最常见的危害家禽养殖业的细菌性病原体,给全世界的家禽业造成了重大的经济损失。由于病原菌产生严重的抗生素耐药性问题以及抗生素耐药细菌的感染和基因传播给人类的高风险,迫切需要寻找新的可替代抗生素的手段防治禽大肠杆菌病。本文综述了现阶段禽大肠杆菌病的非抗生素防控手段及其作用效果,为防治禽大肠杆菌病提供参考。但是,相关替抗产品的研究仍存在不足,植物提取物来源广泛、种类繁多,具有营养和药用等功能以及低残留、不易引起大肠杆菌耐药性等优点,但原料自身存在安全隐患,有效成分和作用机制不明确,行业标准不够完善;噬菌体因其使用过程中的安全问题,以及高度特异性和剂量的不确定性限制了其应用;益生菌主要通过调节肠道菌群组成发挥其作用,但并不能直接杀灭大肠杆菌;抗菌肽虽然具有抗菌活性,但其生产成本高,产量低,存在一定的过敏反应。总之,有关禽大肠杆菌病的非抗生素物质防治的研究应该继续推进,逐步实现在实际生产中的全面推广和应用,并寻找更多更有效的抗生素替代产品。
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