动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 8: 5269 - 5282

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.448

研究论文

酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈幼鱼生长性能及脂质代谢的影响

  • 杨煜洁 ,
  • 李妹妍 ,
  • 徐异桓 ,
  • 张丽晗 ,
  • 夏辉 ,
  • 郭冉 , *
展开
  • 河北农业大学海洋学院,河北省水产养殖营养调控与病害防治重点实验室,秦皇岛 066000
*郭 冉,教授,博士生导师,E-mail:

杨煜洁(1998—),女,甘肃金昌人,硕士研究生,研究方向为水产动物饲料与营养。E-mail:

收稿日期: 2024-02-08

  网络出版日期: 2024-08-12

基金资助

河北农业大学引进人才科研专项(YJ2022001)

河北农业大学引进人才科研专项(YJ2021032)

河北省省属高等学校基本科研业务费研究项目(KY2022069)

收起

Effects of Enzymatic Wool Meal Replacing Fish Meal and Adding Bile Acid on Growth Performance and Lipid Metabolism of Juvenile Largemouth Bass (Micropterus salmoides)

  • YANG Yujie ,
  • LI Meiyan ,
  • XU Yihuan ,
  • ZHANG Lihan ,
  • XIA Hui ,
  • GUO Ran , *
Expand
  • Key Laboratory of Nutritional Regulation and Disease Control in Aquaculture of Hebei Province, Ocean College, Hebei Agriculture University, Qinhuangdao 066000, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-02-08

  Online published: 2024-08-12

Fold

摘要

本试验旨在研究酶解羊毛粉(EWM)替代鱼粉并添加胆汁酸(BA)对大口黑鲈幼鱼生长性能及脂质代谢的影响。试验选择180尾大小均匀、初始体重为(10.00±0.02) g的大口黑鲈幼鱼,随机分为3组,每组3个重复,每个重复20尾鱼。对照组(CON组)饲喂以鱼粉和豆粕为蛋白质源的基础饲料,酶解羊毛粉组(EWM组)饲喂在基础饲料中用酶解羊毛粉替代25%鱼粉的试验饲料,酶解羊毛粉+胆汁酸组(EWM+BA组)饲喂在基础饲料中用酶解羊毛粉替代25%鱼粉并添加0.6 g/kg胆汁酸的试验饲料。试验期56 d。结果表明:1)EWM+BA组的末重(FBW)、增重率(WGR)、特定增长率(SGR)均显著高于CON组和EWM组(P<0.05)。2)EWM组的血清甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量和肝脏中总胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)含量均显著高于CON组(P<0.05)。EWM+BA组的肝脏TG、TC、TBA含量和血清TBA含量均显著低于EWM组(P<0.05)。3)EWM组的肝脏乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)的mRNA相对表达水平显著高于CON组(P<0.05)。EWM+BA组的肝脏脂肪酸合成酶(FAS)、ACC1、SCD、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)、脂蛋白脂酶(LPL)和瘦素(LEP)的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM组(P<0.05)。4)EWM组和EWM+BA组的肝脏法尼醇X受体(FXR)、类视黄醇X受体(RXR)的mRNA相对表达水平显著低于CON组(P<0.05)。EWM组的肝脏小异二聚体伴侣(SHP)的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05)。EWM+BA组的肝脏胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)和成纤维细胞生长因子19(FGF19)的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM组(P<0.05)。由此可见,酶解羊毛粉替代部分鱼粉并添加外源胆汁酸可缓解酶解羊毛粉对大口黑鲈的生长性能、脂质代谢和胆固醇代谢产生的不利影响。

关键词： 大口黑鲈; 酶解羊毛粉; 胆汁酸; 生长性能; 脂质代谢

本文引用格式

杨煜洁 , 李妹妍 , 徐异桓 , 张丽晗 , 夏辉 , 郭冉 . 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈幼鱼生长性能及脂质代谢的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(8) : 5269 -5282 . DOI: 10.12418/CJAN2024.448

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of enzymatic wool meal (EWM) replacing fish meal and adding bile acid (BA) on growth performance and lipid metabolism of juvenile largemouth bass (Micropterus salmoides). A total of 180 uniform size largemouth bass with initial body weight of (10.00±0.02) g were randomly divided into 3 groups with 3 replicates per group and 20 fish per replicate. The control group (CON group) was fed a basal diet containing fish meal and soybean meal as protein sources, the enzymatic wool meal group (EWM group) was fed the experimental diet which using enzymatic hydrolyzed wool meal instead of 25% fish meal in basal diet, and the enzymatic wool meal+bile acid group (EWM+BA group) was fed the experimental diet which using enzymatic hydrolyzed wool meal instead of 25% fish meal and adding bile acid in basal diet. The experiment lasted for 56 days. The results showed as follows: 1) the final body weight (FBW), weight gain rate (WGR) and specific growth rate (SGR) of EWM+BA group were significantly higher than those of CON group and EWM group (P<0.05). 2) The contents of triglycerides (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in serum and contents of total cholesterol (TC) and total bile acid (TBA) in liver of EWM group were significantly higher than those of CON group (P<0.05). The contents of TG, TC and TBA in liver and serum TBA content of EWM+BA group were significantly lower than those of EWM group (P<0.05). 3) The mRNA relative expression levels of acetyl CoA carboxylase 1 (ACC1), fatty acid-binding protein (FABP), stearoyl-CoA desaturase (SCD) and adipose triglyceride lipase (ATGL) in liver of EWM group were significantly higher than those of CON group (P<0.05). The mRNA relative expression levels of fatty acid synthase (FAS), ACC1, SCD, sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1), peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPARα), lipoprotein lipase (LPL) and leptin (LEP) in liver of EWM+BA group were significantly higher than those of CON group and EWM group (P<0.05). 4) The mRNA relative expression levels of farnesol X receptor (FXR) and retinoid X receptor (RXR) in liver of EWM group and EWM+BA group were significantly lower than those of CON group (P<0.05). The liver small heterodimer partners (SHP) mRNA relative expression level of EWM group was significantly higher than that of CON group and EWM+BA group (P<0.05). The mRNA relative expression levels of cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) and fibroblast growth factor 19 (FGF19) in liver of EWM+BA group were significantly lower than those of CON group and EWM group (P<0.05). In conclusion, the enzymatic wool meal replacing some fish meal and adding exogenous bile acid can mitigate the adverse effects of enzymatic wool meal on growth performance, lipid metabolism and cholesterol metabolism in largemouth bass.

Key words： Micropterus salmoides; enzymatic wool meal; bile acid; growth performance; lipid metabolism

大口黑鲈(Micropterus salmoides)又称加州鲈,为淡水肉食性鱼类。大口黑鲈是鲈鱼中蛋白质需求量相对较高的一种,达到50%~55%。鱼粉作为大口黑鲈饲料中重要的蛋白质源,其价格的逐年上升严重限制了大口黑鲈养殖业的发展,因此寻求廉价的鱼粉替代源成为了目前的研究热点。
动物副产品(如羽毛、角、蹄子和头发等)中提取的蛋白质已被证实可以添加到动物饲料中作为蛋白质的廉价来源。酶解羊毛粉(enzymatic wool meal,EWM)为利用屠宰场产生的羊毛以及不适宜做羊毛制品的羊毛废弃物进行酶解加工得到的新型蛋白质源,具有蛋白质含量高等优点,其在水产养殖业的应用,既可解决羊毛废弃物难治理的问题,又因生产成本较低、蛋白质含量较高从而达到节约水产动物饲料中传统蛋白质的作用。Dias等[1]和Giteru等[2]研究证实,羊毛可以作为替代蛋白质的来源应用于动物饲料中。张宇[3]研究表明,酶解羽毛粉替代鱼粉严重影响了大菱鲆的脂质代谢。Romano等[4]研究表明,动物蛋白质源对鱼体的胆固醇和胆汁酸(bile acid,BA)状态产生了不利影响。
胆汁酸是由肝脏胆固醇代谢合成的两性甾醇类化合物[5],其特殊的分子结构能够有效地乳化脂类物质,加速脂肪的消化,在肠道消化吸收脂类物质过程中起到重要作用。同时,胆汁酸在肝脏中能促进胆固醇和毒性代谢物(尤其是胆红素)的排泄,减轻肝脏损伤,促进肝脏再生[4,6-7]。因此,胆汁酸作为一种能缓解肝脏代谢应激、改善鱼类健康的功能性饲料添加剂,在鱼类饲料中的应用受到广泛的关注[8-9]。目前,已有大量研究表明适量添加胆汁酸可以改善水生动物生长性能和肝脏健康[4]。苟庚午[10]研究表明,饲料中添加适量外源胆汁酸能显著提高罗非鱼生长性能,促进其脂质代谢并减少肝脏损伤。胆汁酸在草鱼[11-12]、大黄鱼[13-14]、花鲈[15]、欧洲鳗鲡[16]、齐口裂腹鱼[17]、大菱鲆[18]等水生动物饲料中的添加也都有所报道,且对肝脏健康具有积极影响。因此,本试验以大口黑鲈为研究对象,在酶解羊毛粉替代部分鱼粉条件下添加胆汁酸,研究其对大口黑鲈生长性能及脂质代谢的影响,以期为酶解羊毛粉的合理应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计及试验饲料

试验选择180尾大小均匀、初始体重为(10.00±0.02) g的大口黑鲈幼鱼,随机分为3组,每组3个重复,每个重复20尾鱼。对照组(CON组)饲喂以鱼粉和豆粕为蛋白质源的基础饲料,酶解羊毛粉组(EWM组)饲喂在基础饲料中用酶解羊毛粉替代25%鱼粉的试验饲料,酶解羊毛粉+胆汁酸组(EWM+BA组)饲喂在基础饲料中用酶解羊毛粉替代25%鱼粉并添加0.6 g/kg胆汁酸的试验饲料。试验期56 d。
所有原料均经粉碎后通过80目筛网,按配方比例称取各种原料与油充分混合(少量组分采用逐级扩大法混合),在搅拌机中充分混匀后,根据制作的饲料质量加适量的水搅拌均匀,制成直径为2 mm的颗粒。饲料在烘箱中熟化(60 ℃,30 min)后自然风干,置于-20 ℃冰箱中保存备用。鱼粉和酶解羊毛粉的营养组成和氨基酸组成见表1,试验饲料组成及营养水平见表2。
表1 鱼粉和酶解羊毛粉的营养组成和氨基酸组成

Table 1 Nutrient composition and amino acid composition of fish meal and enzymatic wool meal

项目Items 鱼粉Fish meal 酶解羊毛粉Enzymatic wool meal
水分Moisture/% 6.88 5.58
粗蛋白质CP/% DM 79.62 83.09
粗脂肪EE/% DM 5.90 1.90
必需氨基酸Essential amino acids/% DM
蛋氨酸Methionine 1.86 0.59
赖氨酸Lysine 4.97 2.32
苏氨酸Threonine 2.74 4.35
异亮氨酸Isoleucine 2.61 3.54
组氨酸Histidine 2.01 0.74
缬氨酸Valine 3.11 5.32
亮氨酸Leucine 4.94 6.96
精氨酸Arginine 3.93 7.00
苯丙氨酸Phenylalanine 2.61 3.48
色氨酸Tryptophan 0.77 1.06
总计Total 29.55 35.36
非必需氨基酸Non-essential amino acids/% DM
天冬氨酸Aspartic acid 5.81 5.83
丝氨酸Serine 2.49 7.95
谷氨酸Glutamic acid 8.40 9.86
甘氨酸Glycine 3.91 5.63
丙氨酸Alanine 4.08 3.58
胱氨酸Cysteine 0.60 3.03
脯氨酸Proline 2.54 6.90
酪氨酸Tyrosine 1.97 2.48
总计Total 29.80 45.26
表2 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

项目
Items		 组别Groups
CON EWM EWM+BA
原料Ingredients/(g/kg)
鱼粉Fish meal1) 490.00 367.50 367.50
酶解羊毛粉Enzymatic wool meal1) 116.60 116.60
蛋氨酸Methionine 1.38 1.38
豆粕Soybean meal1) 180.00 180.00 180.00
面粉Flour 130.00 130.00 130.00
鱼油Fish oil 45.00 50.02 50.02
豆油Soybean oil 45.00 45.00 45.00
胆汁酸Bile acids 0.60
微晶纤维素Microcrystalline cellulose 35.00 34.50 33.90
卵磷脂Lecithin oil 10.00 10.00 10.00
预混料Premix2) 20.00 20.00 20.00
维生素C磷酸酯Vitamin C phosphate ester 5.00 5.00 5.00
氯化胆碱Choline chloride 10.00 10.00 10.00
黏合剂Adhesive 20.00 20.00 20.00
磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 10.00 10.00 10.00
合计Total 1 000.00 1 000.00 1 000.00
营养水平Nutrient levels/%3)
水分Moisture 9.19 9.58 9.65
粗脂肪Ether extract 11.47 11.12 11.60
粗蛋白质Crude protein 46.13 46.50 46.98
粗灰分Ash 11.63 10.26 10.28

1)鱼粉粗蛋白质含量为79.62%,粗脂肪含量为5.90%;酶解羊毛粉粗蛋白质含量为83.09%,粗脂肪含量为1.90%;豆粕粗蛋白质含量为50.45%,粗脂肪含量为2.00%。Fish meal CP content was 79.62%, EE content was 5.90%; enzymatic wool meal CP content was 83.09%, EE content was 1.90%; soybean meal CP content was 50.45%, EE content was 2.00%.

2)每千克预混料含 One kilogram of premix contained the following:VA 10 mg,VB1 6 mg,VB2 5 mg,VB6 7.5 mg,VB12 4 mg,烟酰胺 niacinamide 50 mg,抗坏血酸 ascorbic acid 500 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 20 mg,生物素 biotin 2.5 mg,叶酸 folic acid 5 mg,VE 200 mg,VK3 10 mg,VD3 5 mg,肌醇 inositol 100 mg,玉米蛋白粉 corn gluten meal 75 mg,CuSO4·5H2O 10 mg,FeSO4·H2O 300 mg,ZnSO4·H2O 200 mg,MnSO4·H2O 100 mg,KIO3 80 mg,Na2SeO3 67 mg,CoCl2·6H2O 5 mg,NaCl 100 mg,沸石 zeolite 638 mg。

3)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

1.2 饲养管理

大口黑鲈由天津市某养殖场供应,品种为优鲈3号。在试验开始前,将大口黑鲈幼鱼暂养2周,投喂基础饲料。暂养结束后禁食24 h,将180尾大小均匀的幼鱼随机分到9个养殖缸(60 cm×50 cm×50 cm)中,每缸20尾鱼,并将9个养殖缸随机分成3组。养殖试验为期56 d,每天定时投喂2次(08:00和17:00),每次投喂量为体重的2%~3%。在试验过程中,每天检测溶氧量、pH和温度,每周测定氨氮含量。水中氨氮含量<0.5 mg/L,溶氧量>6.5 mg/L,pH为7.3±0.5,水温为(25.0±1.5) ℃,养殖期间24 h供氧。

1.3 样品采集与处理

饲养试验结束后,将试验鱼禁食24 h后用MS-222溶液麻醉,计数并称量总重。测量每尾鱼的体长体重,之后随机选取12尾鱼解剖以获得血液和组织样本。采集血液后,于4 ℃静置12 h后4 000 r/min离心,分离血清置于-80 ℃冰箱,以备进行生化指标测定。将完整无损的肝脏样本放入组织固定液(乙醇∶冰醋酸∶甲醛=17∶1∶2)中经脱水、石蜡包埋后制成切片,以观察肝脏细胞形态并评估肝脏状态。另取2 g肝脏样品,按照1:9加入组织匀浆液[0.02 mol/L Tris-HCl,0.25 mol/L蔗糖,2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.1 mol/L氟化钠,0.5 mmol/L苯甲磺酰氟和0.01 mol/L β-巯基乙醇,pH 7.4]于组织研磨仪中60 Hz匀浆2 min,离心(3 000 r/min,10 min,4 ℃)得到上清,置于-80 ℃冰箱,以备进行生化指标测定。使用Trizol试剂提取肝脏总RNA,使用Hifair® Ⅱ Q RT SuperMix进行qPCR去除gDNA,并将RNA逆转录为cDNA后置于-80 ℃冰箱,以备进行肝脏基因表达检测。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 饲料和鱼体营养成分

饲料和鱼体的营养成分按照以下方法测定:在105 ℃烘干至恒重测定水分含量,采用微量凯氏定氮法测定粗蛋白质含量,采用Soxhlet石油醚萃取法测定粗脂肪含量,在马弗炉550 ℃烘干至恒重测定粗灰分含量。

1.4.2 生长性能

在养殖期间,记录每日的饲料摄食量。养殖结束后,对每个重复的20尾大口黑鲈进行总体称重,后分别对每个重复的大口黑鲈单独称重及测量体长,之后解剖鱼体以获得内脏团,称重并记录。生长性能相关公式计算如下:
增重率(WGR,%)=100×(终末体重-初始体重)/初始体重;
特定生长率(SGR,%/d)=100×(ln终末体重-ln初始体重)/养殖天数;
饲料系数(FCR)=饲料摄食量/(终末体重-初始体重);
脏体比(VSI,%)=100×内脏重/终末体重;
肥满度(CF,g/cm3)=100×体重/体长3;
存活率(SR,%)=100×(终末鱼数量/初始鱼数量)。

1.4.3 血清和肝脏生化指标

肝脏葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)含量及血清GLU、TG、TC、TBA、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量和谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.4.4 肝脏细胞形态

将完整无损的部分肝脏样本放入组织固定液中,经脱水、石蜡包埋后切成6 μm切片,后经苏木精-伊红(HE)染色,用光学显微镜成像以观察肝细胞形态并评估肝脏状态。

1.4.5 肝脏脂质代谢和胆固醇代谢相关基因表达

使用在线Primer3Plus软件设计基因特异性引物,支持GenBank中的cDNA序列,并使用NCBI BLAST软件对所有序列进行确认。由于没有大口黑鲈的内参基因序列,因此选定8个常见内参基因[β-肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、延伸因子-1α(elongation factor-1α,EF-1a)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1,HPRT1)、β2-微球蛋白(beta-2-microglobulin,B2M)、微管蛋白(tubulin,TUB)和TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)]来测试它们的转录稳定性,以选出2个最优内参基因。
通过测定基因转录组序列得到基因序列,并根据该序列设计引物,定量RT-PCR的(qPCR)引物序列见表3。通过geNorm选择在大口黑鲈肝脏组织中稳定表达的β-actin和GAPDH作为内参基因,根据2-ΔΔCt法计算目的基因[脂质代谢相关基因:过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl CoA carboxylase 1,ACC1)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)、甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)、肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)、过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor-alpha,PPARα)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)、瘦素(leptin,LEP)、固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)、二酰基甘油酰基转移酶2(diacylglyceryl transferase 2,DGAT2);胆固醇代谢相关基因:法尼醇X受体(farnesol X receptor,FXR)、类视黄醇X受体(retinoid X receptor,RXR)、成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)、小异二聚体伴侣(small heterodimer partners,SHP)、胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1)、甾醇12α-羟化酶(sterol 12 alpha-hydroxylase,CYP8B1)]的mRNA相对表达水平[19]。
表3 定量RT-PCR的引物序列

Table 3 Primer sequences for RT-PCR

基因
Genes		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 GenBank登录号
GenBank accession No.
β-肌动蛋白
β-actin		 F:GTGCAAAGCTGGTTTTTCCG
R:ATTCCCCTTTTGCTCTGTGC		 XM_038712920.1
18S核糖体RNA
18S rRNA		 F:AACTGGGGCCATGATTAAGAGG
R:GGCAAATGCTTTCGCTTTCG		 XM_038712920.1
次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1
HPRT1		 F:ACTTCATTCGCCTCAAGAGC
R:TTGCCTGTCAACGTACACAG		 XM_038700319.1
TATA结合蛋白
TBP		 F:TTGCACTGGAGCCAAAAGTG
R:TTGCAGGAAAACCGAGCTTC		 XM_038701039.1
延伸因子-1α
EF-1α		 F:AATTTGCTTGGGTGCTGGAC
R:TGGCCAGGAGCATCAATGATAG		 XM_038730435.1
微管蛋白
TUB		 F:TTGCTTTGAGCCAGCCAATC
R:AAACTGGATGGTGCGTTTGG		 XM_038720315.1
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GAPDH		 F:AGCACAGTTCATGCCATCAC
R:TGACCTTGCCAACAGCTTTG		 XM_038711150.1
β2-微球蛋白
B2M		 F:ACGTCCTGATTTGCCATGTG
R:AGCGCCAATCCTGTTTGAAG		 XM_038739210.1
过氧化物酶体增生物激活受体γ
PPARγ		 F:TTCACAAGAAGTCCCGCAAC
R:ATGGCGTTGTGTGACAATCC		 XM_038695875.1
脂肪酸合成酶
FAS		 F:ACAGCCAATGGGAAACTTGC
R:ACTTTTGCTGCAGTCTGTGG		 XM_038735140.1
乙酰辅酶A羧化酶1
ACC1		 F:CAACCGCATGCGCAATTTTG
R:ATGGCTCGCACAAAGAAACG		 XM_038709726.1
固醇调节元件结合蛋白1
SREBP1		 F:TCAACAAGTCTGCAGTGCTG
R:TGCTTGAGTTTCTGGTTGGC		 XM_038699585.1
过氧化物酶体增殖激活受体α
PPARα		 F:TGGTTTGACACAGTGCTCTC
R:AGGGGCTCAATCAAATGCAG		 XM_038705494.1
甘油三酯脂肪酶
ATGL		 F:TGGAACAACATGTGGAACCG
R:TGCTTTGACGCTGATCTTGC		 XM_038701257.1
脂蛋白脂酶
LPL		 F:ACAGGGATGTTCGAAAGCTG
R:TCCACAACGATCACATTGGC		 XM_038715978.1
肉碱棕榈酰转移酶1
CPT1		 F:TCCATGACGCGTTTATTCCG
ATCATGGCACGAACAAAGGC		 XM_038705334.1
激素敏感脂肪酶
HSL		 F:TCCTGATAGCATGCTGAAAGGG
R:ACGCTTGGCAAACATCACAG		 XM_038710962.1
脂肪酸结合蛋白
FABP		 F:TCATCGTGAAGGCAACAAGC
R:TGCGTTTGCTTGTCCTCTTG		 XM_038704629.1
硬脂酰辅酶A去饱和酶
SCD		 F:ACGCCGACAAAGTTGTGATG
R:TGTACCAAGGCACGAACATG		 XM_038735580.1
二酰基甘油酰基转移酶2
DGAT2		 F:TTCTGCTTCGGTGCTTTCTG
R:TGATGCCCGGGAATTTCTTG		 XM_038708163.1
瘦素
LEP		 F:AAACGCTGCAGTTTGTGGTG
R:TGGGTCTGGTTTCTCACAGTAC		 XM_038724283.1
法尼醇X受体
FXR		 F:TGTGGAAGCCATGTTTCTGC
R:AACTTCTGTGTGTCCGTTGG		 XM_038705617.1
小异二聚体伴侣
SHP		 F:TCTGGTTTCCGGGATAAGCATC
R:TGGCGCAATGGTTCAGTTTG		 XM_038724571.1
类视黄醇X受体
RXR		 F:TGTCGCTCACCAAACACATC
R:AAAACCTTTGCAGCCCTCAC		 XM_038734627.1
成纤维细胞生长因子19
FGF19		 F:AACTGAGGCAGAAGCAACAC
R:TTGGCAGTGAACATGAGCAG		 XM_038702190.1
胆固醇7α-羟化酶
CYP7A1		 F:TGAATGTGCGTGTTGCCAAG
R:TGCAGCATGGGTGGATATAAGG		 XM_038717160.1
甾醇12α-羟化酶
CYP8B1		 F:TTGCACAACATCAGCTCAGC
R:TCCCTCTGACACATTGCCATAC		 XM_038717789.1

1.5 数据统计分析

利用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较。结果表示为平均值±标准差(mean±SD),P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响

由表4可知,EWM+BA组的终末体重、WGR、SGR均显著高于CON组和EWM组(P<0.05),EWM组和EWM+BA组的VSI显著高于CON组(P<0.05)。各组之间SR、FCR和CF均无显著差异(P>0.05)。
表4 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈生长性能的影响

Table 4 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on growth performance of largemouth bass

项目
Items		 组别Groups
CON EWM EWM+BA
初始体重IBW/g 10.28±0.02 10.27±0.02 10.25±0.02
终末体重FBW/g 38.17±0.60a 38.13±0.74a 41.24±0.97b
增重率WGR/% 271.37±5.37a 271.17±7.51a 302.31±9.64b
存活率SR/% 98.33±1.67 93.33±4.41 86.67±7.26
特定增长率SGR/(%/d) 2.34±0.03a 2.34±0.04a 2.48±0.04b
饲料系数FCR 1.62±0.04 1.62±0.06 1.51±0.03
肥满度CF/(g/cm3) 1.90±0.02 1.82±0.03 1.93±0.08
脏体比VSI/% 9.36±0.23a 10.68±0.11b 10.71±0.13b

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈体成分的影响

由表5可知,EWM+BA组的全鱼水分含量显著高于EWM组(P<0.05),EWM组的全鱼粗脂肪显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05),EWM+BA组的全鱼粗蛋白质含量显著低于CON组和EWM组(P<0.05)。EWM组的肌肉粗脂肪显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05)。各组之间肝脏粗脂肪含量和肌肉粗蛋白质含量无显著差异(P>0.05)。
表5 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈体成分的影响

Table 5 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on body composition of largemouth bass %

项目
Items		 组别Groups
CON EWM EWM+BA
全鱼Whole fish
水分Moisture 70.46±0.23ab 69.87±0.16a 70.77±0.28b
粗脂肪EE 7.42±0.19a 8.22±0.12b 7.33±0.11a
粗蛋白质CP 18.23±0.07b 18.50±0.29b 17.57±0.14a
肝脏Liver
粗脂肪EE 1.47±0.34 1.30±0.20 1.14±0.26
肌肉Muscle
粗脂肪EE 1.67±0.06a 2.41±0.13b 1.87±0.21a
粗蛋白质CP 73.29±0.34 73.69±0.11 73.46±0.08

2.3 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏细胞形态的影响

由图1可知,CON组肝脏无明显组织学变化,肝脏细胞空泡化程度低,排列紧密,细胞核位于中心。与CON组相比,EWM组的肝脏细胞可见大小不一的圆形空泡,且细胞核被挤至细胞边缘。与EWM组相比,EWM+BA组的肝脏细胞中脂质的沉积明显降低。
图1 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏细胞形态的影响

1:对照组 CON group;2:酶解羊毛粉组 EWM group;3:酶解羊毛粉+胆汁酸组 EWM+BA group。

Fig.1 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on liver cell morphology of largemouth bass

2.4 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈血清和肝脏生化指标的影响

由表6可知,EWM组的肝脏GLU、TC、TBA含量显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05),且EWM+BA组的肝脏GLU、TBA含量显著低于CON组(P<0.05);EWM+BA组的肝脏TG含量显著低于CON组和EWM组(P<0.05)。EWM组和EWM+BA组的血清TG、HDL-C和LDL-C含量显著高于CON组(P<0.05),且EWM+BA组的血清TG含量显著高于EWM组(P<0.05);EWM组的血清GOT活性显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05);EWM+BA组的血清TBA含量显著低于CON组和EWM组(P<0.05)。各组之间血清GLU、TC含量和GPT活性均无显著差异(P>0.05)。
表6 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈血清和肝脏生化指标的影响

Table 6 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on serum and liver biochemical indices of largemouth bass

项目
Items		 组别Groups
CON EWM EWM+BA
肝脏Liver
葡萄糖GLU/(mmol/g prot) 0.85±0.01b 1.18±0.02c 0.76±0.02a
甘油三酯TG/(mmol/g prot) 0.17±0.01b 0.16±0.01b 0.08±0.01a
总胆固醇TC/(mmol/g prot) 0.09±0.01a 0.17±0.01b 0.09±0.01a
总胆汁酸TBA/(μmol/L) 18.98±0.57b 26.63±0.54c 10.62±0.30a
血清Serum
葡萄糖GLU/(mmol/L) 5.68±0.12 5.76±0.37 5.63±0.23
甘油三酯TG/(mmol/L) 4.34±0.02a 5.74±0.09b 9.29±0.04c
总胆固醇TC/(mmol/L) 10.19±0.53 10.99±0.93 9.67±0.44
高密度脂蛋白胆固醇HDL-C/(mmol/L) 6.99±0.17a 9.40±0.34b 9.10±0.14b
低密度脂蛋白胆固醇LDL-C/(mmol/L) 4.71±0.43a 6.83±0.09b 6.63±0.38b
谷丙转氨酶GPT/(U/L) 202.73±14.97 179.01±12.84 208.91±5.01
谷草转氨酶GOT/(U/L) 3.09±0.22a 25.61±1.91b 7.38±1.83a
总胆汁酸TBA/(μmol/L) 4.25±0.11b 4.18±0.09b 3.46±0.10a

2.5 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏脂质代谢相关基因的影响

由图2可知,EWM组的肝脏ACC1、FABP、SCD和ATGL的mRNA相对表达水平显著高于CON组(P<0.05),肝脏FAS和LPL的mRNA相对表达水平显著低于CON组(P<0.05)。EWM+BA组的肝脏FAS、ACC1、SCD、SREBP1、PPARα、LPL和LEP的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM组(P<0.05),肝脏FABP、DGAT2的mRNA相对表达水平显著低于CON组和EWM组(P<0.05),肝脏PPARγ、ATGL的mRNA相对表达水平显著高于CON组(P<0.05)。
图2 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏脂质代谢相关基因mRNA相对表达水平的影响

(a):脂质合成相关基因 lipid synthesis-related genes;(b):脂质合成转录因子 lipid synthesis transcription factors;(c):脂质分解转录因子 lipolysis transcription factors;(d):脂质分解相关基因lipolysis-related genes。FAS:脂肪酸合成酶 fatty acid synthase;ACC1:乙酰辅酶A羧化酶1 acetyl CoA carboxylase 1;FABP:脂肪酸结合蛋白 fatty acid-binding protein;SCD:硬脂酰辅酶A去饱和酶 stearoyl-CoA desaturase;DGAT2:二酰基甘油酰基转移酶2 diacylglyceryl transferase 2;PPARγ:过氧化物酶体增生物激活受体γ peroxisome proliferator-activated receptor γ;SREBP1:固醇调节元件结合蛋白1 sterol regulatory element binding protein 1;PPARα:过氧化物酶体增殖激活受体α peroxisome proliferator-activated receptor-alpha;ATGL:甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase;LPL:脂蛋白脂酶 lipoprotein lipase;CPT1:肉碱棕榈酰转移酶1 carnitine palmitoyl transferase 1;HSL:激素敏感脂肪酶 hormone-sensitive lipase;LEP:瘦素 leptin。
数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.2 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on mRNA relative expression levels of liver lipid metabolism related genes of largemouth bass

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.6 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏胆固醇代谢相关基因的影响

由图3可知,EWM组和EWM+BA组的肝脏FXR和RXR的mRNA相对表达水平显著低于CON组(P<0.05)。EWM组的肝脏SHP的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM+BA组(P<0.05)。EWM+BA组的肝脏CYP7A1和FGF19的mRNA相对表达水平显著高于CON组和EWM组(P<0.05),肝脏CYP8B1的mRNA相对表达水平显著低于CON组和EWM组(P<0.05)。
图3 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA相对表达水平的影响

FXR:法尼醇X受体 farnesol X receptor;SHP:小异二聚体伴侣 small heterodimer partners;RXR:类视黄醇X受体 retinoid X receptor;CYP7A1:胆固醇7α-羟化酶 cholesterol 7 alpha-hydroxylase;CYP8B1:甾醇12α-羟化酶 sterol 12 alpha-hydroxylase;FGF19:成纤维细胞生长因子19 fibroblast growth factor 19。

Fig.3 Effects of enzymatic wool meal replacing fish meal and adding bile acid on mRNA relative expression levels of liver cholesterol metabolism related genes of largemouth bass

3 讨论

3.1 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈生长性能及体成分的影响

酶解羊毛粉是一种具有较高营养价值的新型动物蛋白质资源,具有较高的开发利用价值。本试验中,用酶解羊毛粉替代25%的鱼粉饲料并未对大口黑鲈的终末体重、WGR和SGR等生长指标产生负面影响,但大口黑鲈全鱼粗脂肪含量显著升高,表明酶解羊毛粉的添加造成了鱼体脂肪的积累。因此推断酶解羊毛粉中所含的生物油会影响鱼体对脂肪的吸收利用,从而影响鱼体内胆汁酸的合成,进而影响鱼体脂质代谢,造成脂肪堆积。在以往大口黑鲈的试验中,许多其他动物蛋白质替代鱼粉也观察到了类似的结果[21⇓-23]。
在本研究中,与EWM组相比,EWM+BA组的全鱼粗脂肪含量显著降低,且大口黑鲈的终末体重、WGR、SGR显著提高,表明添加胆汁酸后提高了饲料中脂肪的利用率,改善了鱼体脂质代谢,鱼体脂质沉积下降,脂肪酸被氧化利用,从而促进了大口黑鲈生长。Yin等[24]研究表明,饲料中添加300~900 mg/kg鹅去氧胆酸改善了大口黑鲈生长性能,降低了其肝脏脂肪蓄积,减轻了高脂饲料对肝脏健康的负面影响。朱龙等[25]将胆汁酸加入大口黑鲈饲料中,显著提高了大口黑鲈的生长性能,降低了鱼体粗脂肪含量。Ding等[14]、Jin等[26]、Peng等[27]在大黄鱼、黑鲷、草鱼上的研究均表明,在饲料中添加胆汁酸能够促进生长,减轻脂质积累,提高抗氧化能力和免疫力。

3.2 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏脂质代谢的影响

一般情况下,体内脂质代谢异常会增加内脏腔或肠系膜的脂肪沉积,包括肝脏、脂肪组织和肌肉[28]。本研究表明,在大口黑鲈饲料中添加酶解羊毛粉替代鱼粉会导致肝脏TC含量增加,从而导致肝脏脂肪空泡化。但EWM组肝脏TG并未显著高于CON组,血清TG和LDL-C含量显著高于CON组,表明酶解羊毛粉替代鱼粉没有使脂肪沉积于肝脏而是转运至肌肉沉积,EWM组肌肉粗脂肪含量的显著升高也证明了脂肪在肌肉中累积。脂肪ATGL将TG分解为甘油二酯,是体内脂肪分解代谢调控的关键酶。在本试验中,与CON组相比,EWM组的脂质合成相关基因(ACC1、FABP、SCD)的mRNA表达相对表达水平显著升高,脂质分解相关基因(ATGL)的mRNA表达相对表达水平显著升高,证明了脂质并未在肝脏中沉积;但EWM组的脂质分解转录因子(PPARα)和脂质分解相关基因(HSL、CPT1、LEP)的mRNA表达相对表达水平无显著差异,又表明EWM组的大口黑鲈机体脂肪并未被完全分解代谢,而肌肉脂肪的沉积证明了这一结论。
本试验中,当饲料中补充胆汁酸后,大口黑鲈肝脏脂肪空泡减少,机体脂肪沉积减轻,EWM+BA组的肝脏TC和TG含量较EWM组显著降低,同时,血清TG含量较EWM组显著升高。这是由于胆汁酸生成的胆盐可以通过乳化脂质形成小的乳糜颗粒促进脂质消化,从而改善脂肪酶和脂质的接触面,催化酯键的水解,减少脂肪在肝脏的积累[4,14]。脂肪分解后使血清TG含量升高。同时肝脏脂肪转出至肌肉后,在肌肉进行脂肪酸β氧化,生成ATP,为大口黑鲈的生长提供能量。在大口黑鲈和虎鲀中,胆汁酸对体内脂质代谢的影响也有类似的结果[24,29]。同时,已经有一些研究分析了在鱼类饲料中补充胆汁酸可以减轻肝脏脂质代谢的分子机制,其与肝脏中激活的FXR表达高度相关[30]。在对大黄鱼的研究中表明,鹅去氧胆酸通过激活FXR表达来减少肝脏脂肪蓄积,从而抑制SREBP1、FAS、SCD的表达,但促进了PPARα和ATGL的表达[31]。饲料胆汁酸添加量从150 mg/kg提高到450 mg/kg显著降低了大黄鱼肝脏脂肪含量,主要是通过降低肝脏中脂质合成相关基因SREBP1、SCD和FAS的表达和提高脂质分解相关基因PPARα、CPT1和酰基辅酶A氧化酶(ACO)的表达实现的[14]。类似的结果也在翘嘴鳜中被报道[30]。本试验中,与EWM组相比,EWM+BA组肝脏中PPARα、LPL和LEP的mRNA相对表达水平显著升高,血清和肝脏TBA含量显著降低,表明外源胆汁酸促进了肝脏脂质的分解。然而,与EWM组相比,本研究中EWM+BA组的肝脏FAS、ACC1、SCD的mRNA相对表达水平显著升高,与Du等[31]的研究结果不一致。这可能是由于胆汁酸添加过量,有研究表明饲料中过量的胆汁酸可能会中断胆汁酸的稳态,并对脂质代谢产生相反的作用[32]。本研究中的胆汁酸添加量可能处于临界值,因此脂质分解相关基因表达上调的同时脂质合成相关基因也有所上调。这些结果表明外源胆汁酸促进了脂质转运并加速其代谢周转。

3.3 酶解羊毛粉替代鱼粉并添加胆汁酸对大口黑鲈肝脏胆固醇代谢的影响

胆汁酸对胆固醇的分解代谢有极大影响。FXR作为胆汁酸的重要配体之一,是胆汁酸稳态和肝肠循环的关键调节因子。FXR调节胆汁酸代谢的重要步骤是通过抑制CYP7A1来抑制胆汁酸中毒,包括2条反馈调节通路。其中一条途径是FXR通过肝脏中胆盐输出泵(BSEP)的作用促进胆汁酸的合成,从而诱导SHP的表达。然后SHP蛋白使CYP7A1表达所需的信号分子肝受体同源物-Ⅰ(LRH-Ⅰ)失活,从而抑制CYP7A1的表达[33]。在另一个途径中,胆汁酸的受体FXR激活诱导成纤维细胞生长因子15/19(FGF15/19)与成纤维生长因子受体4(FGFR4)结合,从而抑制CYP7A1的表达[34]。CYP7A1可以催化胆固醇转化为7α-羟基胆固醇[35]。然后,通过持续脱氢和脱羟基得到7α-羟基-4-胆固醇-3-酮,它是胆酸和鹅脱氧胆酸的共同前体。CYP8B1催化7α-羟基-4-胆固醇-3-酮的羟基化,随后胆固醇27-羟化酶(CYP27A1)的固醇侧链裂解产生胆酸。如果CYP8B1没有被代谢,7α-羟基-4-胆固醇-3-酮最终会转化为鹅脱氧胆酸[36]。一般情况下,CYP7A1作为胆汁酸合成的限速酶,可通过经典代谢途径促进胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸[37]。
本研究中,EWM组的肝脏CYP7A1和CYP8B1的mRNA相对表达水平与CON组相比没有显著差异,但肝脏TBA含量相对于CON组增加了近1.40倍,并且肝脏TC含量显著高于CON组。这可能是由于饲料中添加酶解羊毛粉造成了大口黑鲈胆汁酸代谢异常,肝脏TBA和TC含量升高,从而引起了大口黑鲈肝脏细胞的损伤[38]。EWM组血清GOT活性的升高证明了这一点。GPT和GOT是一类在肝脏细胞中大量存在的代谢相关酶,在正常情况下,只有少量释放到血液中,GPT和GOT的活性不仅反映了机体的代谢强度,而且与肝脏细胞的炎症和变性密切相关,可作为确定肝脏功能是否受损的指标[9]。在本研究中,虽然大口黑鲈的血清GPT活性没有显著改变,但EWM组的大口黑鲈血清GOT活性较高,表明大口黑鲈的肝脏受到慢性损伤。
本研究中,与EWM组相比,EWM+BA组的血清GOT活性显著降低,表明饲料中添加胆汁酸使大口黑鲈肝脏损伤减轻,有助于大口黑鲈的健康生长;并且饲料中添加胆汁酸导致鱼体内胆汁酸的合成减少,肝脏SHP的表达降低,从而导致肝脏CYP7A1的表达增加,肝脏TC含量降低。但由于本试验中添加的胆汁酸为鹅去氧胆酸,因此CYP8B1在肝脏中的表达受到抑制,血清TBA含量降低,胆汁酸代谢异常有所缓解。本研究中,与EWM组相比,EWM+BA组胆固醇代谢有关酶活性及基因表达的差异变化可证实胆汁酸代谢在促进胆固醇代谢方面有重要作用[4,20]。因此,我们推断饲料中添加胆汁酸可通过影响机体胆汁酸的合成来改善胆固醇的代谢,从而缓解肝脏损伤,促进大口黑鲈健康生长。

4 结论

① 用酶解羊毛粉替代饲料中25%的鱼粉,虽未影响大口黑鲈的生长性能,但却导致其机体脂质代谢受阻,鱼体脂肪沉积,同时导致肝脏受到损伤。
② 用酶解羊毛粉替代饲料中25%的鱼粉并添加外源胆汁酸,可通过改善脂质代谢和胆汁酸代谢,减轻脂肪蓄积,缓解肝脏损伤,从而提高了大口黑鲈的生长性能。

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