动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 8: 5411 - 5421

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.460

研究论文

饲用油菜中优势乳酸菌的分离鉴定及其对青贮发酵品质和有氧稳定性的影响

  • 郑晓凯 , 1 ,
  • 付彦博 , 2, * ,
  • 杨寒珺 1 ,
  • 黄星宇 1 ,
  • 张玉琳 1, 3 ,
  • 贾春英 4 ,
  • 鲁为华 1 ,
  • 张凡凡 , 1, *
展开
  • 1 石河子大学动物科技学院,石河子 833000
  • 2 新疆农业科学院拜城农业试验站/国家土壤质量阿克苏观测实验站,拜城 842300
  • 3 塔里木大学动物科学与技术学院,阿拉尔 843300
  • 4 新疆生产建设兵团第三师畜牧兽医工作站,图木舒克 843900
*付彦博,副研究员,E-mail: ;
张凡凡,副教授,硕士生导师,E-mail:

郑晓凯(2000—),男,河北邢台人,硕士研究生,研究方向为饲草生产与加工。E-mail:

收稿日期: 2024-01-18

  网络出版日期: 2024-08-12

基金资助

兵团重大科技项目—南疆沙区盐碱地饲用油菜产业化关键技术研究与集成示范(2018AA005-3)

财政部和农业农村部—国家现代农业产业技术体系项目(CARS)

新疆维吾尔自治区油料产业技术体系拜城综合试验站

收起

Isolation and Identification of Dominant Lactic Acid Bacteria from Brassica napus and Their Effects on Fermentation Quality and Aerobic Stability of Silage

  • ZHENG Xiaokai , 1 ,
  • FU Yanbo , 2, * ,
  • YANG Hanjun 1 ,
  • HUANG Xingyu 1 ,
  • ZHANG Yulin 1, 3 ,
  • JIA Chunying 4 ,
  • LU Weihua 1 ,
  • ZHANG Fanfan , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 833000, China
  • 2 Xinjiang Academy of Agricultural Sciences in Baicheng Agricultural Experiment Stations/National Soil Quality Aksu Observation Experiment Stations, Baicheng 842300, China
  • 3 College of Animal Science and Technology, Tarim University, Alar 843300, China
  • 4 Animal Husbandry and Veterinary Workstation, The Third Division, Xinjiang Production and Construction Corps, Tumushuke 843900, China
*FU Yanbo, associate professor, E-mail: ;
ZHANG Fanfan, associate professor, E-mail:

Received date: 2024-01-18

  Online published: 2024-08-12

Fold

摘要

本研究旨在筛选出饲用油菜(Brassica napus)青贮中天然附着的优势乳酸菌,明确其对饲用油菜青贮发酵品质和有氧稳定性的影响,为饲用油菜资源高效饲料化利用提供指导。首先利用分子生物学法(16S rDNA测序)对分离出的乳酸菌进行鉴定,鉴定出的乳酸菌菌株进行产酸和生长特性分析。进一步将筛选的优势乳酸菌接种至饲用油菜中青贮,采用裹包青贮法,试验设置4个处理:对照(CK)处理不接种菌株;布氏乳杆菌(LB)处理接种布氏乳杆菌,接种量为2×108 CFU/g;屎肠球菌(EF)处理接种屎肠球菌,接种量为2×108 CFU/g;布氏乳杆菌+屎肠球菌(LBEF)处理接种布氏乳杆菌+屎肠球菌(1∶1),接种量均为1×108 CFU/g。结果表明:1)试验共计分离出26株乳酸菌,鉴定后得出25株为布氏乳杆菌,1株为屎肠球菌,其中2株表现出最强的产酸和生长特性。2)发酵60 d时,LBEF处理的中性洗涤纤维和丙酸含量显著低于CK和EF处理(P<0.05);EF和LBEF处理的酸性洗涤纤维含量显著低于CK和LB处理(P<0.05),乳酸含量显著高于CK和LB处理(P<0.05);LB、EF和LBEF处理的pH、氨态氮含量、霉菌数量均显著低于CK处理(P<0.05)。3)开包5 d时,EF和LBEF处理的乳酸含量和乳酸菌数量显著高于CK和LB处理(P<0.05),LBEF处理的丙酸含量显著低于其余处理(P<0.05),LB和LBEF处理的氨态氮含量显著低于其余处理(P<0.05),LBEF和LB处理的酵母菌和霉菌数量显著低于CK和EF处理(P<0.05)。由此可见,在饲用油菜青贮中联合接种布氏乳杆菌和屎肠球菌,可利用底物较少的营养物质产生乳酸,以降低发酵体系pH,抑制蛋白质腐败和霉菌生长,提高饲用油菜有氧稳定。

关键词： 饲用油菜; 乳酸菌; 青贮; 营养品质; 发酵品质; 有氧稳定性

本文引用格式

郑晓凯 , 付彦博 , 杨寒珺 , 黄星宇 , 张玉琳 , 贾春英 , 鲁为华 , 张凡凡 . 饲用油菜中优势乳酸菌的分离鉴定及其对青贮发酵品质和有氧稳定性的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(8) : 5411 -5421 . DOI: 10.12418/CJAN2024.460

Abstract

The aim of this study was to screen the naturally dominant lactic acid bacteria in Brassica napus silage, and determine their effects on fermentation quality and aerobic stability of forage rape silage, so as to provide guidance for efficient feed utilization of Brassica napus resources. Firstly, the isolated lactic acid bacteria were identified by molecular biology method (16S rDNA sequencing), and the identified lactic acid bacteria strains were analyzed for acid production and growth characteristics. Further, the selected dominant lactic acid bacteria were inoculated into Brassica napus for silage, and the wrapped silage method was adopted. Four treatments were set up in the experiment: the control (CK) treatment was inoculated no bacterial strains; the Lactobacillus buchneri (LB) treatment was inoculated the Lactobacillus buchneri, and the inoculation amount was 2×108 CFU/g; the Enterococcus faecium (EF) treatment was inoculated the Enterococcus faecium, and the inoculation amount was 2×108 CFU/g; the Lactobacillus buchneri+Enterococcus faecium (LBEF) treatment was inoculated the Lactobacillus buchneri+Enterococcus faecium, and the inoculation amount was all 1×108 CFU/g. The results showed as follows: 1) 26 lactic acid bacteria were isolated in this experiment, of which 25 strains were identified as Lactobacillus buchneri and 1 strain was Enterococcus faecium. Two of them showed the strongest acid production and growth characteristics. 2) On 60 days of fermentation, the contents of neutral detergent fiber and propionic acid in LBEF treatment were significantly lower than those in CK and EF treatments (P<0.05); the content of acid detergent fiber in EF and LBEF treatments was significantly lower than that in CK treatment (P<0.05), and the content of lactic acid was significantly higher than that of CK and LB treatments (P<0.05); the pH, ammonia nitrogen content and mold number in LB, EF and LBEF treatments were significantly lower than those in CK treatment (P<0.05). 3) On 5 days of unpacking, the lactic acid content and lactic acid bacteria number in EF and LBEF treatments were significantly higher than those in CK and LB treatments (P<0.05), the content of propionic acid in LBEF treatment was significantly lower than that in other treatments (P<0.05), the content of ammonia nitrogen in LB and LBEF treatments was significantly lower than that in other treatments (P<0.05), the numbers of yeast and mold in LBEF and LB treatments were significantly lower than those in CK and EF treatments (P<0.05). In conclusion, the co-inoculation of Lactobacillus buchneri and Enterococcus faecium in Brassica napus silage can use nutrients with less substrate to produce lactic acid, reduce the pH of fermentation system, inhibit protein spoilage and mold growth, and improve the aerobic stability of Brassica napus.

Key words： Brassica napus; lactic acid bacteria; silage; nutritional quality; fermentation quality; aerobic stability

油菜(Brassica napus)是我国的第一大油料作物。近年来各地致力于开发新型油菜资源,如饲用油菜“华油杂”系列等,其不仅具有生长快、生物产量高、改良土壤盐碱等特点[1];且营养物质丰富,饲喂家畜适口性好,提高生产性能效果显著[2-3];但其在加工过程中由于原料含水量较高,直接青贮成功率低[4],因此通过添加合适的发酵剂以确保发酵品质是目前亟须解决的问题。青贮通过微生物厌氧发酵过程,将青绿原料转化为具有更高饲用价值的发酵饲料。发酵过程中,通过添加合适的微生物发酵剂,可以更好地保存原料中的营养物质,提高其营养价值[4];其中,乳酸菌(LAB)是一种重要的微生物,能够利用可溶性碳水化合物(WSC)生成以乳酸(LA)为主的有机酸,从而降低发酵体系的pH,以有效地抑制其他腐败微生物的生长,进而减少发酵过程中的蛋白质水解和干物质(DM)损失,最大化保存青贮中的营养物质[5]。此外,青贮过程中LAB的产酸能力有助于提高青绿原料的适口性,使其更易于消化吸收。前人研究表明,采用同型和异型发酵LAB联合或单独接种的方式,均可不同程度地改善青贮发酵品质[6-7]。诸多研究也均证实了不同发酵类型LAB在豆科、禾本科等牧草青贮中的增益作用,能够有效地抑制有害微生物的生长,提高青贮饲料的营养价值和适口性[8-9]。
然而,当前针对饲用油菜单独青贮的研究较少,仅有关于饲用油菜与籽粒苋、全株玉米及各类作物秸秆等混合青贮的研究。这些研究结果表明,饲用油菜与籽粒苋、全株玉米及各类作物秸秆混合青贮可以显著提高饲料的营养价值和适口性[10⇓-12];同时,在油菜混贮过程中接种LAB或添加纤维素酶等,均可以有效降低发酵体系的营养损失,改善发酵品质,并提高青贮有氧稳定性[10]。理论上看,青绿原料表面附着的LAB相较于外源接种LAB能够更好地适应植物的生存环境,且在发酵过程中植物自然附着的LAB在定植、存活、生长等方面可能具有一定的优势[13]。饲用油菜虽营养物质丰富,但由于原料含水量较高,其表面附着哪些优势LAB,其在发酵过程中的作用情况如何,目前尚不明确。生产上看,混贮工艺和酶制剂的添加使得生产成本提高,难以形成市场优势。鉴于此,本研究对饲用油菜自然青贮过程中LAB进行分离、提取和鉴定,进一步对LAB进行产酸和生长速度分析;最后,将优势LAB再次接种至饲用油菜中,分析其对饲用油菜青贮发酵品质和有氧稳定性的影响,旨在为饲用油菜专用青贮LAB制剂的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

饲用油菜青贮优势LAB筛选试验。以“华油杂”62号饲用油菜(Brassica napus ‘huayouza 62’)为原料,试验地位于新疆维吾尔自治区巴楚县的新疆欣铭和牧业有限公司牛场大田(N 78°57'28″,E 39°74'34″;海拔1 156 m),于2019年9月27日盛花期刈割,饲用油菜刈割机械为自主改装的青饲料收获机(9QZ-2900,石家庄美迪机械有限公司),切割粉碎长度为1~2 cm,收割离地间隙为8~20 cm,田间晾晒12 h[14]。盛花期饲用油菜原料DM含量为26.47%,粗蛋白质(CP)含量为12.25% DM,粗脂肪(EE)含量为8.68% DM,中性洗涤纤维(NDF)含量为50.24% DM,酸性洗涤纤维(ADF)含量为23.21% DM,WSC含量为21.28% DM。
优势LAB接种至饲用油菜青贮试验。以“华油杂”62号饲用油菜为材料,供试LAB为前期优选的2株LAB(菌株R1和R12),分别为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)OR029295与屎肠球菌(Enterococcus faecium)OR029298。饲用油菜于2020年9月20日盛花期刈割,其余生产过程同上。

1.2 试验设计

饲用油菜青贮优势LAB筛选试验。采用罐贮法,每桶装(16.0±0.5) kg饲用油菜,密度600 kg/m3,压紧后用真空机抽干桶内空气,室温避光保存,共计5桶。于60 d后开罐(模拟开窖),随机挑选3桶发酵罐无菌条件下打开,混匀后随机取样。
优势LAB接种至饲用油菜青贮试验。布氏乳杆菌和屎肠球菌分别在MRS液体培养基中进行富集培养,通过平板计数法确定各菌种数量,并将2种菌液浓度均浓缩至2×1011 CFU/g,每1 kg原料加入1 g菌液,使得原料中菌种数量达到2×108 CFU/g,具体以鲜重为基础进行接种,将菌液加入1 L蒸馏水摇匀后,使用水枪均匀喷洒菌液至待青贮原料表面后迅速混匀。试验设置4个处理,对照(CK)处理喷洒1 L的蒸馏水;布氏乳杆菌(LB)处理接种布氏乳杆菌,接种量为2×108 CFU/g;屎肠球菌(EF)处理接种屎肠球菌,接种量为2×108 CFU/g;布氏乳杆菌+屎肠球菌(LBEF)处理接种布氏乳杆菌+屎肠球菌(1∶1),接种量均为1×108 CFU/g。菌液与待青贮原料充分混匀后立即采用裹包机(9YY-55型,山东新圣泰机械制造有限公司)进行裹包青贮,裹包密度600 kg/m3,重量80 kg,每个处理5个重复,共计20包。青贮发酵60 d时开包,测定营养品质、发酵品质、主要微生物数量;同时在开包有氧暴露5 d时检测青贮样品的发酵品质和微生物数量。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 LAB的分离与纯化

取青贮样品20 g,分装于含有180 mL无菌生理盐水锥形瓶中,锥形瓶封口之后使用摇床振荡2 h,梯度稀释后(使用无菌生理盐水),使用涂布法在MRS和M17培养基(北京天根生化科技有限公司)上进行分离培养(37 ℃厌氧培养48 h),各样品各梯度均设置3次重复。接种环挑选典型菌落进行纯化培养,于MRS和M17培养基平板上进行继代划线培养3次,随后接种至固体斜面培养基。纯化后的菌落开展革兰氏染色镜检及过氧化氢酶试验[15]。另将纯化菌落置于MRS和M17液体培养基中进行富集培养(37 ℃厌氧条件48 h),等体积混合甘油后密封,存储于-80 ℃备用。

1.3.2 LAB的16S rDNA序列测定

在对富集培养的液体培养基进行混匀后,依据细菌基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)的操作规程,进行LAB的DNA提取。采用细菌通用引物27F(5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-AG-3')和1495R(5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTTACGA-3')。反应体系为50 μL:DNA模板5 μL,引物27F和1495R(10 μmol/L)各1 μL,2×Master Mix 25 μL,ddH2O补足至50 μL。PCR反应的循环设置为:预变性,94 ℃ 3 min;变性,94 ℃ 30 s,退火,55 ℃ 30 s,延伸,72 ℃ 1 min(30个循环);后延伸,72 ℃ 5 min[16]。反应结束后,将产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
LAB的16S rDNA序列在GenBank中进行对比,用MEGA7.0中的Clustal W对最近类群的序列进行多重比较分析,并通过邻近(neighbor-joining)法构建系统发育树,确定各菌株分类地位。

1.3.3 LAB生长速率和产酸速率分析

将富集培养的LAB悬液按照3%的接种量添加至新的MRS和M17液体培养基中(需将初始培养基pH均调至6.2),37 ℃恒温培养24 h。每隔2 h在无菌条件下取样,用pH计(PHSJ-3F,上海雷磁仪器有限公司)测定不同时间点培养基的pH;采用无菌培养基作为空白,使用紫外可见分光光度计(U-2910,日本日立公司)在波长600 nm下测定不同时间点菌液的吸光度值。针对每株菌,均进行3次重复试验。随后,将所得测定数据汇总,绘制生长速率曲线与产酸速率曲线。

1.3.4 优选LAB对饲用油菜营养品质的测定

营养品质指标的测定主要包括DM、CP、EE、NDF和ADF含量。DM含量通过烘干法进行测定,CP含量通过凯氏定氮法进行测定,EE含量通过索氏抽提法进行测定,NDF和ADF的含量采用范氏(Van Soest)洗涤纤维法[17-18]进行测定。

1.3.5 优选LAB对饲用油菜发酵品质的测定

发酵品质指标的测定主要包括pH及WSC、LA、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)、氨态氮(NH3-N)含量。其中,pH通过酸度计进行测定,WSC含量的检测则采用蒽酮比色法,有机酸(LA、AA、PA、BA)含量通过液相色谱法进行分析,NH3-N含量采用苯酚次氯酸钠比色法[18]进行测定(基于总氮含量)。

1.3.6 微生物数量的测定

各处理随机取20 g青贮样品装入180 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,密封后置于摇床振荡1 h,制备成为样品悬液,利用无菌生理盐水梯度稀释,并选择适宜梯度,并利用平板计数法测定LAB(MRS琼脂培养基,37 ℃,厌氧)、酵母菌(麦芽糖浸粉琼脂培养基,25 ℃,好氧)、霉菌(高盐察氏培养基,25 ℃,好氧)、好氧细菌(LB琼脂培养基,30 ℃,好氧)数量,平板计数后计算微生物数量。

1.3.7 有氧暴露下发酵参数的测定

样品开包后将样品打散,随机取样,松散放置于开口塑料箱(1 m×1 m×1 m)中,使用塑料篷布进行覆盖,并用牙签在篷布上均匀扎制若干小孔,防止交叉污染、减少水分损失,置于阴凉处存放5 d后,测定各样品营养品质、发酵物品质及主要微生物数量。各指标测定方法同上。

1.4 数据处理

试验数据使用Excel 2019进行预处理,采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法进行多重比较。采用Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 饲用油菜自然青贮中LAB的分离与鉴定

2.1.1 LAB的分离与鉴定

对所有分离纯化的LAB进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验,其中革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶试验呈阴性的菌株能够初步断定其为LAB,通过测定菌株共26株。将得到的26株LAB通过PCR扩增及测序,得到26株LAB的序列,经BLAST比对后发现26株菌与标准菌株的序列相似性均达到99%以上(表1)。将所有LAB分别选择部分参考菌株构建系统进化树(图1),结果表明株菌R12属于屎肠球菌,其他株菌均属于布氏乳杆菌。
表1 LAB菌株的16S rDNA基因序列分析结果

Table 1 Results of 16S rDNA gene sequence analysis of LAB strains

菌株
Strains		 登录号
Accession number		 密切相关菌株
Closely related strain		 与GenBank中密切相关菌株的相似性
Similarity with closely described
species in GenBank/%
R1 OR029295 布氏乳杆菌CDO34-17-3 99.93
R2 OR029307 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
R3 OR029306 布氏乳杆菌HBUAS70171 99.93
R4 OR029304 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
R5 OR029303 布氏乳杆菌HBUAS70154 99.86
R6 OR029302 布氏乳杆菌CDO34-17-15 99.93
R7 OR029296 布氏乳杆菌NK01 99.80
R8 OR029301 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
R9 OR029300 布氏乳杆菌CDO34-17-16 99.93
R10 OR029305 布氏乳杆菌CDO34-17-11 99.93
R11 OR029299 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
R12 OR029298 屎肠球菌BIOPOP-3 3 99.93
R13 OR029297 布氏乳杆菌CDO34-R5 99.93
T1 OR029289 布氏乳杆菌CDO34-17-15 99.93
T2 OR029288 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
T3 OR029287 布氏乳杆菌CDO34-17-17 99.93
T4 OR029286 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
T5 OR029285 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
T6 OR029284 布氏乳杆菌CDO34-R5 99.93
T7 OR029283 布氏乳杆菌CDO34-17-15 99.93
T8 OR029282 布氏乳杆菌CDO34-17-17 99.93
T9 OR029294 布氏乳杆菌CDO34-R1 99.93
T10 OR029293 布氏乳杆菌CDO34-17-8 99.93
T11 OR029292 布氏乳杆菌CDO34-17-18 99.93
T12 OR029291 布氏乳杆菌CDO34-17-16 99.93
T13 OR029290 布氏乳杆菌FD1 99.73
图1 LAB菌株的16S rDNA系统发育树

Lactobacillus buchneri strain:布氏乳杆菌菌株;Enterococcus faecium strain:屎肠球菌菌株。

Fig.1 Phylogenetic tree of LAB strains according to 16S rDNA

2.1.2 LAB菌株的产酸速率曲线和生长速率曲线

不同菌株的产酸速率曲线见图2-A,各菌株培养液的pH在24 h内均降至5.0以下,其中菌株R1和菌株R12在24 h内降低至4.5以下,因此其产酸能力比其他菌株更强。不同菌株的生长速率曲线见图2-B,在培养6 h时,菌株R1和菌株R12进入对数生长期;在培养12 h时,菌株R1和菌株R12进入稳定期,显著优于其他菌株。各菌株的生长速率与产酸速率表现基本一致,在菌株进入生长期时产酸速率会上升,进入稳定期时产酸速率会减缓。
图2 LAB菌株的产酸速率曲线和生长速率曲线

Fig.2 Acid production rate curve and growth rate curve of LAB strains

2.2 优选LAB对饲用油菜发酵品质及有氧稳定性的影响

2.2.1 饲用油菜青贮发酵60 d时发酵品质及微生物数量

由表2可知,发酵60 d时,各处理之间EE含量差异显著(P<0.05),其中EF处理的EE含量最高。LBEF处理的NDF、PA含量显著低于CK和EF处理(P<0.05)。EF和LBEF处理的ADF含量显著低于CK处理(P<0.05)。EF处理的WSC含量显著低于CK处理(P<0.05)。EF和LBEF处理的LA含量显著高于CK和LB处理(P<0.05)。LB处理的AA含量显著高于CK处理(P<0.05)。CK处理的pH、NH3-N含量、霉菌数量均显著高于其余处理(P<0.05),LAB数量均显著低于其余处理(P<0.05)。LB处理的酵母菌数量显著高于EF和LBEF处理(P<0.05)。BA在发酵结束时未检测出。其余指标各处理之间差异不显著(P>0.05)。
表2 饲用油菜青贮发酵60 d时发酵品质及微生物数量

Table 2 Fermentation quality and microbial quantity of Brassica napus silage fermented for 60 days

项目
Items		 原料
Raw
material		 处理Treatments 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CK LB EF LBEF
干物质DM/% 27.73 24.10 24.49 24.45 24.39 0.258 0.965
粗蛋白质CP/% DM 13.99 10.14 10.57 10.74 10.63 0.236 0.861
粗脂肪EE/% DM 8.92 7.45c 6.52d 8.36a 7.91b 0.229 0.003
中性洗涤纤维NDF/% DM 44.29 40.71a 39.73b 40.32a 38.22c 0.319 0.004
酸性洗涤纤维ADF/% DM 19.95 17.10a 16.64b 15.25c 15.16c 0.280 0.002
可溶性碳水化合物WSC/%DM 18.45 6.50a 5.88b 5.41c 5.92b 0.121 0.015
pH 6.05 4.27a 4.02b 4.01b 4.05b 0.037 0.010
乳酸LA/(g/kg DM) 0.61 4.15b 4.31b 5.03a 4.83a 0.112 0.005
乙酸AA/(g/kg DM) 0.17 1.44c 2.25a 1.79b 1.62b 0.093 0.029
丙酸PA/(g/kg DM) ND 0.33a 0.27ab 0.30a 0.21b 0.016 0.013
丁酸BA/(g/kg DM) ND ND ND ND ND
氨态氮NH3-N/% 0.39 4.20a 3.23b 3.35b 3.01b 0.150 0.002
乳酸菌LAB/[lg(CFU/g FM)] 9.23 8.46b 9.03a 9.26a 9.32a 0.105 0.001
酵母菌Yeast/[lg(CFU/g FM)] 6.25 5.11ab 5.21a 5.05b 4.99b 0.033 0.013
霉菌Mold/[lg(CFU/g FM)] 4.32 3.58a 2.65b 2.77b 2.72b 0.115 0.003
好氧细菌AB/[lg(CFU/g FM)] 9.65 8.53 8.61 8.58 8.66 0.023 0.276

原料不进行比较。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。ND为未检测出。下表同。

The raw material was not compared. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). ND was not detected. The same as below.

2.2.2 饲用油菜青贮开包5 d时pH、发酵品质、有机酸含量及微生物数

由表3可知,开包5 d时,CK处理的pH显著高于其余处理(P<0.05)。LB处理的CP含量显著高于EF处理(P<0.05)。LBEF处理的NDF含量显著低于其余处理(P<0.05)。LB处理的ADF含量显著低于CK处理(P<0.05)。LB处理的EE含量显著低于其余处理(P<0.05)。EF和LBEF处理的LA含量和LAB数量显著高于CK和LB处理(P<0.05)。LB处理的AA含量显著高于CK和EF处理(P<0.05)。LBEF处理的PA含量显著低于CK处理(P<0.05)。LB和LBEF处理的NH3-N含量显著低于其余处理(P<0.05)。LBEF和LB处理的酵母菌和霉菌数量显著低于CK和EF处理(P<0.05)。LB和LBEF处理的好氧细菌数量显著低于CK处理(P<0.05)。CK处理的BA含量显著高于EF处理(P<0.05)。其余指标各处理之间差异不显著(P>0.05)。
表3 饲用油菜青贮开包5 d时pH、发酵品质、有机酸含量及微生物数量

Table 3 pH, fermentation quality, organic acid contents and microbial quantity of Brassica napus silage after 5 days of unpacking

项目
Items		 处理Treatments 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CK LB EF LBEF
干物质DM/% 23.33 23.32 23.54 23.49 0.081 0.762
pH 5.37a 5.04b 5.07b 5.08b 0.045 0.003
粗蛋白质CP/% DM 7.14ab 7.57a 6.21b 7.42ab 0.254 0.024
中性洗涤纤维NDF/% DM 39.29a 38.37b 38.71ab 37.34c 0.862 0.025
酸性洗涤纤维ADF/% DM 25.58a 19.34b 25.20a 21.63ab 0.897 0.008
粗脂肪EE/% DM 6.03b 5.12c 6.68a 5.72ab 0.497 0.015
可溶性碳水化合物WSC/% DM 5.08 5.26 5.21 5.62 0.095 0.028
乳酸LA/% FM 2.06b 2.13b 2.57a 2.47a 0.066 0.003
乙酸AA/% FM 2.87c 4.18a 3.17b 3.84ab 0.160 0.004
丙酸PA/% FM 0.55a 0.43ab 0.41ab 0.34c 0.029 0.039
丁酸BA/% FM 0.29a ND 0.03b ND 0.037 <0.001
氨态氮NH3-N/% 6.02a 4.07c 5.59b 4.02c 0.283 0.002
乳酸菌LAB/[lg(CFU/g FM)] 7.56b 8.13b 8.46a 8.43a 0.149 0.014
酵母菌Yeast/[lg(CFU/g FM)] 7.03a 6.35c 6.83b 6.47c 0.171 0.004
霉菌Mold/[lg(CFU/g FM)] 4.36a 3.16c 3.98b 3.21c 0.127 0.003
好氧细菌AB/[lg(CFU/g FM)] 9.33a 8.63b 8.95ab 8.73b 0.095 0.002

3 讨论

3.1 饲用油菜自然发酵中LAB的分离及鉴定

植物自身附着的LAB相较于外源添加的LAB更适应植物自身的生存环境,从植物原料中分离筛选用以青贮的优良LAB是最为便捷有效的方法之一[15]。本研究从饲用油菜自然青贮中筛选鉴定出26株菌,其中25株属于布氏乳杆菌,1株属于屎肠球菌。通过产酸和生长速率可以直观地反映LAB在青贮发酵过程中能够利用植物资源发酵能力的参数,也是作为筛选用以青贮的优质LAB必要条件[5]。本研究中筛选出的所有菌株在发酵过程中生长停滞期不明显,说明LAB在培养液环境下生长的速度很快;LAB数量的增多会提高LA含量,从而使得pH迅速降低;其中菌株R1(布氏乳杆菌OR029295)和菌株R12(屎肠球菌OR029298)生长速率和产酸能力较其他菌种更强。以往也有大量研究证实,布氏乳杆菌和屎肠球菌作为LAB制剂在玉米、紫花苜蓿、燕麦、构树青贮中均有大量应用,可显著改善不同原料的青贮品质[19⇓⇓-22]。因此,作为促进饲用油菜青贮发酵的LAB制剂,理论上可行且不存在环境风险。

3.2 优选LAB对饲用油菜发酵品质的影响

青贮饲料DM损失多是较有价值的营养物质,如糖、淀粉和可溶性蛋白质等[23]。本研究中,接种LAB未增加DM和CP的损失,但各处理与原料相比CP含量大幅度下降,其原因可能是发酵过程中微生物作用导致。NH3-N含量可以反映青贮饲料中蛋白质的降解程度,是评价青贮品质的重要指标[23]。本研究中,各接种LAB处理均能降低NH3-N含量;从而减少蛋白质损失,降低NH3-N生成,这与以往研究结果[24-25]相同。青贮饲料中的NDF和ADF含量与家畜的采食量关系密切,直接影响其适口性和消化率[26]。本研究中,联合接种处理降低NDF和ADF含量效果最为显著,其一方面由于酸性环境的形成,促进了细胞壁酸解作用[27];另一方面可能与细菌素的生成相关[7],具体原因有待继续研究。青贮发酵底物WSC含量高低是确保发酵是否能够进行的主要指标之一,合适的WSC含量能够保证青贮发酵的程度和速度[28]。本研究中,各接种LAB处理均降低了WSC含量,主要是由于LAB对底物糖原的利用所致[23]。
pH是衡量青贮是否成功的关键指标[27]。本研究中,各接种LAB处理的pH(4.01~4.05)均达到较低水平,说明外源接种LAB进一步提高了饲用油菜青贮中LAB的产酸能力,其中各接种LAB处理的LA、AA含量较CK处理明显提高,表明饲用油菜青贮表面附着优势LAB可以满足青贮厌氧发酵条件。此外,屎肠球菌无论单独或联合接种,其产LA含量均高于布氏乳杆菌单独接种和CK处理;布氏乳杆菌单独接种处理AA含量显著高于其余处理,且对于WSC的消耗屎肠球菌显著高于布氏乳杆菌,这与同、异型发酵LAB的特征相同[6]。青贮中PA和BA是衡量青贮饲料质量的重要指标[29]。本研究中,各处理均检测出少量PA,但均未检测出BA,可能是由于制作饲用油菜青贮的原料具备营养丰富的底物,且以LAB为主导的发酵体系快速产酸达到了较低的pH,进而抑制有害微生物生长[22]。本研究中,各接种LAB处理均显著提高饲用油菜青贮中LAB数量,这与前人研究结果[5]基本一致。此外,虽接种不同菌种相较于CK处理并未明显影响酵母菌数量,但菌种之间产生了明显的差异,即单独或联合接种时,酵母菌的数量发生了明显变化,其原因可能为不同酸性物质(LA、AA、PA)对酵母菌的影响所致[5],具体互作关系还有待进一步研究。

3.3 优选LAB对饲用油菜青贮开包5 d时有氧稳定性的影响

青贮饲料的有氧稳定性是评定青贮饲料价值的重要指标[25]。本研究中,各接种LAB处理的有氧稳定性均得到了增强,其中LB和LBEF处理的效果最好,这与前人研究结果[22-23]一致。本研究中,各接种LAB处理的pH显著低于CK处理,LAB数量显著高于CK处理,这主要是由于外源接种LAB有效增加了青贮中LAB数量,延缓了青贮pH的升高。本研究中,各处理CP含量均发生下降,但其中以EF处理较为明显,这可能与屎肠球菌为同型LAB,无法维持较好的有氧稳定性有关[30]。各接种LAB处理的NH3-N含量变化中,EF处理显著高于LB和LBEF处理,这进一步证明了同型LAB的特征,同时表明联合接种屎肠球菌和布氏乳杆菌相较于单独接种屎肠球菌提高了青贮CP和NH3-N含量的稳定性。EF和LBEF处理的LA含量高于其余处理;但LB处理的AA含量显著高于EF和LBEF处理,其中EF处理AA含量最低;同时BA仅在CK和EF处理中检测出。这可能是由于同型LAB主要代谢LA,但青贮中存在利用LA作为原料的真菌发酵,青贮接触氧气后,此类真菌就会快速生长,导致青贮产生二次发酵,从而降低青贮有氧稳定性,而异型LAB可通过产生AA防止青贮饲料二次发酵,从而提高青贮的有氧稳定性[31]。本研究中,酵母菌、霉菌和好氧细菌的数量均明显增加,而各接种LAB处理中,LB和LBEF的酵母菌和霉菌数量明显低于EF处理,其中以LB处理最低,其原因主要为异型LAB可以在有氧环境下抑制有害微生物的生长,而同型LAB无法做到[29,32]。

4 结论

① 本研究从饲用油菜青贮中分离鉴定得到26株LAB,经16S rDNA序列分析,25株为布氏乳杆菌,1株为屎肠球菌,其中布氏乳杆菌OR029295和屎肠球菌OR029298的产酸能力最强,生长速率最快。
② 在饲用油菜青贮中联合接种布氏乳杆菌OR029295和屎肠球菌OR029298,可利用底物较少的营养物质产生LA,以降低发酵体系pH,抑制蛋白质腐败和霉菌生长,提高饲用油菜有氧稳定。

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