基于中红外光谱技术快速检测生乳中的腐胺

佀博学; 张养东; 郑楠; 王加启

doi:10.12418/CJAN2024.462

动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 8: 5432 - 5440

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.462

研究论文

基于中红外光谱技术快速检测生乳中的腐胺

佀博学 ^,¹^,² ,
张养东 ¹^,² ,
郑楠 ¹^,² ,
王加启 ^,¹^,²^,^*

展开

¹ 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室,北京 100193
² 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,畜禽营养与饲养全国重点实验室,北京 100193

*王加启,研究员,博士生导师,E-mail: jiaqiwang@vip.163.com

佀博学(1997—),男,山东郓城人,硕士研究生,从事奶牛营养与牛奶品质研究。E-mail: siboxue0607@163.com

收稿日期: 2024-03-04

网络出版日期: 2024-08-12

基金资助

国家重点研发计划(2022YFD1301004)

中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS12)

国家奶牛产业技术体系(CARS-36)

收起

Rapid Detection of Putrescine in Raw Milk Based on Mid-Infrared Spectroscopy Technology

SI Boxue ^,¹^,² ,
ZHANG Yangdong ¹^,² ,
ZHENG Nan ¹^,² ,
WANG Jiaqi ^,¹^,²^,^*

Expand

¹ Key Laboratory of Quality & Safety Control for Milk and Dairy Products of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
² State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

*professor, E-mail: jiaqiwang@vip.163.com

Received date: 2024-03-04

Online published: 2024-08-12

Fold

摘要

本试验旨在通过建立中红外光谱预测模型实现生乳中腐胺的快速检测。将采集到的16个牧场生乳样品在4 ℃条件下贮藏0~7 d,使用高效液相色谱-质谱法定量检测生乳中腐胺含量;通过FT 120乳成分分析仪采集生乳的中红外光谱,将原始中红外光谱先通过标准正态变量变换(SNV)、Savitsky-Golay(SG)平滑、一阶导数或二阶导数等预处理方法消除背景噪音,再利用偏最小二乘回归(PLSR)法构建腐胺预测模型。结果显示:通过比较不同中红外光谱预处理方法,最终选择SG平滑+二阶导数预处理光谱建立腐胺预测模型,该模型测试集决定系数(R²)为0.995 9,均方根误差(RMSE)为0.054 2,验证集R²为0.811 2,RMSE为0.368 4,具有良好的准确性。本试验基于中红外光谱建立了生乳中腐胺快速检测方法,可为生乳中腐胺的快速检测提供参考。

关键词： 中红外光谱; 生乳; 腐胺; 偏最小二乘回归

本文引用格式

佀博学 , 张养东 , 郑楠 , 王加启 . 基于中红外光谱技术快速检测生乳中的腐胺[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(8) : 5432 -5440 . DOI: 10.12418/CJAN2024.462

Abstract

The aim of this experiment was to establish a mid-infrared spectral prediction model for the rapid detection of putrescine in raw milk. Raw milk samples collected from 16 farms were stored at 4 ℃ for 0 to7 d. The content of putrescine in raw milk was detected by high performance liquid chromatography-mass spectrometry method, and the mid-infrared spectrum of raw milk was collected by FT 120 milk composition analyzer. The original mid-infrared spectrum was preprocessed by standard normal variate transformation (SNV), Savitsky-Golay (SG) smoothing, first-order derivative or second-order derivative to eliminate background noise, and then partial least squares regression (PLSR) method was used to construct the putrescine prediction model. The results showed that by comparing different mid-infrared spectral preprocessing methods, the SG smoothing+second-order derivative preprocessing method was finally chosen to preprocess the spectra to establish a prediction model, the model has an determination coefficient (R²) of 0.995 9 and an root mean square error (RMSE) of 0.054 2 for the test set and an R² of 0.811 2 and an RMSE of 0.368 4 for the validation set, providing good accuracy and stability. In conclusion, a rapid method for the determination of putrescine in raw milk is established based on mid-infrared spectroscopy, which can provide reference for the rapid detection of putrescine in raw milk.

Key words： mid-infrared spectroscopy; raw milk; putrescine; partial least squares regression

新鲜牛奶中的活性营养物质(如乳铁蛋白、免疫球蛋白等)可以有效提高人体免疫力,构建安全屏障,应对新冠肺炎等疾病^[1-2]。牛奶中丰富的营养物质不仅能为人类提供能量,也是微生物生长繁殖的绝佳培养基,所以极易发生腐败变质,导致新鲜度降低。生乳位于奶产业链的最上游,不新鲜或变质的生乳直接影响乳产品质量,使人类不仅不能获得丰富的营养物质和能量,而且还可能影响身体健康^[3]。因此,对生乳新鲜度的评价具有重要的现实意义。目前生乳新鲜度评价主要以常规方法为主,如进行酸度、菌落总数测定等,这些检测方法具有操作复杂、耗时长、主观性强、难以批量操作等弊端,已经难以应对现代化的检测需要^[4]。因此,亟需探索新的生乳新鲜度评价指标和检测方法。生乳中丰富的营养物质在储藏过程中极易受到微生物和环境变化的影响导致新鲜度下降,发生腐败变质。乳蛋白在微生物及内、外源酶的作用下分解为游离氨基酸,随储藏时间的延长不断分解为生物胺、醛、酮等小分子物质^[5]。生物胺作为食品腐败变质过程中的产物,常被认为是食品新鲜度评价的重要指标^[6⇓-8]。

腐胺(PUT)是生物胺家族中的一种,常见于奶制品、肉类、鱼等食物中^[9⇓-11],其含量在食物储存过程中变化最为显著,是食物新鲜度评价的重要指标之一。从20世纪开始,腐胺就被广泛应用于食品新鲜度评价领域。在猪肉新鲜度评价中,Slemr等^[12]、Hernández-Jover等^[13]发现腐胺含量变化与猪肉新鲜度关系密切;在牛肉新鲜度评价中,Vinci等^[8]、Franco等^[14]提出腐胺可以作为牛肉新鲜度的评价指标;在鸡肉新鲜度评价中同样发现腐胺含量的变化可以表征新鲜度^[15-16]。有研究报道,生乳中腐胺含量在冷藏条件下变化规律简单,与感官指标、酸度呈现良好的正相关^[1];赵瑞^[5]对生乳中腐败标志物的筛选研究发现,无论是在4 ℃冷藏条件下还是在20 ℃常温条件下,生乳中腐胺含量均随贮存时间的延长而增加,且温度越高腐胺含量增加速度越快,这表明生乳中的腐胺含量可用于生乳新鲜度评价。目前腐胺的检测方法主要为高效液相色谱法,该方法具有检测准确、灵敏高、重现性好等优点,但是也存在操作繁琐、耗时长、有机试剂污染、仪器昂贵不能普遍推广的弊端。

中红外光谱是一种经济、快速、无污染、能批量操作的检测方法,已被广泛应用于快速测定牛奶成分^[17-18]。在我国奶牛生产性能测定(DHI)中,乳脂肪、乳蛋白、乳糖、总固形物、非脂固形物等指标均采用中红外光谱检测,通过建立生乳中腐胺中红外光谱检测方法能实现一次上机多项指标批量检测,真正实现高效、节能、经济、环保。

为确定使用中红外光谱检测生乳中腐胺的可能性,本试验尝试对全波段的中红外光谱进行不同的降噪方式处理,并结合偏最小二乘回归(PLSR)法建立腐胺的定量分析模型,探求建立一种准确、快速、便捷的生乳中腐胺的检测方法,以期为生乳新鲜度评价提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 化学试剂与标准品

质谱级乙腈(美国Fisher公司)纯度≥99.9%,色谱级甲酸(上海麦克林公司)纯度≥99.0%,色谱级甲酸铵(德国Fluka公司)纯度≥99.0%。超纯水由Milli-Q净化系统(美国Millipore公司)制备。

标准品:腐胺(PUT),浓度为100 μg/mL,纯度≥98%,购于天津阿尔塔科技有限公司;内标:1,7-二氨基庚烷(DIA),纯度≥98%,购于上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

SCIEX Qtrap 6500+液相质谱联用仪(美国AB公司)、色谱柱(Atlantis^TM Premier BEH Z-HILIC,2.5 μm,2.1 mm×150 mm,1/pk,美国Waters公司)、AL204型分析天平(感量0.1 mg,美国梅特勒托利多仪器上海有限公司)、MFV-24氮吹仪(广州得泰仪器科技有限公司)、Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司)、CR22G型落地高速冷冻离心机(日本日立中国有限公司)、有机相针头式滤器(0.22 μm,天津腾津实验仪器有限公司)、DMT-2500多管涡旋混合仪(杭州米欧仪器有限公司)、WAT-NW-35C高纯氮气发生器[普敦实验室设备(上海)有限公司]、移液枪(北京京科瑞丰科学仪器有限公司)、超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司)、FT 120乳成分分析仪(丹麦FOSS公司)。

1.3 样品采集与制备

生乳样品采集于北京三元乳业工厂和内蒙古蒙牛乳业六期工厂,每个工厂共采集8个不同牧场的奶罐车,共计16个牧场的生乳样品。样品采集后立即在低温冷藏条件下运送至实验室,在4 ℃条件下冷藏0、1、2、3、4、5、6、7 d,在对应的时间点进行腐胺和中红外光谱的检测,共计128个样品数据。

1.4 腐胺测定

参考赵瑞^[5]对乳中生物胺的液相质谱检测方法,并进行优化来检测生乳中腐胺含量。使用SCIEX Qtrap 6500+液相质谱联用仪进行生乳中腐胺的测定,色谱柱为Atlantis^TM Premier BEH Z-HILIC。

具体优化前处理步骤为:移取1 mL样品于15 mL离心管中,添加3 mL 2%甲酸/乙腈,涡旋振荡1 min,4 ℃下13 000×g离心10 min,全部转移上清液于离心管中,氮气吹至近干。添加2 mL 0.5%甲酸水/乙腈(v/v,3∶7)溶液复溶(稀释2倍),超声1 min,经有机微孔滤膜过滤,取过滤液于上机小瓶并添加10 μL DIA(内标)定溶至1 mL,上机测定。最主要的优化部分是在前处理步骤中添加了内标,简化了前处理步骤,省略了除脂(使用正己烷去除乳脂肪)步骤,减少了有机试剂使用,缩短了前处理时间。并且通过添加内标可以有效降低基质效应,在方法学验证中回收率更加稳定。

色谱条件:流动相A为0.1%甲酸-50 mmol/L甲酸铵;流动相B为0.5%甲酸-乙腈;流速为0.350 mL/min;进样量为5 μL;柱温为45 ℃。

质谱条件:电喷雾正离子(ESI+)模式扫描;电喷雾电压为3 000 V;离子源温度为400 ℃;雾化气气压(GS1)为50 psi;辅助气气压(GS2)为55 psi;气帘气压力(CUR)为30 psi。

选择多反应监测模式(MRM)对腐胺进行定量分析。流动相梯度洗脱程序见表1,腐胺质谱采集参数见表2。

表1 流动相梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution procedure of mobile phases

时间 Time/min	流速 Flow velocity/(mL/min)	流动相A Mobile phase A/%	流动相B Mobile phase B/%
0	0.350	30.0	70.0
1.0	0.350	30.0	70.0
2.5	0.350	60.0	40.0
6.5	0.350	60.0	40.0
7.0	0.350	30.0	70.0
8.0	0.350	30.0	70.0

表2 腐胺质谱采集参数

Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of PUT

化合物 Compounds	保留时间 Retention time/min	母离子质荷比 m/z of precursor ion	子离子质荷比 m/z of product ion	去簇电压 DP/V	碰撞能量 CE/V
腐胺PUT	3.83	89.1	72.1^*	30	14
			30.0	30	22
1,7-二氨基庚烷(内标) DIA (IS)	3.11	131.1	114.0^*	15	14
			66.0	15	10

*:定量离子 quantitative ion。

1.5 中红外光谱测定

将生乳样品置于45 ℃水浴锅中,加热10 min,然后摇晃均匀,通过FT 120乳成分分析仪扫描光谱,获得中红外光谱的波数范围为930~5 000 cm^-1。

1.6 光谱建模

生乳样品在光谱扫描过程中会产生许多背景噪音和无效信息,为实现数据处理的正确性需要对原始光谱数据进行预处理。将采集得到的中红外光谱数据通过化学计量软件Unscrambler X10.4进行降噪和预处理。本试验采用的预处理方法主要包括标准正态变量变换(standard normal variate transformation,SNV)、Savitsky-Golay(SG)平滑、一阶导数和二阶导数。中红外光谱数据经过降噪后,采用A/(SDev+B)法进行数据归一化处理,利用偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)法构建预测模型。将所测数据随机分为20组,每组6或7个数据,然后采用随机交叉验证法进行模型验证。将样品预测值与真实值进行比较,计算决定系数(R²)和均方根误差(root mean square error,RMSE)评估预测模型的效果^[19],R²越接近于1,RMSE越小,表示预测模型效果越好^[20]。

R²=1-

∑ i = 1 n (y i, 真 实 - y^i, 预 测) 2 ∑ i = 1 n (y i, 真 实 - y - 真 实) 2

;

RMSE=

∑ i = 1 n (y i, 真 实 - y^i, 预 测) 2 n - 1

。

式中:y_i_,真实为生乳i的真实值;

y^i, 预 测

为生乳i的预测值;

y - 真 实

为生乳样品真实值的平均值;n为生乳样品的数量。

1.7 统计分析

通过Excel 2016进行数据的初步汇总和统计,采用SPSS 26.0统计分析软件对所得试验数据进行独立样本t检验,使用Origin 2024完成线性回归分析和相关图形绘制。

2 结果与分析

2.1 生乳腐胺含量测定结果

按照1.4中方法完成生乳样品中腐胺含量的测定,得到生乳样品中腐胺含量范围为0.92~1 972.88 ng/mL,平均值为112.94 ng/mL,标准偏差为228.06 ng/mL,生乳腐胺含量检测结果与赵瑞^[5]的研究结果相近。因生乳中腐胺含量数据呈偏态分布(图1-A),无法进行下一步统计分析,故将数据进行对数(lg)转换^[21]。lg转换后腐胺含量范围为-0.03~3.30 lg(ng/mL),平均值为1.37,标准偏差为0.85,数据趋于正态分布(图1-B),可作为有效数据进行下一步中红外光谱预测模型的建立。

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图1 生乳样品腐胺分布图

A:腐胺 PUT;B:对PUT进行对数转换 perform lg conversion on PUT。

Fig.1 Distribution of PUT in raw milk samples

2.2 生乳中红外光谱特征

生乳样品的原始光谱如图2所示,大致可以分为5个区域,波数范围为930~5 000 cm^-1,这与褚楚等^[22]对牛奶扫描的中红外光谱波数范围相同。A区域波数在930~1 582 cm^-1,是中波红外区-长波红外区,此区域蕴含信息丰富,被称为“指纹区”,是预测乳中成分的主要区域,常与C-H、C=C、C-O和N-O等化学键相关^[23];B区域波数在1 582~1 698 cm^-1,是中波红外区域-2;C区域波数在1 698~3 048 cm^-1,是中波红外区域-1,此区域同样包含丰富的信息,通常与C-H、C=O、C-N和N-H化学键有关,能够预测乳脂含量^[24];D区域波数在3 048~3 669 cm^-1,是短波红外区-中波红外区;E区域波数在3 669~5 000 cm^-1,是短波红外区,所含信息少,通常认为与乳中成分化学键无关^[25-26]。B区域和D区域光谱峰杂乱无章,表明这是水吸收峰产生,普遍认为这部分光谱变异程度大不能单独预测样品成分^[27]。中红外全波段光谱具有数据丰富、覆盖范围广、适应性广泛的特点;冯水娟^[28]和吴迪等^[29]通过中红外全波段光谱建立了奶粉中蛋白质的预测模型,并且模型预测效果良好,腐胺是蛋白质的降解产物,因此本试验同样选择通过中红外全波段光谱建立预测模型。徐琛善等^[30]通过中红外光谱建立了牛奶中土霉素的预测模型,并比较了全波段和部分波段的模型的判别效果,结果显示,全波段预测模型判别效果高于400~2 000 cm^-1波段,与2 000~4 000 cm^-1波段判别效果相同。因此,本试验选择采用中红外全波段光谱进行建模,在保证预测模型效果的同时也简化了建立预测模型的步骤。

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图2 生乳样品原始中红外光谱图

Fig.2 Original mid-infrared spectrogram of raw milk samples

2.3 中红外光谱预测模型建立

由于生乳样品原始光谱信息中存在大量背景噪音,因此需要采用不同的光谱预处理方法来去除这些干扰信号,本试验选择了SNV、SG平滑和导数法这3种不同的预处理方法,按照自由组合的方式进行光谱数据处理,通过PLSR和不同的光谱预处理方法分别建立了生乳中腐胺的中红外预测模型。由表3可知,未处理的原始光谱建立的预测模型的测试集R²为0.896 0,RMSE为0.271 6,验证集R²为0.659 2,RMSE为0.497 5,原始光谱经预处理后,部分中红外光谱预测模型的效果明显改善。经过比较不同的光谱预处理方法的建模结果,最后确定采用SG平滑+二阶导数预处理结合PLSR建立生乳中腐胺中红外预测模型,见图3。原始光谱经SG平滑+二阶导数预处理后建立的预测模型测试集R²上升为0.995 9,RMSE下降为0.054 2,验证集R²上升为0.811 2,RMSE下降为0.368 4。

表3 不同中红外光谱预处理方法建立PLSR模型的预测结果

Table 3 Prediction results of PLSR models established using different mid-infrared spectral preprocessing methods

预处理方法 Preprocessing methods	指标Indicators
	测试集Test set		验证集Validation set
	决定系数 R²	均方根误差 RMSE	决定系数 R²	均方根误差 RMSE
未处理(原始光谱) Untreated (original spectrum)	0.896 0	0.271 6	0.659 2	0.497 5
SG平滑SG smoothing	0.872 6	0.307 0	0.545 5	0.590 4
标准正态变量变换SNV	0.975 7	0.134 4	0.787 4	0.39 90
一阶导数First-order derivative	0.902 2	0.258 3	0.737 7	0.426 8
二阶导数Second-order derivative	0.817 3	0.352 8	0.613 9	0.514 8
SG平滑+一阶导数 SG smoothing+first-order derivative	0.800 9	0.375 0	0.621 0	0.521 3
SG平滑+二阶导数 SG smoothing+second-order derivative	0.995 9	0.054 2	0.811 2	0.368 4

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图3 生乳中腐胺(lg)的预测模型

Slope:斜率;Offset:偏移;RMSE:均方根误差 root-mean-square error;R-Square:决定系数 determination coefficient。

Fig.3 Prediction model for PUT (lg) in raw milk

2.4 模型验证

使用中红外光谱预测模型对生乳中的腐胺实测值(lg)进行了预测,将实测值作为X轴,预测值作为Y轴,通过Oringin软件进行了线性相关分析,结果见图4。线性分析结果表明腐胺实测值(lg)与腐胺预测值(lg)线性拟合良好,R²为0.995 9,皮尔逊相关系数为0.998 0。为了更加真实、客观地评价模型的好坏,本试验评价了未经过lg转化的生乳腐胺真实值与预测值之间的差异。对生乳腐胺的预测值进行反lg求值,并进行了相关线性拟合和显著性分析,结果见图5和图6。由图5可知,生乳腐胺相关性线性拟合良好,R²为0.980 8,皮尔逊相关系数为0.990 4,属于强相关,但是相较于lg转化后的拟合结果较差,这可能是由于腐胺数值被放大,相应的差异也被放大。由图6可知,由建立的中红外光谱预测模型得到的生物胺预测值与真实值之间没有显著差异(P>0.05)。综上所述,本试验建立的生乳中腐胺的中红外预测模型展现出了优异的预测能力,可满足对相关生乳样品中腐胺的快速检测需求。

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图4 生乳中腐胺实测值(lg)与预测值(lg)的线性关系

Fig.4 Linear relationship between measured value (lg) and predicted value (lg) of PUT in raw milk

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图5 生乳中腐胺实测值与预测值的线性关系

Fig.5 Linear relationship between measured value and predicted values of PUT in raw milk

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图6 生乳中腐胺实测值和预测值的显著性分析

误差线是平均值的标准误差;NS表示无显著差异(P>0.05)。

Fig.6 Significance analysis of measured value and predicted value of PUT in raw milk

The error line is the standard error of the mean; NS indicates no significant difference (P>0.05).

3 讨论

生乳中的内源游离氨基酸及蛋白质分解产生的游离氨基酸在微生物及内源酶的作用下降解为腐胺和其他生物胺^[31],生物胺是生乳贮存过程中的产物,与生乳新鲜度息息相关,尤其是腐胺含量变化可以直接表征生乳新鲜度^[1,5]。目前测定生乳中腐胺的方法主要为液相色谱法,Liang等^[32]、Moniente等^[33]通过衍生化+液相色谱的方法测定了生乳中的腐胺,虽然该方法具有良好的稳定性,但是灵敏度尚有待提高,难以检测出生乳中的生物胺含量;赵瑞^[5]采用液相色谱-质谱法测定了生乳中的腐胺,最低检出限在6 ng/mL,虽然该方法具有良好的灵敏度和准确性,但是具有操作复杂、仪器昂贵难以普遍推广的弊端。

中红外光谱是一种经济高效的检测工具,具有简单快捷、无污染、无破坏、无前处理等优势,并且还具有较高的灵敏度。Meza-Márquez等^[34]基于中红外光谱建立了大鼠肉中克伦特罗的预测模型,该预测模型的检测范围在5~10 000 μg/kg;Meza-Márquez等^[35]同样基于中红外光谱建立了牛肉中瘦肉精的检测方法,该检测方法检出限为2 μg/kg。前人的研究结果证明了中红外光谱具有高灵敏度,为本试验基于中红外光谱建立生乳中腐胺的检测方法提供了理论依据。本试验通过SNV、SG平滑、一阶导数、二阶导数等方法对原始光谱进行降噪处理,然后通过PLSR建立腐胺的预测模型,测试集R²为0.995 9,RMSE为0.054 2,具有良好的准确性。李锐等^[36]通过SNV和导数方法预处理近红外光谱,基于近红外光谱建立了小龙虾中生物胺总量的预测模型;云颖等^[37]同样通过SG平滑、SNV和导数的方法对原始光谱进行预处理,基于近红外光谱建立了羊肉中腐胺、苯乙胺、组胺和精胺的预测模型。本试验的光谱预处理方法和模型建立方法与上述研究基本相同。腐胺是一种与微生物关系极为密切的物质,其含量随生乳贮藏时间的延长呈近似于指数增长,数据呈偏态分布,因此在预测模型建立时参考了孙文珂等^[21]对菌落总数的光谱预测模型的建立方法,先将腐胺数据转为正态分布然后再进行预测模型的建立,因此建立的预测模型效果良好。

建立中红外光谱模型需要充分而全面的样品数据支撑。本次试验仅依赖128个生乳样品建立了腐胺预测模型,尽管在验证阶段实测值与预测值之间没有显著差异,表现出一定的准确性,但由于样品数据的有限性,模型的稳定性可能存在波动性变化。因此,为了进一步优化模型的可靠性和适用性,在后续研究中需要更广泛的样本数据支持。

4 结论

本试验通过SG平滑+二阶导数的预处理方法对生乳样品的中红外光谱剔除背景噪音,并结合PLSR成功建立了生乳中腐胺的中红外光谱预测模型。该模型测试集R²为0.995 9,RMSE为0.054 2,验证集R²为0.811 2,RMSE为0.368 4,具有良好的准确性和稳定性,在模型验证中腐胺实测值与预测值线性拟合良好,R²为0.980 8,皮尔逊相关系数为0.990 4,且实测值与预测值之间没有显著差异,表明该预测模型能够满足生乳中腐胺的检测要求。本试验建立的中红外光谱预测模型实现了生乳中腐胺的快速、低成本检测,对生乳新鲜度评价具有借鉴意义,且具有实际应用价值。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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