动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 5581 - 5593

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.476

研究论文

不同饲料添加剂对断奶仔猪生长性能、免疫性能、肠道健康及粪便微生物的影响

  • 淡江华 , 1 ,
  • 李国柱 2, * ,
  • 冯燕平 3 ,
  • 穆秀梅 1 ,
  • 王树华 , 1, ** ,
  • 焦福林 1 ,
  • 王芳 1
展开
  • 1 山西农业大学动物科学学院,太原 030000
  • 2 文水县富民诚信农牧有限公司,文水 030032
  • 3 山西省农业广播电视学校,太原 030000
** 王树华,研究员,E-mail:

* 同等贡献作者

淡江华(1980—),女,山西运城人,助理研究员,学士,从事畜禽健康养殖与环境控制方面的研究。E-mail:

Office editor: 陈鑫

收稿日期: 2024-04-10

  网络出版日期: 2024-09-08

基金资助

国家自然科学基金项目(32272846)

山西省重点研发项目(201903D221024)

收起

Effects of Different Feed Additives on Growth Performance, Immune Performance, Intestinal Health and Fecal Microorganisms of Weaned Piglets

  • DAN Jianghua , 1 ,
  • LI Guozhu 2, * ,
  • FENG Yanping 3 ,
  • MU Xiumei 1 ,
  • WANG Shuhua , 1, ** ,
  • JIAO Fulin 1 ,
  • WANG Fang 1
Expand
  • 1 College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030000, China
  • 2 Fumin Chengxin Agriculture and Animal Husbandry Co., Ltd., Wenshui 030032, China
  • 3 Shanxi Agricultural Broadcasting School, Taiyuan 030000, China
** professor, E-mail:

* Contributed equally

Received date: 2024-04-10

  Online published: 2024-09-08

Fold

摘要

本试验旨在研究不同饲料添加剂(复合微生态制剂、抗菌肽、酸化剂)对断奶仔猪生长性能、免疫性能、肠道健康及粪便微生物的影响。选取35日龄健康的同批次“杜×长×大”仔猪240头[(9.52±1.30) kg],随机分为4组,每组3个重复,每个重复20头。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加复合微生态制剂(1 000 g/t,微生态组)、抗菌肽(1 000 g/t,抗菌肽组)、二甲酸钾(1%,酸化剂组),试验期30 d。结果表明:1)与对照组比,微生态组、抗菌肽组末重、平均日增重(ADG)及平均日采食量(ADFI)显著提高(P<0.05),料重比(F/G)显著降低(P<0.05);对照组腹泻率显著高于各试验组(P<0.05),抗菌肽组显著低于其他各组(P<0.05)。2)与对照组比,微生态组、抗菌肽组血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、CD4+T淋巴细胞(CD4)、CD8+T淋巴细胞(CD8)含量显著提高(P<0.05);抗菌肽组血清IgG、IgM含量显著高于其他各组(P<0.05),各组间CD4/CD8比值差异不显著(P>0.05);微生态组、抗菌肽组免疫器官指数显著优于对照组(P<0.05)。3)与对照组比,微生态组、抗菌肽组回肠、空肠绒毛长度及回肠绒隐比(V/C)显著提高(P<0.05),各组间回肠、空肠隐窝深度及空肠V/C差异不显著(P>0.05)。4)与对照组比,微生态组、抗菌肽组及酸化剂组粪便微生物的丰富度、均匀度和多样性显著提高(P<0.05);微生态组、抗菌肽组肠道优势菌门厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著提高(P<0.05),且能显著提高与生长、免疫等相关的菌属梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)的相对丰度(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加复合微生态制剂和抗菌肽可显著提高断奶仔猪ADG和ADFI,降低F/G和腹泻率,显著提高免疫性能;添加复合微生态制剂和抗菌肽可以调节肠道微生物,改善肠道健康。本研究条件下,最佳饲料添加剂为抗菌肽,复合微生态制剂次之。

关键词： 复合微生态制剂; 抗菌肽; 断奶仔猪; 生长性能; 免疫性能; 肠道健康; 粪便微生物

本文引用格式

淡江华 , 李国柱 , 冯燕平 , 穆秀梅 , 王树华 , 焦福林 , 王芳 . 不同饲料添加剂对断奶仔猪生长性能、免疫性能、肠道健康及粪便微生物的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(9) : 5581 -5593 . DOI: 10.12418/CJAN2024.476

Abstract

This experiment aimed to investigate the effects of different feed additives (complex microecological preparations, antimicrobial peptides and acidifiers) on growth performance, immune performance, intestinal health, and fecal microorganisms of weaned piglets. A total of 240 weaned piglets [(9.52±1.30) kg] with the same batch of “Duroc×Landrace×Large White” of the age of 35 days were selected and randomly divided 4 groups,with 3 replicates in each group and 20 piglets per replicate. The control group was fed a basal diet, the experimental groups were fed the basal diet supplemented separately with complex microecological preparations (1 000 g/t, microecological group), antimicrobial peptides (1 000 g/t, antimicrobial peptide group) and potassium diformate (1%, acidifiers group) and the experimental period was 30 days. The results showed as follows:1) compared with the control group, the final weight, average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) in microecological group and antimicrobial peptide group were significantly increased (P<0.05), and the ratio of feed to gain was significantly decreased (P<0.05). The diarrhea rate in control group was significantly higher than that in experimental groups (P<0.05), and that in antimicrobial peptide group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). 2) Compared with the control group, the contents of serum immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin M (IgM), CD4+T lymphocytes (CD4) and CD8+T lymphocytes (CD8) in microecological group and antimicrobial peptide group were significantly increased (P<0.05); the contents of serum IgG and IgM in antimicrobial peptide group were significantly higher than those in other groups (P<0.05), but the ratio of CD4/CD8 was not significantly different among all groups (P>0.05). The immune organ index in microecological group and antimicrobial peptide group was significantly better than that in control group (P<0.05). 3)Compared with the control group, the villus length and ileum villus length/crypt depth ratio (V/C) of ileum and jejunum in microecological group and antimicrobial peptide group were significantly increased (P<0.05), but the crypt depth of ileum and jejunum and jejunum V/C were not significantly different among all groups (P>0.05).4)Compared with the control group, the richness, evenness and diversity of fecal microorganisms in microecological group, antimicrobial peptide group and acidifier group were significantly increased (P<0.05). The relative abundance of Firmicutes and Bacteroidetes in microecological group and antimicrobial peptide group was significantly increased (P<0.05). The relative abundances of Clostridium, Lactobacillus, Prevotella and Ruminococcus, which are related to growth and immunity, were significantly increased (P<0.05). In conclusion, dietary adding complex microecological preparations and antimicrobial peptides can significantly improve the ADG and ADFI of weaned piglets, reduce F/G and diarrhea rates, and significantly improve immune performance; adding complex microecological preparations and antimicrobial peptides can regulate gut microbiota and improve intestinal health. The optimal feed additive for weaned piglets in this study is antimicrobial peptides, followed by complex microecological preparations.

Key words： complex microecological preparations; antimicrobial peptides; weaned piglets; growth performance; immune performance; intestinal health; fecal microorganisms

断奶是仔猪生产的关键环节。仔猪断奶后受营养、环境和生理等多种应激源影响,易发生肠道免疫系统功能性紊乱。断奶应激会破坏肠道菌群平衡,导致肠道屏障功能障碍,从而使仔猪生长迟缓、免疫力低下等,极易造成腹泻甚至死亡[1⇓-3]。生产中常添加抗生素来降低仔猪断奶应激引发的腹泻,提高生长性能,但抗生素长期滥用影响仔猪肠道菌群稳定,造成耐药菌增加、免疫细胞功能被抑制等问题,已引起社会高度关注[4],尤其是“禁抗令”实施以来。因此,寻求新型绿色、无残留的饲料添加剂成为行业关注热点。微生态制剂可通过调节宿主肠道内的微生物平衡来提高机体免疫力,促进饲粮消化吸收。谢大识等[5]在断奶仔猪基础饲粮中添加400 mg/kg复合微生态制剂能显著提高断奶仔猪的生长性能,降低腹泻率,提高断奶仔猪的免疫功能。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的多肽类物质,用来对抗外源性病原体,具有抗菌活性高、促生长、不易产生耐药性等特点[6]。卢俊鑫等[7]研究发现,饲粮中添加抗菌肽能显著提高仔猪平均日增重(ADG),降低腹泻率。酸化剂主要通过降低饲粮酸度及改善肠道内环境,激活胃蛋白酶活性,提高营养物质的消化吸收,改善断奶引起的腹泻和生长迟缓等问题[8]。朱爱民等[9]研究发现,在饲粮中添加0.4%柠檬酸对采食量和饲料转化率有显著的提高作用。目前有关断奶仔猪饲料添加剂主要集中单一产品在生长性能、营养物质表观消化率和血清指标方面的研究,系统地开展微生态制剂、抗菌肽和酸化剂对断奶仔猪生长、腹泻、免疫及粪便微生物影响的对比研究报道较少。因此,本试验旨在研究复合微生态制剂、抗菌肽、酸化剂对断奶仔猪生长性能、免疫性能、肠道健康及粪便微生物的影响,寻求最适绿色、抗菌效果好且无耐药性的断奶仔猪饲料添加剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用复合微生态制剂主要为凝结芽孢杆菌(≥2.0×109 CFU/g)、酪酸菌(≥5.0×108 CFU/g)、枯草芽孢杆菌(3.0×109 CFU/g)、地衣芽孢杆菌(≥1.2×1010 CFU/g)。抗菌肽来源于家蚕,理论分子质量为4 474.38 u,包含41个氨基酸残基,纯度>90%。酸化剂为二甲酸钾,纯度>98%。

1.2 试验设计

试验采用单因素试验设计,选取35日龄、体重为(9.52±2.30) kg的同批次“杜×长×大”健康仔猪240头,随机分为4个组,每组3个重复,每个重复20头。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加复合微生态制剂(1 000 g/t,微生态组)、抗菌肽(1 000 g/t, 抗菌肽组)和二甲酸钾(1%,酸化剂组),试验期30 d。基础饲粮参考NRC(2012)标准配制,其组成及营养水平见表1。动物试验经山西农业大学实验动物伦理委员会批准(批准号SXAU-EAW-2022P.SE.010009175)。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 62.60
豆粕Soybean meal 9.60
大豆油Soybean oil 1.40
膨化大豆Extruded soybean 8.00
发酵豆粕Fermented soybean meal 9.00
超蒸鱼粉Super steamed fish meal 2.50
氯化钠NaCl 0.30
白糖White sugar 2.50
石粉Limestone 0.30
磷酸氢钙CaHPO4 1.20
L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCl (98%) 0.60
预混料Premix1) 2.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
消化能DE/(MJ/kg) 14.47
干物质DM 88.32
粗蛋白质CP 18.56
粗脂肪EE 5.36
总磷TP 0.58
钙Ca 0.55
赖氨酸Lys 1.40
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.59
苏氨酸Thr 0.75
色氨酸Trp 0.17
标准回肠可消化赖氨酸SID Lys 1.17
标准回肠可消化蛋氨酸+标准回肠
可消化胱氨酸
SID Met+SID Cys		 0.52
标准回肠可消化苏氨酸SID Thr 0.57
标准回肠可消化色氨酸SID Trp 0.14
标准全肠道可消化磷STTD P 0.48

1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kg of the diet:VA 7 500 IU,VB3 2 000 IU,VE 80 mg,VK3 3.0 mg,VB1 1.2 mg,VB2 5.2 mg,D-泛酸钙 D-calcium pantothenate 10 mg,VB6 1.4 mg,VB12 0.08 mg,烟酰胺 nicotinamide 10 mg,叶酸 folic acid 0.32 mg,生物素 biotin 0.1 mg,胆碱 choline 600 mg,Fe 100 mg,Mn 20 mg,Cu 25 mg,Zn 80 mg,Se 0.16 mg。

2)消化能、标准回肠可消化氨基酸及标准全肠道可消化磷为计算值,其他营养水平均为实测值。DE,SIDAA and STTD P were calculated values,while the other nutrient levels were measured values.

1.3 饲养管理

所有试验猪饲养在同一栋圈舍,每组3栏,共12栏。圈舍温度控制在24~28 ℃,相对湿度控制在50%~70%,每天清粪1次,定期对猪舍进行打扫及消毒,保持清洁和通风。试验期间所有猪群自由采食和饮水,喂料后观察仔猪的采食、饮水及精神状况,记录每个重复的采食量及腹泻情况。仔猪免疫、驱虫等按试验猪场正常程序进行。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 饲粮中营养成分含量

饲粮中干物质(GB/T 6435—2014)、粗蛋白质(GB/T 6432—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、总磷(GB/T 6437—2018)、钙(GB/T 6436—2018)、氨基酸(GB/T 18246—2019)含量均按照国标进行测定;饲粮中消化能水平参照《猪营养需要量》(GB/T 39235—2020)中各原料成分的消化能水平计算得出;标准回肠可消化氨基酸及标准全肠道可消化磷依据NRC(2012)计算得出。

1.4.2 生长性能

在正式试验起始日及试验结束日以栏为单位空腹(禁食12 h)称重,计算ADG。试验期每天记录每个重复仔猪的采食量及腹泻情况,计算平均日采食量(ADFI)和腹泻率。根据断奶仔猪的ADFI和ADG计算料重比(F/G)。
计算公式如下:
ADG=(末重-初重)/试验天数;
ADFI=总采食量/(试验天数×头数);
F/G=ADFI/ADG;
腹泻率(%)=[试验期内腹泻试验猪头次/(试验天数×试验猪头数)]×100。

1.4.3 免疫性能

1.4.3.1 血清免疫指标

试验结束后,所有试验猪逐个称重记录后,每组选择9头仔猪前腔静脉采血,采血后将血液静止1 h后,1 006.2×g离心10 min,吸取上清液,-20 ℃保存待检。血清免疫指标委托山西赛琨思生物科技有限公司进行检测。
检测指标:免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、CD4+T淋巴细胞(CD4)、CD8+T淋巴细胞(CD8),均采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒,应用双抗体夹心法测定样品中免疫指标。

1.4.3.2 免疫器官指数

试验结束后,对试验猪全体逐个称重记录后,每组选择9头试验动物(同1.4.3.1)进行屠宰,共36头。屠宰时采用前腔放血,打开腹腔,取免疫器官脾脏、扁桃体、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结并去除包围物后,分别测量免疫器官重量,用于计算免疫器官指数。
免疫器官指数(g/kg)=免疫器官重/宰前活重。

1.4.4 回肠、空肠绒毛长度及隐窝深度

试验猪屠宰后,各取3 cm回肠、空肠段迅速用棉绳扎紧两端放进4%多聚甲醛固定。按照病理试验检查SOP程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片,最后镜检合格的样片。使用PANNORAMIC全景切片扫描仪成像,CaseViewer2.4扫描软件对目的区域进行100倍成像,成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件,统一以mm作为标准单位,分别测量每张切片中5根完整肠绒毛长度及对应的5处隐窝深度,并计算绒隐比(V/C)。

1.4.5 粪便微生物变化

于正式试验结束当天采集新鲜粪便测定粪便中微生物变化,每组采集9个样品(每个重复3个)并编码,每个样品采集100 g于50 mL无菌离心管中,样品送至山西赛琨思生物科技有限公司进行DNA提取,使用Vsearch进行操作分类单元(OTU)聚类,以16S rRNA V3~V4区为目标扩增片段,扩增长度为405 bp,扩增引物为F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA R:3'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT。将纯化后的PCR扩增片段构建数据库,通过Illumina MiSeq平台进行测序和数据分析。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较,P<0.05表示差异显著。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同饲料添加剂对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响

由表2可知,试验开始时,各组始重差异不显著(P>0.05),试验结束后,微生态组和抗菌肽组显著高于对照组(P<0.05);各试验组ADG及ADFI显著高于对照组(P<0.05);F/G方面,对照组显著高于各试验组(P<0.05),微生态组与抗菌肽组差异不显著(P>0.05);对照组腹泻率显著高于各试验组,而抗菌肽组显著低于其他各组(P<0.05)。
表2 不同饲料添加剂对断奶仔猪生长性能及腹泻率的影响

Table 2 Effects of different feed additives on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets (n=60)

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照
Control		 微生态
Microecological		 抗菌肽
Antibacterial peptide		 酸化剂
Acidifier
始重Initial weight/kg 9.79±1.94 9.13±1.53 9.50±1.22 9.29±1.91 0.655
末重Final weight/kg 21.21±2.52b 23.50±1.87a 24.29±3.37a 22.87±2.72ab 0.016
平均日增重ADG/g 381.00±0.13d 479.00±0.08b 493.00±0.07a 453.00±0.05c <0.001
平均日采食量ADFI/g 626.00±25.19d 704.00±14.72b 728.00±34.15a 686.00±23.20c <0.001
料重比F/G 1.64±0.15a 1.47±0.11c 1.48±0.15c 1.51±0.20b <0.001
腹泻率Diarrhea rate/% 2.41±0.03a 1.48±0.05c 1.02±0.06d 1.57±0.08b <0.001

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant differences (P>0.05). The same as below.

2.2 不同饲料添加剂对断奶仔猪免疫性能的影响

2.2.1 不同饲料添加剂对断奶仔猪血清免疫指标的影响

由表3可知,微生态组、抗菌肽组血清IgA、IgG、IgM、CD4、CD8含量均显著高于对照组(P<0.05);酸化剂组血清IgA、IgG、CD8、IgM含量显著高于对照组(P<0.05),CD4含量与对照组差异不显著(P>0.05);抗菌肽组血清IgG、IgM含量及微生态组血清CD4含量显著高于其他各组(P<0.05);CD4/CD8各组差异不显著(P>0.05)。
表3 不同饲料添加剂对断奶仔猪血清免疫指标的影响

Table 3 Effects of different feed additives on serum immune indicators of weaned piglets (n=9)

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照
Control		 微生态
Microecological		 抗菌肽
Antibacterial
peptide		 酸化剂
Acidifier
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL) 252.94±15.40c 435.80±24.07a 443.94±18.86a 354.15±17.45b <0.001
免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) 9.94±0.48d 17.83±1.45b 19.44±0.29a 16.33±0.47c <0.001
免疫球蛋白M IgM/(mg/mL) 10.31±0.36c 12.97±1.12b 14.99±0.71a 11.16±0.44b <0.001
CD4+T淋巴细胞CD4/(ng/mL) 42.92±1.77c 54.82±1.97a 48.11±0.83b 43.96±1.76c <0.001
CD8+T淋巴细胞CD8/(ng/mL) 13.38±0.42c 18.69±2.67b 20.84±0.78a 18.69±2.67b 0.001
CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞
CD4/CD8		 2.79±0.56 3.24±0.37 2.86±0.65 2.98±0.44 0.158

2.2.2 不同饲料添加剂对断奶仔猪免疫器官指数的影响

由表4可知,各组间扁桃体指数、腹股沟淋巴结指数差异不显著(P>0.05);对照组脾脏指数和下颌淋巴结指数显著高于其他各组(P<0.05),微生态组、抗菌肽组脾脏指数和下颌淋巴结指数差异不显著(P>0.05)。
表4 不同饲料添加剂对断奶仔免疫器官指数的影响

Table 4 Effects of different feed additives on immune organ indexes of weaned piglets (n=9)g/kg

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照
Control		 微生态
Microecological		 抗菌肽
Antibacterial
peptide		 酸化剂
Acidifier
脾脏指数Spleen index 3.48±0.05a 2.50±0.22bc 2.83±0.03b 2.26±0.19c <0.001
扁桃体指数Tonsil index 0.50±0.08 0.44±0.08 0.40±0.06 0.55±0.06 0.152
下颌淋巴结指数
Mandibular lymph node index		 0.75±0.10a 0.46±0.04b 0.56±0.11b 0.56±0.03b 0.002
腹股沟淋巴结指数
Inguinal lymph node index		 0.33±0.03 0.20±0.06 0.36±0.02 0.21±0.11 0.098

2.3 不同饲料添加剂对断奶仔猪回肠、空肠绒毛长度及隐窝深度的影响

由表5可知,各组回肠、空肠隐窝深度及空肠V/C差异不显著(P>0.05);与对照组相比,微生态组和抗菌肽组肠道绒毛长度显著升高(P<0.05),回肠V/C也显著高于对照组(P<0.05),微生态组、抗菌肽组和酸化剂组空肠绒毛长度显著高于对照组(P<0.05),微生态组与抗菌肽组差异不显著(P>0.05)。
表5 不同饲料添加剂对断奶仔猪肠道健康的影响

Table 5 Effects of different feed additives on intestinal health of weaned piglets (n=9)

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照
Control		 微生态
Microecological		 抗菌肽
Antibacterial
peptide		 酸化剂
Acidifier
回肠Ileum
绒毛长度Villus length/mm 0.27±0.08d 0.32±0.08bc 0.39±0.06a 0.28±0.04cd <0.001
隐窝深度Crypt depth/mm 0.22±0.08 0.17±0.05 0.16±0.05 0.19±0.07 0.060
绒隐比V/C 1.53±0.20c 2.09±0.16ab 2.61±0.67a 1.73±0.91bc 0.009
空肠Jejunum
绒毛长度Villus length/mm 0.28±0.05c 0.38±0.06ab 0.42±0.07a 0.36±0.08b <0.001
隐窝深度Crypt depth/mm 0.21±0.05 0.19±0.06 0.17±0.07 0.20±0.07 0.383
绒隐比V/C 1.37±0.42 2.22±0.56 2.49±0.42 2.36±0.70 0.054

2.4 不同饲料添加剂对断奶仔猪粪便微生物的影响

2.4.1 稀疏曲线及OTU微生物聚类分析结果

对粪便微生物16S rRNA进行双端(paired-end)测序,得到5 260 533个高质量序列,序列长度集中在404~431。由图1-A可知,当样品数量达到5 000以后,稀疏曲线平缓且微生物覆盖度达到96.82%,说明测序数据量足够大,样品满足微生物区系分析要求。由图1-B可知,4组共得到了1 541个OTU,对照组、微生态组、抗菌肽组和酸化剂组特有OTU分别为311、352、306和257个,4个分组共有315个OTU。
图1 稀疏曲线(A)及OTU水平韦恩图(B)

Fig.1 Rarefaction curve(A)and Venn diagram at OTU level(B)

2.4.2 粪便微生物在门水平上的组成

由图2可知,对照组、微生态组、抗菌肽组和酸化剂组样本在门水平上超过97%的优势菌门依次为厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门,各组间粪便微生物在门水平上的组成无差异。
图2 粪便微生物在门水平上的组成

Firmicutes:厚壁菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Tenericutes:软壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Spirochaetes:螺旋体门;Actinobacteria:放线菌门;Cyanobacteria:蓝菌门;Chlamydiae:衣原体门;Verrucomicrobia:疣微菌门;Others:其他。

Fig.2 Composition of fecal microbiota at phylum level

2.4.3 粪便微生物在属水平上的组成

由图3可知,在属水平上,对照组相对丰度前10且超过1%的微生物组成分别为梭菌科_梭菌属(4.7%)、SMB53(4.2%)、颤螺菌属(3.3%)、乳杆菌属(2.4%)、普雷沃氏菌属(1.5%)、瘤胃球菌科_瘤胃球菌属(1.5%)、密螺旋体属(1.3%);微生态组相对丰度前10且超过1%的微生物组成分别为瘤胃菌科_瘤胃菌属(5.8%)、乳杆菌属(5.4%)、链球菌属(5.2%)、SMB53(3.9%)、芽殖菌属(2.6%)、颤螺菌属(2.5%)、普雷沃氏菌属(1.3%)和罗氏菌属(1.3%);抗菌肽组相对丰度前10且超过1%的微生物组成分别为梭菌科_梭菌属(5.3%)、乳杆菌属(5.2%)、颤螺菌属(3.2%)、SMB53(2.2%)、普雷沃氏菌属(2.2%)、罗氏菌属(1.9%)和瘤胃球菌科_瘤胃球菌属(1.4%)、芽殖菌属(1.1%);酸化剂组相对丰度前10且超过1%的微生物组成分别为SMB53(5.6%)、梭菌科_梭菌属(5.1%)、颤螺菌属(1.5%)、链球菌属(1.4%)和普雷沃氏菌属(1.3%)。
图3 粪便微生物在属水平上的组成

Clostridiaceae:梭菌科;Clostridium:梭菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Oscillospira:颤螺菌属;Streptococcus:链球菌属;Prevotella:普雷沃氏菌属;Gemmiger:芽殖菌属;Ruminococcaceae:瘤胃菌科;Ruminococcus:瘤胃球菌属;Roseburia:罗氏菌属;Treponema:密螺旋体属;Coprococcus:粪球菌属; others:其他。

Fig.3 Composition of fecal microbiota at genus level

2.4.4 粪便微生物α多样性分析

为了全面评估微生物群落的α多样性,本研究使用Chao1、Pielou’s_e、Simpson和Shannon指数分别表征丰富度、均匀度和多样性。由表6可知,微生态组、抗菌肽组微生物丰富度(Chao1指数)显著高于对照组(P<0.05),微生态组和抗菌肽组差异不显著(P>0.05),微生物丰富度以抗菌肽组最高,对照组最低;微生态组、抗菌肽组和酸化剂组间微生物均匀度(Pielou’s_e指数)及多样性(Shannon、Simpson指数)均无显著差异(P>0.05),且均显著高于对照组(P<0.05)。
表6 不同饲料添加剂对断奶仔猪粪便微生物α多样性的影响

Table 6 Effects of different feed additives on α diversity of fecal microorganism of weaned piglets(n=9)

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
对照
control		 微生态
Microecological		 抗菌肽
Antibacterial
peptide		 酸化剂
Acidifier
Chao1指数Chao1 index 3 672.94±504.59c 4 780.13±571.92ab 5 214.45±725.60a 4 183.94±344.54bc 0.002
Pielou’s_e指数
Pielou’s_e index		 0.70±0.03b 0.77±0.01a 0.79±0.05a 0.77±0.02a 0.002
Shannon指数Shannon index 8.12±0.36b 9.14±0.22a 9.49±0.68a 9.10±0.24a 0.001
Simpson指数Simpson index 0.94±0.02b 0.98±0.00a 0.98±0.02a 0.98±0.01a 0.002

2.4.5 粪便微生物β多样性分析

如图4所示,基于weighted_unifrac距离算法,椭圆置信为0.95的基础上,主成分1贡献率为30.9%、主成分2贡献率为15.1%时,与对照组相比,酸化剂组在X轴投影距离较远,说明组间菌群多样性差异较大,而微生态组、抗菌肽组在X轴投影与对照组接近,表明组间在主贡献率为30.9%的维度上群落组成相似。
图4 β多样性分析

Fig.4 β diversity analysis

2.4.6 微生物差异性分析(LEfSe)

从图5可以看出,基于LEfSe、LDA值>2基础上进行各分组间物种差异性分析,共找出20种标志性差异微生物。其中,对照组标记物为瘤胃球菌科、RFN20、多核苷酸柑菌属、假丁酸狐菌属:微生态组标记物为代尔夫特菌属、志贺氏菌属、片球菌属;抗菌肽组标记物为梭菌科、消化链球菌科、苏黎世杆菌科、马赛菌属;酸化剂组标记物为帕拉普氏菌属、欧陆森氏菌属、小杆菌属、甲基娇养杆菌属、氨基酸球菌属、伯克氏菌属。
图5 标志物的LDA效应值柱状图

Ruminococcaceae:瘤胃球菌科;Polynucleobacter:多核杆菌属;Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌属;Clostridiaceae:梭菌科;Peptostreptococcaceae:消化链球菌科;Turicibacterales:苏黎世杆菌目; Turicibacter:苏黎世杆菌属;Turicibacteraceae:苏黎世杆菌科;Massilia:马赛菌属;Paraprevotella:帕拉普氏菌属;Olsenella:欧陆森氏菌属;Dialister:小杆菌属;Methylotenera:甲基娇养杆菌属;Acidaminococcus:氨基酸球菌属;Burkholderia:伯克氏菌属;Burkholderiaceae:伯克氏菌科;Delfita:代尔夫特菌属;Shigella:志贺氏菌属;Pediococcus:片球菌属。

Fig.5 Bar chart of LDA effect values for marker species

3 讨论

3.1 不同饲料添加剂对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

生长性能和腹泻率是反映断奶仔猪生长和健康的重要指标。谢全喜等[10]在饲粮中添加1.0‰复合微生态制剂肽菌素改善断奶仔猪生长性能,降低腹泻率。李陇梅等[11]报道,在饲粮中按1.5%的比例添加抗菌肽,能显著提高断奶仔猪的采食量和ADG,降低F/G。Hanczakowska等[12]研究发现,饲粮中添加中链脂肪酸增加了仔猪ADG和饲料效率,提高了粗纤维的消化率。本研究中,在仔猪饲粮中添加微生态制剂、抗菌肽和酸化剂显著提升了断奶仔猪ADG、ADFI,降低F/G和腹泻率,与前人研究结果基本一致。在腹泻率方面,饲粮中添加微生态制剂、抗菌肽和酸化剂均能显著降低仔猪的腹泻率,抗菌肽表现最优,这可能与抗菌肽本身具有抗菌、调节免疫、增强肠道屏障功能,能间接降低肠道通透性等能力有关[13],微生态制剂参与动物肠道菌群稳态的调节,与有害菌争夺营养和肠道上的定植位点,维持肠道健康,抑制腹泻效果仅次于抗菌肽。

3.2 不同饲料添加剂对断奶仔猪血清免疫指标和免疫器官指数的影响

IgA、IgG、IgM反映机体免疫水平,CD4、CD8反映免疫调节能力,一定范围内,免疫球蛋白含量升高,说明机体体液免疫能力增强,CD4/CD8增加说明细胞免疫功能增强[14-15]。Wang等[16]研究表明,仔猪饲粮中添加复合微生态制剂能提高血清中IgA、IgG和IgM含量,可增强仔猪免疫力。Ren等[17]报道,在断奶仔猪饲粮中补充抗菌肽可以提高仔猪血清IgA、IgG和IgM含量。程远之等[18]在饲粮中添加0.2%乳酸型酸化剂显著提高了血清IgG和IgA的含量。本试验中,饲粮中添加微生态制剂和抗菌肽显著提高断奶仔猪血清中IgA、IgG、IgM、CD4、CD8含量,酸化剂能显著提升血清中IgA、IgG和CD8含量,说明饲料添加剂在一定程度上均可以增强机体免疫能力,其中饲粮中添加抗菌肽仔猪血清中IgG、IgM含量显著高于其他各组,这可能与抗菌肽靶向病原体特定分子受体,充当免疫调节剂来增强免疫力有关。
免疫器官指数用来反映动物机体在特定条件下的免疫状况,免疫指数提高说明机体免疫性能增加[19]。本试验结果显示,饲粮中添加微生态制剂、抗菌肽和酸化剂对断奶仔猪扁桃体指数、腹股沟淋巴结指数无显著影响,对照组脾脏指数与下颌淋巴结指数显著高于其他各组,结合对照组猪群生长性能及体液免疫指标,猪群可能属于病理性脾大和下颌淋巴结肿大。饲粮中添加微生态制剂及抗菌肽猪群脾脏指数和下颌淋巴结指数无显著差异,表明微生态制剂和抗菌肽一定程度上均可以促进仔猪免疫器官的发育,增强免疫机能。

3.3 不同饲料添加剂对断奶仔猪肠道健康的影响

肠道是营养物质消化吸收的主要场所,绒毛长度、隐窝深度和V/C是评价小肠生产和营养吸收的重要指标。绒毛长度提升、隐窝变浅均有利于小肠对养分的消化吸收,V/C上升表明消化吸收功能增强,消化率升高,机体的生产性能好。刘虎传等[20]研究发现,在饲粮中添加益生菌能提高断奶仔猪肠道绒毛高度,降低隐窝深度,改善肠道健康。梁秀丽等[21]研究发现,断奶仔猪采食抗菌肽后,肠道内隐窝深度降低,绒毛高度升高,肠道绒毛的密度和完整度提升。本研究在饲粮中添加微生态制剂、抗菌肽和酸化剂均能显著提高断奶仔猪回肠和空肠绒毛长度,但对隐窝深度无显著影响。饲粮中添加微生态制剂和酸化剂在V/C方面与对照组无统计学意义上差异,而添加抗菌肽显著提升了回肠和空肠的V/C,这表明抗菌肽能更好地刺激肠道上皮细胞增殖,促进空肠和回肠的绒毛生长,一定程度上能刺激提升仔猪小肠营养吸收能力。

3.4 不同饲料添加剂对断奶仔猪粪便微生物多样性的影响

肠道中的微生物可以通过调控营养代谢、免疫功能和肠道屏障来对宿主产生影响,新鲜粪便中的微生物一定程度上反映肠道微生物组成。厚壁菌门是肠道微生物中最丰富的原核生物群之一,主要由革兰氏阳性细菌构成,在肠道中参与糖类、脂质和氨基酸代谢,促进食物中能量吸收,也能很好分解纤维素,是一些复杂大分子物质的主要降解菌[22]。拟杆菌门是肠道中另一大类,是革兰氏阴性无芽孢厌氧菌,拥有很高的降解多糖能力,是非纤维碳水化合物的降解菌,此外,还是维持肠道微生态平衡、影响免疫系统发育和调节的重要菌属。Alain B Pajarillo等[23]研究结果,发现断奶前健康仔猪粪便的优势菌门为厚壁菌门(54.0%)、拟杆菌门(38.7%)、变形菌门(4.2%),其中厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度和在90%以上。本试验结果显示4组断奶仔猪粪便门水平微生物组成保持一致,优势的菌门厚壁菌门和拟杆菌门总含量均达到95%以上,微生态组和抗菌肽组显著高于对照组,说明饲粮中添加微生态制剂、抗菌肽和酸化剂均维持了断奶仔猪粪便微生物区系的稳定,其中添加微生态制剂和抗菌肽在仔猪生长性功能和免疫能力更具优势。
属水平上,梭菌属是厚壁菌门的一属细菌,是一群革兰氏阳性菌,代谢产物能保护肠道绒毛,促进能量吸收,减少腹泻发生;乳杆菌属是肠道有益菌属,组内的成员在猪肠道中能水解淀粉和其他糖以产生丁酸盐和其他短链脂肪酸,为宿主提供能量[23]。本试验结果显示,饲粮中添加微生态制剂和抗菌肽显著提升了梭菌属和乳杆菌属相对丰度,说明饲粮中添加微生态制剂和抗菌肽更有利于肠道短链脂肪酸的产生,这也是微生态组和抗菌肽组断奶仔猪的ADG、ADFI、血清中IgA、IgG、IgM含量显著提升,腹泻率显著降低的原因之一。普雷沃氏菌属属于拟杆菌门,作为断奶仔猪肠道的优势菌属,它有很强的降解半纤维素能[23]。瘤胃球菌属是消化球菌科的一种革兰氏阳性厌氧菌,参与纤维分解,提高饲料利用率、改善动物健康。本研究饲粮中添加抗菌肽显著提升了普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属相对丰度,说明与其他添加剂相比,抗菌肽饲粮分解纤维能力更强。各组排名前2位的菌属均为梭菌属和乳杆菌属,微生态组和抗菌肽组丰度总和均显著高于对照组,抗菌肽组普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属相对丰度均显著高于对照组,说明饲粮中添加抗菌肽更利于纤维素分解。以上结果表明,饲粮中添加微生态制剂和抗菌肽能提高断奶仔猪粪便有益菌的生长和肠道短链脂肪酸的产生,消化吸收能力增强,参与生产抗菌肽最优、微生态次之。

4 结论

饲粮中添加微生态制剂和抗菌肽可显著提高断奶仔猪ADG和ADFI,降低F/G和腹泻率,能显著提高免疫性能;添加微生态制剂和抗菌肽可以调节肠道微生物,改善肠道健康。本研究条件下,最佳饲料添加剂为抗菌肽,微生态制剂次之。

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