动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 5970 - 5980

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.506

研究论文

白藜芦醇激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α缓解脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和细胞凋亡

  • 马学虎 ,
  • 孙奕烁 * ,
  • 冀思同 ,
  • 曹佩佩 ,
  • 户春丽 ,
  • 马燕芬 , **
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  • 宁夏大学动物科技学院,宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室,银川 750021
** 马燕芬,研究员,博士生导师,E-mail:

* 同等贡献作者

马学虎(1997—),男,宁夏吴忠人,硕士研究生,从事反刍动物营养与调控研究。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2024-02-11

  网络出版日期: 2024-09-08

基金资助

宁夏反刍动物营养科技创新团队项目(2024CXTD008)

宁夏大学研究生创新项目(CXXM202348)

宁夏回族自治区青年拔尖人才项目(2023)

银川市科技创新团队项目(2023CXTD32)

收起

Resveratrol-Activated Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma Coactivator-1α Alleviates Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Injury and Apoptosis in Bovine Mammary Epithelial Cells

  • MA Xuehu ,
  • SUN Yishuo * ,
  • JI Sitong ,
  • CAO Peipei ,
  • HU Chunli ,
  • MA Yanfen , **
Expand
  • Key Laboratory of Molecular Cell Breeding of Ruminants of Ningxia Hui Autonomous Region, College of Animal Science and Technology, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
** professor, E-mail:

* Contributed equally

Received date: 2024-02-11

  Online published: 2024-09-08

Fold

摘要

为揭示白藜芦醇(RES)是否通过介导过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)起到缓解奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性反应,本试验对PGC-lα进行干扰(si-PGC-lα),采用单因素随机试验设计方法,设置si-NC+LPS组(含10 μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+含10 μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-NC+RES+LPS组(含10 μg/mL LPS以及15 μmol/L RES共同配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+RES+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+10 μg/mL LPS以及15 μmol/L RES共同配制的饥饿培养基)。结果发现:si-PGC-lα后加入LPS可显著或极显著上调炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的mRNA相对表达水平和含量(P<0.05或P<0.01),极显著上调氧化因子丙二醛(MDA)的mRNA相对表达水平(P<0.01),显著或极显著上调促凋亡因子B-细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(BAX)的mRNA相对表达水平和bMECs凋亡率(P<0.05或P<0.01),极显著降低抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的mRNA相对表达水平(P<0.01);而RES可逆转这一反应。当si-PGC-lα后再用RES处理则无法缓解LPS诱导的bMECs产生的氧化应激、炎性反应和细胞凋亡,说明RES是通过激活PGC-1α起到缓解LPS诱导的bMECs炎性损伤和细胞凋亡。由此可见,外源添加RES可通过激活PGC-1α起到缓解LPS诱导的bMECs线粒体损伤、氧化应激、炎性反应并抑制细胞凋亡。

关键词： 白藜芦醇; 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α; 奶牛乳腺上皮细胞; 氧化应激; 炎性损伤

本文引用格式

马学虎 , 孙奕烁 , 冀思同 , 曹佩佩 , 户春丽 , 马燕芬 . 白藜芦醇激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α缓解脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和细胞凋亡[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(9) : 5970 -5980 . DOI: 10.12418/CJAN2024.506

Abstract

In order to reveal whether resveratrol (RES) alleviated inflammatory reaction of bovine mammary epithelial cells (bMECs) by mediating peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α (PGC-1α), this present experiment was performed on the PGC-lα was interfered (si-PGC-lα) by using a one-way randomized trial design method, setting up si-NC+LPS group (hunger medium prepared with 10 μg/mL LPS), si-PGC-lα+LPS group (si-PGC-lα interference fragment+hunger medium prepared with 10 μg/mL LPS), si-NC+RES+LPS group (hunger medium co-prepared with 10 μg/mL LPS and 15 μmol/L RES) and si-PGC-lα+RES+LPS group (si-PGC-lα interference fragment+hunger medium co-prepared with 10 μg/mL LPS and 15 μmol/L RES). The results showed that the addition of LPS after si-PGC-lα significantly up-regulated the mRNA relative expression levels of contents of the inflammatory factors interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8) (P<0.05 or P<0.01), significantly up-regulated the mRNA relative expression level of the oxidizing factor malondialdehyde (MDA) (P<0.01), significantly up-regulated the mRNA relative expression level of the pro-apoptotic factor B-celllymphoma-2 associated X protein (BAX) and bMECs apoptosis rate (P<0.05 or P<0.01), and significantly down-regulated the mRNA relative expression level of the anti-oxidant gene glutathione peroxidase (GSH-Px) (P<0.01); and RES could reversed this response. When si-PGC-lα was followed by RES treatment, it failed to alleviate the oxidative stress, inflammatory stress and apoptosis produced by LPS-induced bMECs, suggesting that RES played a role in alleviating LPS-induced inflammatory injury and apoptosis in bMECs by activating the PGC-1α. In conclusion, exogenous addition of RES can alleviate LPS-induced mitochondrial damage, oxidative stress, inflammatory response and inhibit apoptosis of bMECs by activating the PGC-1α.

Key words： resveratrol; PGC-1α; bMECs; oxidative stress; inflammatory injury

乳腺炎是奶牛最为常见的感染性疾病之一,可降低乳腺健康和产奶量[1],增加奶牛淘汰率,给全球奶牛养殖业造成严重的经济损失。仅就乳腺炎对美国畜牧业的影响而言,产奶量和乳品质下降、兽医治疗成本飙升和农场管理成本增加造成的年度损失高达数十亿美元[2-3]。虽然奶牛乳腺炎的诊断和防控取得了重大的进展,但在全球仍普遍存在大量感染现象[1,4-5],仅在调查的15 780头奶牛中,乳腺炎的总发病率高达47.6%[6]。奶牛乳腺炎发生的主要原因是多种病原微生物入侵乳腺组织,释放大量致病性物质进入乳腺而导致;其次是奶牛产生自由基和清除自由基的能力失衡,能量需求和耗氧量需求增大,活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多,降低了奶牛机体的抗氧化能力,引起机体脂质过氧化,导致奶牛处于氧化应激状态,氧化应激能够加强中性粒细胞和乳腺上皮细胞的黏附作用,从而加强炎症反应,进一步加剧奶牛乳腺炎[4,7]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是一种细菌内毒素,是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的一部分,可诱导乳腺上皮细胞产生炎性反应,释放促炎介质和ROS,并被广泛用于建立炎性反应模型[8]。因此,调控氧化应激和炎性反应降低奶牛乳腺炎发病率对奶牛健康养殖至关重要。
白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种非黄酮类多酚有机化合物,具有多种生物活性作用,包括抗炎、抗氧化、保护心血管、抗衰老、抗癌等作用[9-10]。RES不仅能有效清除ROS,还能通过降低ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的产生,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性来减轻氧化应激[9]。此外,RES还可通过调控沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信号通路,诱导下游过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α,PGC-1α)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,Nrf1)、核呼吸因子2(nuclear respiratory factor 2,Nrf2)和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)的表达而增强线粒体生物活性,从而提高线粒体的抗氧化能力[11]。
线粒体是细胞的发电厂,是参与哺乳动物细胞中ATP合成的主要细胞器,负责维持氧化磷酸化,对于预防氧化损伤和细胞死亡起到至关重要的作用,因此被称为细胞信号通路的十字路口[12]。PGC-1α是线粒体生物发生的主要调节因子,可通过易位到细胞核内激活Nrf1和Nrf2随后激活TFAM,从而促进线粒体蛋白的合成、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的复制和转录以及新的线粒体生物发生,增加线粒体数量,从而使组织适应增加的能量需求来调控氧化应激和线粒体代谢[13],并通过调节多种线粒体氧化基因阻止氧化损伤和线粒体功能障碍[14]。
在炎性损伤条件下,由于细胞炎性因子含量较高,PGC-1α的活性降低,会进一步增强炎性反应导致细胞凋亡的发生[15],当肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达水平升高时,C2C12细胞中的PGC-1α表达水平下调,细胞的炎性反应和凋亡加剧[16]。而伴随着氧化应激的发生,细胞质和线粒体中清除ROS酶的基因表达减少,炎性反应会继续加重[17]。研究表明,RES可以降低氧化因子含量,抑制炎性因子表达,从而缓解鱼藤酮诱导的小鼠小胶质瘤细胞氧化应激和炎症[18]。然而,RES是如何保护奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)免受炎性损伤的作用研究仍不清楚;RES的抑炎保护作用是否与激活转录因子PGC-1α表达有关,目前尚未得到证实。因此,本研究选用LPS诱导的bMECs为炎症模型,探讨RES作为抗氧化剂通过靶向PGC-1α对LPS诱导的bMECs损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基(SH30022.01)购自Hyclone公司;胎牛血清(C04001)购自BI公司;青霉素-链霉素-两性霉素B混合液(735094)、白藜芦醇购自金克隆(北京)生物技术有限公司;Albumin Bovine V牛血清白蛋白(735094)购自上海罗氏制药有限公司;六孔细胞培养板购自无锡耐思生命科技股份有限公司;0.25%胰蛋白酶(SH30042.01B)、细胞增殖及毒性检测试剂盒(MA0218)购自大连美仑生物技术有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS)(SH30256.01B)购自北京索莱宝科技有限公司;多聚甲醛(P6148)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;Trition X-100溶液(Top1141)购自北京博奥拓达科技有限公司;QuickBlock免疫染色封闭液(P0260)、膜联蛋白V(Annexin V)-荧光素异硫氰酸酯(FITC)细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)、ROS检测试剂盒(S0033S)、线粒体膜电位检测试剂盒(C2006)均购自上海碧云天生物技术有限公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、Trizol购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养和试验设计

本研究中使用的bMECs(永生化MAC-T细胞系)由本课题组提供,完全培养基由DMEM培养基及含10%胎牛血清组成,饥饿培养基为单一的DMEM。所有培养条件均在37 ℃含5%二氧化碳(CO2)的培养箱中孵育。将bMECs接种到6孔培养板中(完全培养基:由90 mL的DMEM加含10 mL胎牛血清组成),待细胞生长至60%~70%后,进行干扰试验,LPS与RES的处理方式参照本课题组之前的研究[19]。将细胞分为si-NC+LPS组(含10 μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+含10 μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-NC+RES+LPS组(含10 μg/mL LPS以及15 μmol/L RES[19]共同配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+RES+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+10 μg/mL LPS以及15 μmol/L RES共同配制的饥饿培养基)。

1.2.2 PGC-1α干扰片段筛选

si-PGC-1α干扰片段和si-NC(阴性对照)由广州锐博生物有限公司设计合成。将bMECs接种到六孔细胞培养板中,待细胞汇合度为60%~70%时准备转染,在转染前换为Opti-MEMTM减血清培养基(不含血清)培养细胞。根据制造商的说明,使用Lipo3000转染试剂瞬时转染si-PGC-1α(100 nmol/L)或si-NC(100 nmol/L)到bMECs中处理6 h后换成完全培养基。转染48 h后收集bMECs用于荧光定量PCR和细胞凋亡检测,上清液用免疫吸附测定(ELISA)法检测。利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测si-PGC-1α转染bMECs后PGC-1α基因的相对表达量,筛选出PGC-1α最佳干扰效率片段用于后续试验。si-PGC-1α引物设计见表1。
表1 si-PGC-1α引物设计

Table 1 Primer design for si-PGC-1α

序号
Numbers		 基因名称
Gene names		 引物序列Primer sequence (5'—3')
上游Forward 下游Reverse
1 si-PGC-1α-974 CCACAACUCCUCCUCAUAATT UUAUGAGGAGGAGUUGUGGTT
2 si-PGC-1α-1667 GCACGCAGUCCUAUUCAUUTT AAUGAAUAGGACUGCGUGCTT
3 si-PGC-1α-2368 GCAGACCUAGAUUCAAAUUTT AAUUUGAAUCUAGGUCUGCTT
4 si-NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.3 ROS含量测定

采用二氯二氢荧光素二乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针测定bMECs内ROS含量。先将bMECs接种在6孔培养板中,待密度生长至70%~80%后,观察细胞状态,根据制造商的说明,吸出细胞培养基,并向每个孔中加入10 μmol/L的DCFH-DA;随后将细胞在37 ℃和5%二氧化碳(CO2)培养箱中孵育20 min后,用PBS洗涤3次,使用荧光倒置显微镜随机选择每个样品的微观视野进行观察,并重复观察3次。最后用ImageJ软件进行图像分析。

1.2.4 线粒体膜电位(MMP)测定

使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测不同bMECs的线粒体膜电位。首先将bMECs接种于6孔细胞培养板中,待bMECs密度生长至70%~80%后,观察细胞状态,根据制造商的说明,吸出细胞培养基,并向每个孔中加入等体积的JC-1染色溶液(5 μg/mL)在37 ℃和5% CO2的培养箱中孵育20 min后,用PBS冲洗2次以除去荧光探针后,使用荧光倒置显微镜观察荧光强度。JC-1染色结果显示为红色/绿色荧光的相对比值,试验重复3次,最后用ImageJ软件进行图像分析。

1.2.5 细胞凋亡测定

使用Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒测定BMECs凋亡率,收集细胞后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。详细步骤为:吸出原有培养基,加入PBS清洗后吸弃;室温条件加入胰酶消化,消化完成后加入含血清培养基停止消化,收集到离心管内;1 000×g离心5 min,弃上清加PBS(冷)重悬;再次1 000×g离心5 min吸出上清;加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液后混匀;室温避光10~20 min后流式细胞仪上机检测,Flow jo软件分析整理数据。

1.2.6 炎性因子含量检测

将bMECs接种于6孔培养板中,待bMECs密度生长至70%~80%后,收集细胞上清液,采用ELISA试剂盒(中国睿信生物科技有限公司)检测bMECs中炎性因子白细胞介素-6(interleukin,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin,IL-8)含量。

1.2.7 RNA提取和qPCR分析

根据试验设计,在不同时间段内按上述方式处理bMECs。随后使用Trizol法提取bMECs中总RNA,要求RNA的浓度达到吸光度(OD)260/280≥1.8,纯度达到OD260/230≥1.0,并通过琼脂糖凝胶电泳检查细胞中RNA降解和污染。通过PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒将获得的总RNA反转录成cDNA。qPCR反应程序如下:95 ℃、3 min预变性,95 ℃、10 s变性,60 ℃、20 s退火温度,72 ℃、30 s延伸,循环40次。使用Premier 5.0设计所有mRNA qPCR引物(表2),采用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参,每个测定设置3个重复。基因的相对表达水平使用2-ΔΔCt法[20]进行计算。
表2 引物信息

Table 2 Primer information

基因
Genes		 GenBank登录号
GenBank accession number		 序列
Sequences (5’—3’)		 产物长度
Product
length/bp		 温度
Temperature/
℃
过氧化物酶体增殖物激活
受体-γ共激活因子-1α
PGC-1α		 XM_059887363.1 F:TGGACACGAGGAAAGGAAGGC
R:ACGGGTCGGAATCTGTGGAAG		 200 60
白细胞介素-6
IL-6		 NM_173923.2 F:CTGGGTTCAATCAGGCGAT
R:CAGCAGGTCAGTGTTTGTGG		 206 60
白细胞介素-8
IL-8		 JN559767.1 F:ACACATTCCACACCTTTCCAC
R:ACCTTCTGCACCCACTTTTC		 149 60
β-肌动蛋白
β-actin		 HM768303.1 F:GCTAACAGTCCGCCTAGAA
R:GCAGTCATCACCATCGGCAATGAG		 406 60
B-细胞淋巴瘤-2相关X蛋白
BAX		 NM_173894.1 F:GAGATGAATTGGACAGTAACA
R:TTGAAGTTGCCGTCAGAA		 118 60
B淋巴细胞瘤-2
BCL-2		 NM_001166486.1 F:ATGACCGAGTACCTGAAC
R:CATACAGCTCCACAAAGG		 79 60
丙二醛
MDA		 NM_001046269.2 F:TCGGCTGGGCTAGGATGTT
R:AGAGCGTTCTCAGACGATGGA		 115 60
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px		 NM_174076.3 F:TGCGAGGTGAATGGCGAGAA
R:GGGACCAGGTGATGAACTTAGGG		 118 60
超氧化物歧化酶
SOD		 AY971580.1 F:GACAAATCTGAGCCCTAA
R:AAGCAGCAATCTGTAAGC		 185 60

1.3 数据处理

使用GraphPad Prism 9软件进行组间差异显著性检验,数据以“平均值±标准误”表示。P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。利用2-ΔΔCt法计算荧光定量的结果,利用Image J软件对细胞荧光图进行量化分析。

2 结果与分析

2.1 PGC-1α最佳干扰片段的筛选

RES在一定程度上可减轻LPS诱导的bMECs炎性损伤,假设这可能是RES通过激活PGC-1α起的作用。为此,本试验构建了si-PGC-1α-2368、si-PGC-1α-1667和si-PGC-1α-974共3个干扰片段,筛选出干扰效率最佳的si-PGC-1α干扰片段,之后用该片段预处理bMECs,以判定PGC-1α介导RES缓解炎性损伤bMECs的抗氧化和抗炎作用。由图1可见,与si-NC相比,si-PGC-1α-2368和si-PGC-1α-974的mRNA相对表达水平均极显著下降(P<0.01),其中si-PGC-1α-974的干扰效果最好,可用于后续干扰PGC-1α的试验。
图1 PGC-1α最佳干扰片段的筛选

*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。

Fig.1 Screening of optimal interfering fragments of PGC-1α

* indicated significant difference (P<0.05), and ** indicated significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 白藜芦醇依赖PGC-1α提升炎性损伤bMECs抗氧化功能

由图2可见,与si-NC+LPS组相比,si-PGC-1α+LPS组的bMECs中ROS荧光强度和MDA的mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01),GSH-Px的mRNA相对表达水平极显著降低(P<0.01),说明LPS诱导bMECs产生了氧化应激。与si-PGC-1α+LPS组相比,si-NC+RES+LPS组的bMECs中ROS荧光强度和MDA的mRNA相对表达水平极显著降低(P<0.01),SOD和GSH-Px的mRNA相对表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),说明RES具有缓解炎性损伤bMECs氧化应激的功能。与si-NC+RES+LPS组相比,si-PGC-1α+RES+LPS组的bMECs中ROS荧光强度和MDA的mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px的mRNA相对表达水平无显著差异(P>0.05),进一步说明RES是依赖于PGC-1α的高表达才能起到抑制炎性损伤bMECs氧化应激的作用。
图2 白藜芦醇依赖PGC-1α提升炎性损伤bMECs抗氧化功能

si-NC+LPS:si-NC+LPS组 si-NC+LPS group;si-PGC-1α+LPS:si-PGC-1α+LPS组 si-PGC-1α+LPS group;si-NC+RES+LPS:si-NC+RES+LPS组 si-NC+RES+LPS group;si-PGC-1α+RES+LPS:si-PGC-1α+RES+LPS组 si-PGC-1α+RES+LPS group。下图同 the same as below。

Fig.2 Resveratrol-dependent PGC-1α enhances antioxidant function of inflammation-injured bMECs

2.3 白藜芦醇依赖PGC-1α提升炎性损伤bMECs线粒体膜电位和抑制凋亡

由图3可见,与si-NC+LPS组相比,si-PGC-1α+LPS组的bMECs中线粒体膜电位极显著降低(P<0.01),bMECs凋亡率极显著升高(P<0.01),促凋亡因子B-细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(BAX)的mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05),说明LPS诱导bMECs发生线粒体紊乱,促进了细胞凋亡。与si-PGC-1α+LPS组相比,si-NC+RES+LPS组的bMECs中线粒体膜电位极显著升高(P<0.01),bMECs凋亡率极显著降低(P<0.01),促凋亡因子BAX的mRNA相对表达水平极显著降低(P<0.01),抑凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)的mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01),说明RES具有缓解炎性损伤bMECs线粒体紊乱的功能。与si-NC+RES+LPS组相比,si-PGC-1α+RES+LPS组的bMECs中线粒体膜电位极显著降低(P<0.01),bMECs凋亡率极显著升高(P<0.01),促凋亡因子BAX的mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01),抑凋亡因子BCL-2的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05),进一步说明RES是依赖于PGC-1α的高表达才能起到抑制炎性损伤bMECs线粒体紊乱,进而抑制细胞凋亡的作用。
图3 白藜芦醇依赖PGC-1α提升炎性损伤BMECs线粒体膜电位和抑制凋亡

Fig.3 Resveratrol-dependent PGC-1α elevates mitochondrial membrane potential and inhibits apoptosis of inflammation-injured BMECs

2.4 白藜芦醇依赖PGC-1α增加炎性损伤BMECs的抗炎作用

由图4可见,与si-NC+LPS组相比,si-PGC-1α+LPS组的bMECs中炎性因子IL-6和IL-8的mRNA相对表达水平和含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),说明LPS诱导bMECs产生了炎性损伤。与si-PGC-1α+LPS组相比,si-NC+RES+LPS组的bMECs中炎性因子IL-6和IL-8的mRNA相对表达水平和含量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),说明RES对LPS诱导的bMECs具有抗炎作用。与si-NC+RES+LPS组相比,si-PGC-1α+RES+LPS组的bMECs中炎性因子IL-6和IL-8的mRNA相对表达水平和含量无显著差异(P>0.05),进一步说明RES是依赖于PGC-1α的高表达才能起到对LPS诱导的bMECs的抗炎作用。以上试验结果表明,RES缓解bMECs炎性损伤的机制与线粒体转录因子PGC-1α的高表达有关。
图4 白藜芦醇依赖PGC-1α增加炎性损伤BMECs的抗炎作用

Fig.4 Resveratrol-dependent PGC-1α increases anti-inflammatory effect of inflammation-injured BMECs

3 讨论

奶牛乳腺健康是奶牛泌乳功能正常发挥的重要保障。奶牛乳腺炎是全球最常见和成本最高的奶牛疾病之一[21],主要由病原微生物入侵乳腺内环境引起,能直接诱导乳腺组织产生炎性损伤,降低血乳屏障密闭性并抑制乳腺上皮细胞的泌乳功能,进而降低产奶量及乳成分质量[22⇓-24]。LPS是革兰氏阴性菌中极其重要的细胞壁成分,其刺激会导致乳腺组织产生炎性损伤,可增加奶牛乳腺中炎性基因的高表达,加快乳腺炎的发生和发展[25]。LPS诱导的PGC-1α表达下调已在其他研究中得到证实[26⇓-28]。同样,在本课题组之前的研究中也发现在LPS诱导的bMECs炎症模型中,PGC-1α及其下游基因Nrf2、TFAM的mRNA相对表达水平降低[19]。并且有研究证明,RES可通过激活PGC-1α减少了LPS诱导的小胶质细胞炎症损伤对线粒体起保护作用[29]。所以,进一步探究PGC-1α在奶牛乳腺炎疾病中的功能作用,将有助于了解奶牛乳腺炎的发病机制,有望成为奶牛乳腺炎诊断和治疗的新靶点。
过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1(PGC-1)家族成员能够发挥抗炎的保护作用,其中PGC-1α在调节线粒体功能、氧化应激、炎症和组织代谢过程中具有至关重要的作用[30],并且是激活线粒体生物发生的强有力的激动剂,也是一种调节细胞能量代谢的转录共激活因子,是提高抗氧化能力的关键,在多种炎症疾病中发挥至关重要的角色。本试验中敲除PGC-1α后bMECs中ROS荧光强度和MDA的mRNA相对表达水平升高,SOD的mRNA相对表达水平降低,同时也降低了线粒体膜电位。这印证了PGC-1α是调控氧化应激与线粒体功能的关键基因。有研究发现,激活PGC-1α信号通路可以减少氧化应激反应,提高线粒体膜电位,并且能够减少MDA和ROS的产生,增强SOD的活性[31];反之,PGC-1α表达水平下降,可以促进炎症反应的发生,从而导致氧化应激和细胞凋亡[32],以上结果与本研究结果相似。线粒体稳态是机体健康的重要前提,本试验结果中,添加RES后增强了bMECs中线粒体膜电位,而当敲除PGC-1α后这种作用消失,说明RES是通过激活PGC-1α后发挥对bMECs线粒体的保活作用。Uche等[33]通过添加卡维地洛处理细胞后发现,卡维地洛也是通过激活PGC-1α减轻阿霉素诱导心肌细胞的线粒体功能抑制实现对线粒体的保护作用。所以,PGC-1α在保护线粒体功能稳态中发挥着重要作用。炎症是一种适应性反应,可由各种刺激触发,会引起细胞发生损伤。本试验中,敲除PGC-1α后bMECs中炎症基因IL-6、IL-8的mRNA相对表达水平和含量上调,且当敲除PGC-1α后加入RES处理后发现RES对bMECs基本没有作用,表明PGC-1α具有抗炎作用,而RES则通过活化PGC-1α后发挥其抗炎作用。Zhang等[34]通过对足细胞研究发现,RES可通过激活SIRT1/PGC-1α介导线粒体发挥保护作用,并减轻高糖刺激诱导足细胞的氧化损伤和凋亡程度,且RES的加入能够减轻线粒体损伤,提高PGC-1α的mRNA相对表达水平,减轻氧化应激、炎性反应和细胞凋亡程度。此外,RES通过上调SIRT1/PGC-1α途径清除受损的线粒体并增强线粒体生物发生,缓解了LPS诱导的长尾鲤氧化应激及炎症和凋亡[35]。除了对炎症的作用外,RES还可通过增加PGC-1α表达改善线粒体功能,来减轻LPS对成骨细胞分化的抑制[28]。
BCL-2蛋白家族中的BAX和BCL-2是凋亡途径早期阶段的关键调节因子[36]。BCL-2是一种抗凋亡基因,能够抑制氧自由基的产生,也能稳定线粒体膜电位,而BAX则起到促进细胞凋亡的作用[37]。本试验通过干扰PGC-1α后对BAX和BCL-2的mRNA相对表达水平进行检测发现,当敲除PGC-1α后bMECs中促凋亡因子BAX的mRNA相对表达水平进升高,而抗凋亡基因BCL-2的mRNA表达量降低,且加入RES后BAX和BCL-2的mRNA相对表达水平进基本不变,说明PGC-1α具有抗凋亡作用,抗氧化物RES则通过靶向PGC-1α发挥其抗凋亡作用。此外,本研究通过流式细胞术检测干扰PGC-1α后bMECs的凋亡率,发现其结果与促凋亡基因的变化一致。
PGC-1α活化对RES的保护作用归因于PGC-1α介导的氧化应激和其对线粒体损伤的减少。通过PGC-1α干扰试验,发现干扰PGC-1α后,RES对bMECs抗炎抗氧化的调节作用减弱,RES未能减轻线粒体损伤程度,增加PGC-1α表达可缓解氧化应激、炎性反应和细胞凋亡的作用。由此得出RES可通过介导PGC-1α增加线粒体膜电位来介导线粒体发挥调节bMECs抗炎、抗氧化的作用。根据目前的研究数据,得出RES能够介导PGC-1α来缓解LPS诱导的bMECs炎性损伤,从而减轻线粒体损伤,缓解氧化应激、炎性反应和细胞凋亡。基于以上研究结果,深层次探究PGC-1α在奶牛乳腺炎性疾病中的功能作用,将有助于了解奶牛乳腺炎的发病机制,PGC-1α有望成为奶牛乳腺炎诊断和治疗的新靶点。因此,我们需要进一步研究PGC-1α的调控机制和作用方式,以期为奶牛乳腺炎的诊断和治疗提供新的思路和方法。

4 结论

PGC-1α可以通过提升抗氧化酶GSH-Px、SOD的mRNA相对表达水平,降低炎性因子IL-6、IL-8和氧化因子MDA的mRNA相对表达水平以及ROS荧光强度,提升线粒体功能,而起到抑制细胞产生炎症与凋亡的作用;RES可通过靶向PGC-1α缓解由LPS诱导bMECs产生的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡,缓解围产期奶牛的氧化应激和炎性应激。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
KLAAS I C, ZADOKS R N. An update on environmental mastitis:challenging perceptions[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2018,65 (Suppl.1):166-185.

[2]
PUERTO M A, SHEPLEY E, CUE R I, et al. The hidden cost of disease:Ⅱ.Impact of the first incidence of lameness on production and economic indicators of primiparous dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2021, 104(7):7944-7955.

[3]
HU H H, FANG Z, MU T, et al. Application of metabolomics in diagnosis of cow mastitis:a review[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2021, 8:747519.

[4]
DEB R, KUMAR A, CHAKRABORTY S, et al. Trends in diagnosis and control of bovine mastitis:a review[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences:PJBS, 2013, 16(23):1653-1661.

[5]
COBIRKA M, TANCIN V, SLAMA P. Epidemiology and classification of mastitis[J]. Animals:an Open Access Journal from MDPI, 2020, 10(12):2212.

[6]
TORA E T, BEKELE N B,SURESH KUMAR R S. Bacterial profile of bovine mastitis in Ethiopia:a systematic review and Meta-analysis[J]. PeerJ, 2022, 10:e13253.

[7]
FU K Q, SUN Y N, WANG J B, et al. Tanshinone Ⅱa alleviates LPS-induced oxidative stress in dairy cow mammary epithelial cells by activating the Nrf2 signalling pathway[J]. Research in Veterinary Science, 2022, 151:149-155.

[8]
STRANDBERG Y, GRAY C, VUOCOLO T, et al. Lipopolysaccharide and lipoteichoic acid induce different innate immune responses in bovine mammary epithelial cells[J]. Cytokine, 2005, 31(1):72-86.

PMID

[9]
MENG T T, XIAO D F, MUHAMMED A, et al. Anti-inflammatory action and mechanisms of resveratrol[J]. Molecules, 2021, 26(1):229.

[10]
REN B X, KWAH M X Y, LIU C L, et al. Resveratrol for cancer therapy:challenges and future perspectives[J]. Cancer Letters, 2021, 515:63-72.

[11]
KUNG H C, LIN K J, KUNG C T, et al. Oxidative stress,mitochondrial dysfunction,and neuroprotection of polyphenols with respect to resveratrol in parkinson’s disease[J]. Biomedicines, 2021, 9(8):918.

[12]
CHABAN Y, BOEKEMA E J, DUDKINA N V. Structures of mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and mechanisms for their stabilisation[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1837(4):418-426.

DOI PMID

[13]
LI P A, HOU X L, HAO S C. Mitochondrial biogenesis in neurodegeneration[J]. Journal of Neuroscience Research, 2017, 95(10):2025-2029.

DOI PMID

[14]
RIUS-PÉREZ S, TORRES-CUEVAS I, MILLÁN I, et al. PGC-1 α,inflammation,and oxidative stress:an integrative view in metabolism[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020, 2020:1452696.

[15]
ABU SHELBAYEH O, ARROUM T, MORRIS S, et al. PGC-1α is a master regulator of mitochondrial lifecycle and ROS stress response[J]. Antioxidants (Basel), 2023: 12(5):1075.

[16]
REMELS A H V, GOSKER H R, BAKKER J, et al. Regulation of skeletal muscle oxidative phenotype by classical NF-κB signalling[J]. Biochimica et Biophysica acta, 2013, 1832(8):1313-1325.

DOI PMID

[17]
KADLEC A O, CHABOWSKI D S, AIT-AISSA K, et al. Role of PGC-1α in vascular regulation:implications for atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology, 2016, 36(8):1467-1474.

[18]
LI H H, SHEN Y J, XIAO H, et al. Resveratrol attenuates rotenone-induced inflammation and oxidative stress via STAT1 and Nrf2/Keap1/SLC7A11 pathway in a microglia cell line[J]. Pathology,Research and Practice, 2021, 225:153576.

[19]
孙奕烁. 白藜芦醇介导PGC-1α缓解奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的研究[D]. 硕士学位论文. 银川: 宁夏大学, 2023.

SUN Y S. Resveratrol-mediated PGC-la to alleviate inflammatoryinjury in bovine mammary epithelial cells[D]. Master’s Thesis. Yinchuan: Ningxia University, 2023. (in Chinese)

[20]
户春丽, 雷召雄, 汪书哲, 等. circADAMTS16的表达谱分析及其对牛脂肪细胞分化的影响[J]. 西北农业学报, 2024, 33(2):208-217.

HU C L, LEI Z X, WANG S Z, et al. Expression profile analysis of circADAMTS16 and its effect on differentiation of bovine adipocytes[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2024, 33(2):208-217. (in Chinese)

[21]
MUSHTAQ S, SHAH A M, SHAH A, et al. Bovine mastitis:an appraisal of its alternative herbal cure[J]. Microbial Pathogenesis, 2018, 114:357-361.

[22]
CHENG W N, HAN S G. Bovine mastitis:risk factors,therapeutic strategies,and alternative treatments-a review[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2020, 33(11):1699-1713.

[23]
ZHENG Y H, LIU G, WANG W, et al. Lactobacillus casei Zhang counteracts blood-milk barrier disruption and moderates the inflammatory response in Escherichia coli-induced mastitis[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12:675492.

[24]
GONG X X, SU X S, ZHAN K, et al. The protective effect of chlorogenic acid on bovine mammary epithelial cells and neutrophil function[J]. Journal of Dairy Science, 2018, 101(11):10089-10097.

DOI PMID

[25]
YU G M, KUBOTA H, OKITA M, et al. The anti-inflammatory and antioxidant effects of melatonin on LPS-stimulated bovine mammary epithelial cells[J]. PloS One, 2017, 12(5):e0178525.

[26]
WANG L, WANG X H, KONG L N, et al. Isoliquiritigenin alleviates LPS/D-GalN-induced acute liver failure by activating the PGC-1α/Nrf2 pathway to reduce oxidative stress and inflammatory response[J]. International Immunopharmacology, 2021, 100:108159.

[27]
LIANG D S, JIN Y M, LIN M M, et al. Down-regulation of Xist and Mir-7a-5p improves LPS-induced myocardial injury[J]. International Journal of Medical Sciences, 2020, 17(16):2570-2577.

DOI PMID

[28]
MA J, WANG Z, ZHAO J Q, et al. Resveratrol attenuates lipopolysaccharides (LPS) -induced inhibition of osteoblast differentiation in MC3T3-E1 cells[J]. Medical Science Monitor:International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2018, 24:2045-2052.

[29]
YANG X D, XU S Q, QIAN Y W, et al. Resveratrol regulates microglia M1/M2 polarization via PGC-1α in conditions of neuroinflammatory injury[J]. Brain,Behavior,and Immunity, 2017, 64:162-172.

[30]
YUAN S G, LIU X M, ZHU X J, et al. The role of TLR4 on PGC-1 α-mediated oxidative stress in tubular cell in diabetic kidney disease[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2018, 2018:6296802.

[31]
ZHANG T, CHI Y Q, KANG Y L, et al. Resveratrol ameliorates podocyte damage in diabetic mice via SIRT1/PGC-1α mediated attenuation of mitochondrial oxidative stress[J]. Journal of Cellular Physiology, 2019, 234(4):5033-5043.

DOI PMID

[32]
YANG Q N, WANG C Y, JIN Y, et al. Disocin prevents postmenopausal atherosclerosis in ovariectomized LDLR-/- mice through a PGC-1α/ERα pathway leading to promotion of autophagy and inhibition of oxidative stress,inflammation and apoptosis[J]. Pharmacological Research, 2019, 148:104414.

[33]
UCHE N, DAI Q, LAI S P, et al. Carvedilol phenocopies PGC-1α overexpression to alleviate oxidative stress,mitochondrial dysfunction and prevent doxorubicin-induced toxicity in human iPSC-derived cardiomyocytes[J]. Antioxidants (Basel, Switzerland), 2023, 12(8):1585.

[34]
ZHANG T, CHI Y Q, REN Y Z, et al. Resveratrol reduces oxidative stress and apoptosis in podocytes via sir2-related enzymes,sirtuins1 (SIRT1)/peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1α (PGC-1α) axis[J]. Medical Science Monitor, 2019, 25:1220-1231.

[35]
WU L Y, CHEN Q Z, DONG B, et al. Resveratrol alleviates lipopolysaccharide-induced liver injury by inducing SIRT1/P62-mediated mitophagy in gibel carp (Carassius gibelio)[J]. Frontiers in Immunology, 2023, 14:1177140.

[36]
LEE J S, JUNG W K, JEONG M H, et al. Sanguinarine induces apoptosis of HT-29 human colon cancer cells via the regulation of Bax/Bcl-2 ratio and caspase-9-dependent pathway[J]. International Journal of Toxicology, 2012, 31(1):70-77.

DOI PMID

[37]
PERLMAN H, ZHANG X, CHEN M W, et al. An elevated bax/bcl-2 ratio corresponds with the onset of prostate epithelial cell apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6(1):48-54.

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