动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 5994 - 6006

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.508

研究论文

聚β-胡萝卜素聚合物的急性毒性试验、亚慢性毒性试验和致突变性试验

  • 白力格扣 ,
  • 李寒梅 ,
  • 袁非凡 ,
  • 建晓倩 ,
  • 陈子贤 ,
  • 王淦锋 ,
  • 黄田田 ,
  • 张桄苋 ,
  • 陈树林 ,
  • 丛日华 , *
展开
  • 西北农林科技大学动物医学院,杨陵 712100
* 丛日华,副教授,博士生导师,E-mail:

白力格扣(1997—),男,蒙古族,甘肃酒泉人,硕士研究生,从事动物营养调控研究。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2024-03-21

  网络出版日期: 2024-09-08

基金资助

陕西省国际科技合作计划项目(2021KWZ-22)

陕西省技术创新引导计划(2017KC06-100)

收起

Acute Toxicity Test, Sub-Chronic Toxicity Test and Mutagenicity Test of Poly β-Carotene Polymer

  • Bailigekou ,
  • LI Hanmei ,
  • YUAN Feifan ,
  • JIAN Xiaoqian ,
  • CHEN Zixian ,
  • WANG Ganfeng ,
  • HUANG Tiantian ,
  • ZHANG Guangxian ,
  • CHEN Shulin ,
  • CONG Rihua , *
Expand
  • College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2024-03-21

  Online published: 2024-09-08

Fold

摘要

本试验旨在通过小鼠急性毒性试验、大鼠亚慢性毒性试验和小鼠致突变性试验对聚β-胡萝卜素聚合物进行安全性评价。急性毒性试验:将50只昆明小鼠随机分为5组,每组10只。测定聚β-胡萝卜素聚合物的半数致死量(LD50)和95%置信区间。亚慢性毒性试验:将80只无特定病原体(SPF)级SD大鼠随机分为4组,每组20只。低、中高剂量组分别灌胃100、250和500 mg/kg BW的聚β-胡萝卜素聚合物,对照组灌胃等体积的植物油,连续灌服30 d。测定大鼠生长性能、血液生理指标、血清生化指标、脏器指数及组织病理学。致突变性试验:将50只昆明小鼠随机分为5组,每组10只。依据本试验得出聚β-胡萝卜素聚合物的LD50,低、中、高剂量组分别灌胃282.5、565.0和1 130.0 mg/kg BW的聚β-胡萝卜素聚合物,阴性对照组灌胃等体积的植物油,阳性对照组腹腔注射0.4 mL/kg环磷酰胺。测定嗜多染红细胞/红细胞比值和嗜多染红细胞微核率。结果表明:1)急性毒性试验中,聚β-胡萝卜素聚合物的LD50为2 260 mg/kg BW,95%置信区间为2 067~2 470 mg/kg BW。2)亚慢性毒性试验中,试验期间内大鼠精神食欲等状况良好。与对照组相比,低、中、高剂量组的雄性大鼠和高剂量组的雌性大鼠末重、平均日增重、平均日采食量极显著升高(P<0.01),料重比极显著降低(P<0.01)。中剂量组的雄性大鼠红细胞压积显著低于低剂量组(P<0.05),各组之间大鼠的其他血液生理指标和血清生化指标均无显著差异(P>0.05)。中、高剂量组的雌性大鼠肾脏指数显著低于对照组和低剂量组(P<0.05),各组之间大鼠的脏器重和其他脏器指数均无显著差异(P>0.05)。组织病理学检查表明各组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏无明显病理变化。3)致突变性试验中,与阴性对照组相比,阳性对照组的雄性、雌性小鼠的嗜多染红细胞微核率极显著增加(P<0.01),低、中、高剂量组的雄性、雌性小鼠的嗜多染红细胞微核率均差异不显著(P>0.05)。由此可见,聚β-胡萝卜素聚合物无明显急性毒性、亚慢性毒性和致突变性。聚β-胡萝卜素聚合物可以提高大鼠的生长性能,可作为一种安全的饲料添加剂进一步开发利用。

关键词： 聚β-胡萝卜素聚合物; 急性毒性; 亚慢性毒性; 致突变性

本文引用格式

白力格扣 , 李寒梅 , 袁非凡 , 建晓倩 , 陈子贤 , 王淦锋 , 黄田田 , 张桄苋 , 陈树林 , 丛日华 . 聚β-胡萝卜素聚合物的急性毒性试验、亚慢性毒性试验和致突变性试验[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(9) : 5994 -6006 . DOI: 10.12418/CJAN2024.508

Abstract

This study aimed to evaluate the safety of poly β-carotene polymer through acute toxicity test in mice, sub-chronic toxicity test in rats and mutagenicity test in mice. Acute toxicity test: 50 Kunming (KM) mice were randomly divided into 5 groups with 10 mice in each group. The median lethal dose (LD50) and 95% confidence interval of poly β-carotene polymer were determined. Sub-chronic toxicity test: 80 specific pathogen free (SPF) grade SD rats were randomly divided into 4 groups with 20 rats in each group. The low-, medium- and high-dose groups were gavaged with 100, 250 and 500 mg/kg BW poly β-carotene polymer, respectively, and the control group was gavaged with an equal volume of vegetable oil for 30 d. The growth performance, blood physiological indices, serum biochemical indices, organ indices and histopathology of the rats were determined. Mutagenicity test: 50 KM mice were randomly divided into 5 groups with 10 mice in each group. Based on the LD50 of poly β-carotene polymer derived from this test, the low-, middle- and high-dose groups were gavaged with 282.5, 565.0 and 1 130.0 mg/kg BW poly β-carotene polymer, respectively; the negative control group was gavaged with an equal volume of vegetable oil, and the positive control group was injected intraperitoneally with 0.4 mL/kg cyclophosphamide. The polychromatic erythrocyte/erythrocyte ratio and polychromatic erythrocyte micronucleus rate were determined. The results showed as follows: 1) in the acute toxicity test, the LD50 of poly β-carotene polymer was 2 260 mg/kg BW, with a 95% confidence interval of 2 067 to 2 470 mg/kg BW. 2) In the sub-chronic toxicity test, the rat’s mental appetite and other conditions during the test period were good. Compared with the control group, the final weight, average daily gain, average daily feed intake of male rats in the low-, medium- and high-dose groups and female rats in the high dose group were significantly increased (P<0.01), and the feed to gain ratio was significantly decreased (P<0.01). The hematocrit of male rats in the medium-dose group was significantly lower than that in the low-dose group (P<0.05), and there were no significant differences in other blood physiological and serum biochemical indices of rats among all groups (P>0.05). The kidney index of female rats in middle- and high-dose groups was significantly lower than that in control and low-dose groups (P<0.05), and there was no significant difference in organ weight and other organ indices of rats among all groups (P>0.05). Histopathological examination showed that there were no obvious pathological changes in the heart, liver, spleen, kidney and lungs of rats among all groups. 3) In the mutagenicity test, compared with the negative control group, the polychromatic erythrocyte micronucleus rate of male and female rats in the positive control group was significant increased (P<0.01), and the polychromatic erythrocyte micronucleus rate of male and female rats in low-, medium- and high-dose groups were no significant difference (P>0.05). In conclusion, the poly β-carotene polymer has no obvious acute toxicity, sub-chronic toxicity and mutagenicity. The poly β-carotene polymer can improve the growth performance of rats, and can be further developed and utilized as a safe feed additive.

Key words： poly β-carotene polymer; acute toxicity; sub-chronic toxicity; mutagenicity

植物性饲料添加剂源自天然植物,相较于化学合成品,具有更高的安全性和更低的副作用,从而在动物健康和生长性能提升、畜产品品质改善、环境保护以及养殖业可持续发展等方面发挥着重要作用[1]。随着消费者对食品安全和环保意识的日益增强,植物性饲料添加剂的市场前景变得愈发广阔。聚β-胡萝卜素聚合物(poly β-carotene polymer)是一种在多种植物体内自然存在的化学物质,它是由β-胡萝卜素与环境中的氧气进行的自然化学反应生成的,由β-胡萝卜素共聚物和少量的类胡萝卜素产物组成[2-3]。Burton等[2]研究发现,聚β-胡萝卜素聚合物并没有β-胡萝卜素所具有的维生素A原活性和抗氧化特性,这使得它的作用机制比β-胡萝卜素更加特殊。目前国外已有对聚β-胡萝卜素聚合物安全性评估的相关研究,然而,由于原材料加工工艺的差异,聚β-胡萝卜素聚合物的成分可能不尽相同,这可能会导致不同的毒性评测结果。因此,本试验将依据《新药药理学研究方法》[4]和《兽药研究技术指导原则汇编》[5]进行聚β-胡萝卜素聚合物的小鼠急性毒性试验、大鼠30 d亚慢性毒性试验和致突变性试验,以初步评估其可能的中毒靶器官和潜在的中毒反应,为其在动物生产中的应用提供理论依据,也为新饲料添加剂的申报提供相关研究资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验材料

本试验遵循中国动物福利指南,并经西北农林科技大学动物福利委员会批准(批准号:XN2024-0207)。
试验动物:108只40~50日龄的清洁级昆明(KM)小鼠,雌雄各占1/2,体重18~23 g;80只50日龄的清洁级SD大鼠,雌雄各占1/2,体重150~200 g。试验动物购自成都达硕实验动物有限公司,试验动物生产许可证号:SCXK(川)2020-030。
试验材料:聚β-胡萝卜素聚合物由β-胡萝卜素通过氧共聚反应制备,呈黄色玻璃状,精细粉碎后为粉末剂型,纯度>95%,去甲异戊二烯类化合物含量<5%,由实验室自制。

1.2 主要试剂

多聚甲醛、中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司,苏木精-伊红(HE)染色液购自北京索莱宝科技有限公司,环磷酰胺购自上海源叶生物科技有限公司,吉姆萨染料购自万研科技有限公司,灭活胎牛血清购自广州蕊特生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

主要仪器包括Chemray 240全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技有限公司)、BC-2800vet迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪(迈瑞医疗器械有限公司)、数码显微镜(日本索尼公司)、精密轮转石蜡切片机(德国徕卡公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 饲养管理

所有小鼠、大鼠饲养于西北农林科技大学动物医学院二级动物房,动物房室内温度为20~25 ℃,相对湿度为50%~60%,标准光线环境(每日光照黑暗各12 h)。试验期间定期清理垫料,确保饲养环境卫生,并保证通风、安静,水源和饲料充足。

1.4.2 急性毒性试验

采用改良寇氏法,在预试验中将健康小鼠随机分为4组,每组4只,雌雄各占1/2,聚β-胡萝卜素聚合物按400、800、1 600、3 200 mg/kg BW的剂量对小鼠进行灌服,找出动物零死亡的最小剂量和全死亡的最大剂量。在正式试验中,将小鼠随机分为5组(1~5组),每组10只,雌雄各占1/2,根据预试验中最小剂量和最大剂量,计算组间剂量比(r),按体重计算出给药量,用金属胃管经口一次性灌服,灌胃前12 h、灌胃后4 h禁食(自由饮水)。试验期间观察小鼠的精神食欲状态以及被毛、自主活动和死亡的情况,连续观察14 d。对死亡小鼠及时解剖,记录病变情况。计算聚β-胡萝卜素聚合物的半数致死量(LD50)和95%置信区间,并根据分级标准判定其毒性大小。

1.4.3 亚慢性毒性试验

1.4.3.1 大鼠的分组与灌胃

将80只无特定病原体(SPF)级SD大鼠随机分为4组,每组20只,雌雄各占1/2。根据《新药药理学研究方法》方法,低、中高剂量组分别灌胃100、250和500 mg/kg BW的聚β-胡萝卜素聚合物,对照组灌胃等体积的植物油。各组按动物的平均体重分别计算出每天的给药量,每天10:00—11:00灌服给药1次,连续灌服30 d,最后1次灌服给药后24 h,对所有大鼠执行安乐死后剖检,检测各项指标。

1.4.3.2 临床表现观察

整个试验过程中,每天观察和记录动物的一般状况,包括精神食欲状态、外观、中毒症状以及死亡情况等。若有异常,进一步观察其发生的时间、程度以及持续时间。

1.4.3.3 大鼠生长性能指标的测定

在给药周期内,每天测定1次采食量,每周测定1次体重,并计算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.4.3.4 大鼠血液生理指标的测定

试验结束后,于给药后31 d,各组大鼠禁食12 h后腹腔注射0.5%戊巴比妥钠溶液麻醉,腹主动脉采血,收集3 mL到抗凝管中,委托武汉塞维尔科技有限公司采用全自动血液细胞分析仪测定。

1.4.3.5 大鼠血清生化指标的测定

腹主动脉采血,将非抗凝血收集到10 mL离心管中4 ℃过夜析出血清,于2~8 ℃下860×g离心20 min,取上清于-80 ℃保存,委托武汉塞维尔科技有限公司采用全自动生化分析仪测定。血清生化指标包括:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(UN)、肌酐(Cr)、葡萄糖(GLU)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)。

1.4.3.6 大鼠脏器指数的测定

采血后的大鼠分离心脏、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏等脏器,尽快称重并记录脏器的绝对重量。根据以下公式计算脏器指数:
脏器指数=脏器重量/体重。

1.4.3.7 组织病理学检查

试验结束后,观察大鼠各组织器官是否有病变,并将有病变的组织器官进行标记,取相关组织器官放入4%多聚甲醛内进行固定,固定1周后,对固定的组织和器官,进行脱水、包埋、切片、HE染色,并制作石蜡切片,在光学显微镜下观察其病理组织学变化并收集图像。

1.4.4 致突变性试验(骨髓细胞微核试验)

1.4.4.1 小鼠的分组与给药方案

将50只KM小鼠随机分为5组,每组10只,雌雄各占1/2。依据本试验得出聚β-胡萝卜素聚合物的LD50,低、中、高剂量组分别灌胃282.5、565.0和1 130.0 mg/kg BW的聚β-胡萝卜素聚合物,阴性对照组灌胃等体积的植物油,阳性对照组腹腔注射0.4 mL/kg环磷酰胺。给药组均按每组动物的平均体重分别计算给药量,给药2次,2次给药间隔24 h。

1.4.4.2 标本制备

给药6 h后,每组各处死10只小鼠(雌雄各占1/2),取出股骨,减去股骨两端,用0.2~0.5 mL灭火小牛血清冲洗骨髓腔数次。将冲洗数推片,每只小鼠3张,迅速干燥,随后置于甲醇中固定10 min,取出晾干。将固定好的涂片用吉姆萨染色液染色30 min,蒸馏水冲洗,晾干。

1.4.4.3 阅片

用双盲法阅片,选择细胞完整、分散均匀、着色适中的区域,用油镜观察,吉姆萨染色后嗜多染红细胞(PCE)呈灰蓝色,红细胞(RBC)呈粉红色。典型微核呈圆形,边缘光滑整齐,嗜色性与核质一致呈紫红色或蓝紫色。每只小鼠涂片计数嗜多染红细胞1 000个以上,观察并计数其中含有微核的嗜多染红细胞。同时,在观察计数嗜多染红细胞时,在同一视野下也对红细胞进行观察计数,并记录各组每只小鼠嗜多染红细胞检查数、含微核嗜多染红细胞数、红细胞数等。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较,结果以平均值±标准差表示。当P<0.05时,判定具有统计学意义的显著性差异;当P<0.01时,判定具有统计学意义的极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 聚β-胡萝卜素聚合物的急性毒性试验

预试验中确定的聚β-胡萝卜素聚合物大致致死剂量为1 600~3 200 mg/kg BW。正式试验对小鼠灌胃不同剂量的聚β-胡萝卜素聚合物,连续观察14 d。出现中毒症状的小鼠24~36 h后出现食欲降低、呆卧少动、眼睑紧闭、排稀便等症状,存活小鼠状态正常,体重变化不大,正常采食和饮水,对死亡小鼠立即解剖观察,脏器无眼观病变。
由表1可知,最大剂量对数(Xm)=3.520,相邻2组剂量对数之差(i)=0.079,各组小鼠死亡率总和(ΣP)=2.6,各组小鼠数量(n)=10,将数据代入公式,可得:
LD50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]=2 260;
SlgLD50=i Σ P - ( 1 - P ) n=0.02;
X=lg-1(lgLD50±1.96SlgLD50)=2 067~2 470。
即聚β-胡萝卜素聚合物灌胃小鼠的LD50为2 260 mg/kg BW,SlgLD50标准误为0.02,95%置信区间为2 067~2 470 mg/kg BW。
表1 聚β-胡萝卜素聚合物的急性毒性试验结果

Table 1 Results of acute toxicity test of poly β-carotene polymer

组别
Groups		 剂量
Dose/(mg/kg BW)		 剂量对数
Logarithm of dose		 动物数量
Number of animals/只		 死亡数量
Death number/只		 死亡率
Mortality/%
1 1 600 3.204 10 0 0
2 1 920 3.283 10 3 30
3 2 304 3.362 10 5 50
4 2 764 3.441 10 8 80
5 3 317 3.520 10 10 100

2.2 聚β-胡萝卜素聚合物的亚慢性毒性试验

2.2.1 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠大体情况的影响

观察并记录各组大鼠瞳孔、肤色、呼吸、分泌、自主活动、粪便等一系列表现,结果显示各组大鼠外观和行为活动、饮水、进食情况等均无明显异常(表2)。
表2 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠大体情况的影响

Table 2 Effects of poly β-carotene polymer on general situation of rats

项目
Items		 毒性反应程度
Degree of toxicity		 判定
Judge

瞳孔
Pupil		 扩大 无
缩小 无

眼球
Eyeballs		 突出 无
凹陷 无

肤色
Skin colour		 苍白 无
发绀 无

呼吸
Respiratory		 急促 无
缓慢 无

自主活动
Autonomous activities		 增加 无
减少 无

异常肌肉活动
Abnormal muscle activity		 抽搐 无
步态异常 无

大便
Excrement		 稀便 无
失禁 无

2.2.2 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠生长性能的影响

由表3可见,与对照组相比,低、中、高剂量组的雌性、雄性大鼠料重比极显著降低(P<0.01),低、中、高剂量组的雄性大鼠和高剂量组雌性大鼠末重、平均日增重、平均日采食量极显著升高(P<0.01),中剂量组的雌性大鼠末重、平均日增重极显著升高(P<0.01),低剂量组的雌性大鼠末重、平均日增重显著升高(P<0.05)。
表3 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠生长性能的影响

Table 3 Effects of poly β-carotene polymer on growth performance of rats (n=10)

性别
Gender		 组别
Groups		 初重
IW/g		 末重
FW/g		 平均日增重
ADG/(g/d)		 平均日采食量
ADFI/(g/d)		 料重比
F/G
对照组
Control group		 188.63±1.58 278.79±5.01Dd 3.01±0.17Dd 16.56±0.05Dd 5.53±0.32Cd
低剂量组
Low-dose group		 187.09±1.77 285.55±2.10Cc 3.28±0.07Cc 16.71±0.05Cc 5.10±0.12Bc
雄性Male 中剂量组
Middle-dose group		 187.43±1.96 295.02±2.85Bb 3.61±0.04Bb 17.53±0.12Bb 4.89±0.14Bb
高剂量组
High-dose group		 188.59±1.78 311.55±5.78Aa 4.10±0.21Aa 17.65±0.06Aa 4.32±0.23Aa
对照组
Control group		 157.41±1.69 216.81±2.65Cd 1.98±0.08Cd 16.17±0.06Bb 8.12±0.37Dd
雌性Female 低剂量组
Low-dose group		 157.41±1.88 220.23±2.27Cc 2.11±0.09Cc 16.16±0.07Bb 7.68±0.30Cc
中剂量组
Middle-dose group		 157.52±2.36 232.00±1.80Bb 2.49±0.07Bb 16.21±0.04ABab 6.53±0.18Bb
高剂量组
High-dose group		 158.36±1.22 240.33±5.02Aa 2.73±0.18Aa 16.25±0.05Aa 5.97±0.40Aa

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表7同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 7.

与低剂量组相比,高剂量组的雌性、雄性大鼠末重、平均日增重、平均日采食量极显著升高(P<0.01),料重比极显著降低(P<0.01);中剂量组的雌性、雄性大鼠末重、平均日增重极显著升高(P<0.01),雌性大鼠料重比极显著降低(P<0.01),雄性大鼠料重比显著降低(P<0.05)。
与中剂量组相比,高剂量组的雄性大鼠末重、平均日增重、平均日采食量极显著升高(P<0.01),料重比极显著降低(P<0.01);高剂量组的雌性大鼠末重、平均日增重极显著升高(P<0.01),料重比极显著降低(P<0.01)。

2.2.3 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠血液生理指标的影响

由表4可见,中剂量组的雄性大鼠红细胞压积显著低于低剂量组(P>0.05)。各组之间大鼠的其他血液生理指标均无显著差异(P>0.05),且数值均在正常参考范围内。
表4 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠血液生理指标的影响

Table 4 Effects of poly β-carotene polymer on blood physiological indices of rats (n=10)

性别
Gender		 指标
Indices		 对照组
Control group		 低剂量组
Low-dose
group		 中剂量组
Middle-dose
group		 高剂量组
High-dose
group
白细胞WBC/(×109个/L) 7.79±0.84 7.70±0.69 7.83±0.75 7.59±0.87
淋巴细胞LYM/(×109个/L) 6.55±0.27 6.49±0.32 6.44±0.27 6.44±0.30
单核细胞Mon/(×109个/L) 0.28±0.06 0.30±0.07 0.29±0.07 0.31±0.07
中性粒细胞Gran/(×109个/L) 1.88±0.51 2.23±0.61 1.56±0.78 1.86±0.57
淋巴细胞百分比Lymph%/% 80.72±6.34 78.12±6.15 77.70±3.90 78.53±6.54
雄性Male 单核细胞百分比Mon%/% 2.68±0.49 2.76±0.59 3.20±0.60 3.00±0.55
中性粒细胞百分比Gran%/% 17.98±5.41 15.22±5.27 14.40±5.40 15.93±4.83
红细胞RBC/(×1012个/L) 6.47±0.59 6.59±0.52 6.67±0.61 6.65±0.54
血红蛋白HGB/(g/L) 130.52±6.36 130.79±4.19 129.85±6.63 129.02±6.27
红细胞压积HCT/% 42.19±2.34ab 41.13±3.41a 40.96±2.87b 40.84±1.87ab
平均红细胞体积MCV/fL 62.11±4.18 60.62±4.35 60.48±4.43 60.52±4.50
平均红细胞血红蛋白含量MCH/pg 19.25±2.32 20.00±1.60 20.38±1.40 19.27±2.30
平均红细胞血红蛋白浓度MCHC/g/L 317.40±12.48 318.87±14.80 319.83±14.14 316.85±10.71
红细胞分布宽度变异系数RDW/% 13.82±1.12 13.20±1.42 13.15±1.32 13.06±1.48
血小板数目PLT/(×109个/L) 284.60±55.21 286.30±39.12 290.00±48.16 291.00±25.63
平均血小板体积MPV/fL 5.04±0.65 5.11±0.99 4.90±0.62 5.15±0.59
白细胞WBC/(×109个/L) 7.78±1.13 7.90±0.93 7.65±1.16 7.41±0.90
淋巴细胞LYM/(×109个/L) 6.58±0.23 6.57±0.31 6.54±0.25 6.36±0.22
单核细胞Mon/(×109个/L) 0.31±0.05 0.32±0.05 0.31±0.07 0.30±0.04
中性粒细胞Gran/(×109个/L) 1.82±0.86 1.87±0.70 1.60±0.59 2.08±0.72
淋巴细胞百分比Lymph%/% 80.36±5.61 82.00±7.52 81.63±5.15 82.02±5.26
雌性Female 单核细胞百分比Mon%/% 2.94±0.46 2.99±0.63 3.14±0.40 3.07±0.70
中性粒细胞百分比Gran%/% 16.62±6.87 15.85±3.77 17.22±5.52 17.50±4.71
红细胞RBC/(×1012个/L) 6.20±0.51 6.24±0.49 6.32±0.44 6.32±0.31
血红蛋白HGB/(g/L) 133.31±4.79 127.88±6.86 128.91±6.01 127.89±4.89
红细胞压积HCT/% 40.13±2.29 42.23±3.08 41.38±3.84 41.15±3.02
平均红细胞体积MCV/fL 60.44±4.65 63.22±3.82 58.47±4.51 59.80±4.73
平均红细胞血红蛋白含量MCH/pg 19.84±1.61 19.39±1.72 18.48±1.47 20.40±1.55
平均红细胞血红蛋白浓度MCHC/g/L 322.56±11.70 320.95±13.16 319.54±14.19 315.10±11.68
红细胞分布宽度变异系数RDW/% 13.93±1.21 13.80±1.24 13.33±1.48 12.90±1.13
血小板数目PLT/(×109个/L) 249.00±37.08 284.30±29.75 262.50±33.93 272.60±55.97
平均血小板体积MPV/fL 5.01±0.83 5.18±0.74 5.00±0.78 4.84±0.79
平均红细胞血红蛋白浓度MCHC/g/L 322.56±11.70 320.95±13.16 319.54±14.19 315.10±11.68
红细胞分布宽度变异系数RDW/% 13.93±1.21 13.80±1.24 13.33±1.48 12.90±1.13
血小板数目PLT/(×109个/L) 249.00±37.08 284.30±29.75 262.50±33.93 272.60±55.97
平均血小板体积MPV/fL 5.01±0.83 5.18±0.74 5.00±0.78 4.84±0.79

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表5、表6同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5 and Table 6.

2.2.4 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠血清生化指标的影响

由表5可见,各组之间大鼠的血清生化指标均无显著差异(P>0.05),且数值均在正常参考范围内。
表5 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠血清生化指标的影响

Table 5 Effects of poly β-carotene polymer on serum biochemical indices of rats (n=10)

性别
Gender		 指标
Indices		 对照组
Control group		 低剂量组
Low-dose
group		 中剂量组
Medium-dose
group		 高剂量组
High-dose
group
总蛋白TP/(g/L) 65.55±2.12 64.92±1.52 64.92±1.51 64.54±1.89
白蛋白ALB/(g/L) 32.54±1.00 32.41±0.96 32.68±0.95 32.85±0.89
球蛋白GLB/(g/L) 33.01±2.41 32.50±1.91 32.23±1.61 31.69±2.09
白球比A/G 0.99±0.09 1.00±0.08 1.02±0.06 1.04±0.08
雄性Male 谷丙转氨酶ALT/(U/L) 55.31±2.57 57.10±1.83 55.50±2.62 56.01±2.68
谷草转氨酶AST/(U/L) 130.03±11.94 129.13±9.80 129.98±11.68 130.48±13.12
碱性磷酸酶ALP/(U/L) 89.85±6.31 92.69±4.51 91.48±5.94 90.65±7.40
总胆红素TBIL/(μmol/L) 20.41±3.09 21.70±3.55 21.81±2.64 21.47±2.65
总胆固醇TC/(mmol/L) 2.13±0.63 2.13±0.70 2.22±0.76 1.98±0.55
葡萄糖GLU/(mmol/L) 12.28±0.97 11.97±0.85 12.03±1.31 11.94±1.00
肌酐CREA/(μmol/L) 37.08±3.29 36.77±2.58 36.17±4.96 38.49±0.70
尿素UREA/(mmol/L) 5.52±0.97 5.37±0.80 5.56±0.78 5.30±0.85
尿素氮UN/(mmol/L) 15.47±2.71 15.05±2.24 15.56±2.18 14.85±2.37
总蛋白TP/(g/L) 70.85±3.67 73.23±4.95 73.24±2.92 74.50±4.44
白蛋白ALB/(g/L) 32.42±0.96 32.51±1.02 32.56±0.76 32.27±0.94
球蛋白GLB/(g/L) 38.43±3.87 40.71±4.96 40.68±2.93 42.23±4.35
雌性Female 白球比A/G 0.85±0.10 0.81±0.11 0.80±0.06 0.77±0.10
谷丙转氨酶ALT/(U/L) 56.46±2.68 55.21±2.19 57.15±2.89 55.48±2.84
谷草转氨酶AST/(U/L) 126.66±10.61 128.74±11.05 136.96±9.14 133.38±12.5
碱性磷酸酶ALP/(U/L) 92.12±5.77 93.50±5.58 89.93±3.64 88.31±6.31
总胆红素TBIL/(μmol/L) 19.85±3.44 20.35±3.45 21.25±3.29 22.21±3.14
总胆固醇TC/(mmol/L) 1.99±0.43 2.35±0.71 2.27±0.78 2.48±0.72
葡萄糖GLU/(mmol/L) 12.08±0.80 11.95±1.17 11.78±1.23 12.05±1.31
肌酐CREA/(μmol/L) 37.08±3.29 36.77±2.58 36.17±4.96 38.49±3.70
尿素UREA/(mmol/L) 5.78±0.87 5.68±0.92 5.47±0.86 5.79±0.93
尿素氮UN/(mmol/L) 16.20±2.44 15.91±2.57 15.31±2.41 16.21±2.61

2.2.5 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠脏器重和脏器指数的影响

由表6可见,中、高剂量组的雌性大鼠肾脏指数显著低于对照组和低剂量组(P<0.05)。各组之间大鼠的脏器重和其他脏器指数均无显著差异(P>0.05)。
表6 聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠脏器重和脏器指数的影响

Table 6 Effects of poly β-carotene polymer on organ weights and organ indices of rats (n=10)

性别
Gender		 指标
Indices		 对照组
Control group		 低剂量组
Low-dose
group		 中剂量组
Middle-dose
group		 高剂量组
High-dose
group
心脏重Heart weight/g 1.01±0.10 1.05±0.10 1.04±0.09 1.09±0.09
心脏指数Heart index/(g/kg) 3.61±0.33 3.68±0.33 3.54±0.30 3.50±0.33
肝脏重Liver weight/g 9.72±0.52 10.51±0.80 10.35±0.96 10.44±1.04
肝脏指数Liver index/(g/kg) 8.52±1.35 8.82±1.19 8.43±1.22 8.41±0.52
雄性Male 脾脏重Spleen weight/g 0.72±0.07 0.76±0.08 0.76±0.11 0.76±0.09
脾脏指数Spleen index/(g/kg) 2.60±0.23 2.67±0.29 2.59±0.38 2.43±0.30
肾脏重kidney weight/g 2.41±0.21 2.38±0.10 2.48±0.17 2.37±0.21
肾脏指数Kidney index/(g/kg) 8.66±0.75 8.36±0.34 8.41±0.61 8.25±0.29
肺脏重Lungs weight/g 2.37±0.35 2.52±0.34 2.48±0.36 2.62±0.17
肺脏指数Lungs index/(g/kg) 8.52±1.35 8.82±1.19 8.43±1.22 8.41±0.52
心脏重Heart weight/g 1.03±0.10 1.03±0.11 1.07±0.06 1.08±0.11
心脏指数Heart index/(g/kg) 4.76±0.47 4.68±0.49 4.61±0.26 4.50±0.43
肝脏重Liver weight/g 7.81±0.51 7.80±0.49 7.98±0.49 7.71±0.49
肝脏指数Liver index/(g/kg) 9.12±1.44 8.94±1.31 8.22±1.04 8.62±1.50
雌性Female 脾脏重Spleen weight/g 0.54±0.09 0.57±0.08 0.54±0.10 0.59±0.10
脾脏指数Spleen index/(g/kg) 2.48±0.39 2.62±0.33 2.32±0.41 2.45±0.46
肾脏重kidney weight/g 2.02±0.07 2.01±0.07 2.00±0.05 2.03±0.03
肾脏指数Kidney index/(g/kg) 9.29±0.57a 9.36±0.58a 8.71±0.62b 8.68±0.39b
肺脏重Lungs weight/g 1.97±0.32 1.97±0.29 1.91±0.25 2.07±0.37
肺脏指数Lungs index/(g/kg) 9.12±1.44 8.94±1.31 8.22±1.04 8.62±1.50

2.2.6 病理组织学检查

各组大鼠主要脏器病理解剖图如图1所示,各组大鼠的主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织器官均无肉眼可见的病理性改变。病理组织学检查如图2所示,各组大鼠心肌纤维排列整齐,无变形坏死,心肌见也未见炎性细胞浸润等异常病理变化;各组大鼠肝脏中央静脉清晰,围绕中央静脉肝细胞呈放射状排列,肝细胞界限清晰,未发生变形和坏死;各组大鼠脾脏红髓白髓清晰可见,可见大量血窦,均未见细胞肿大和炎性浸润等现象;各组大鼠肺脏肺泡壁清晰可见,肺泡腔内无异物,也未见炎性渗出,结构清晰,未见明显异常变化;各组大鼠肾脏肾小管结构清晰可见,也可观察到致密斑,未见明显病理变化。这表明聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠各组织器官无毒性作用。
图1 大鼠主要脏器剖检病变

Fig.1 Dissected lesions of major organs in rats

图2 大鼠各组织石蜡切片HE染色

Fig.2 HE staining of paraffin sections of rat tissues (400×)

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

由表7可见,与阴性对照组相比,阳性对照组雄性、雌性小鼠的嗜多染红细胞微核率极显著增加(P<0.01);低、中、高剂量组雄性、雌性小鼠的嗜多染红细胞微核率均差异不显著(P>0.05)。这说明聚β-胡萝卜素聚合物对小鼠嗜多染红细胞微核率无显著影响,且各剂量组和对照组嗜多染红细胞/红细胞比值均在0.6~1.2,表明聚β-胡萝卜素聚合物没有抑制嗜多染红细胞的形成,试验结果为阴性。
表7 聚β-胡萝卜素聚合物对小鼠骨髓微核的影响

Table 7 Effects of poly β-carotene polymer on mouse bone marrow micronuclei (n=5)

性别
Gender		 组别
Groups		 嗜多染红细胞/红细胞比值
PCE/RBC ratio		 嗜多染红细胞微核率
PCE micronucleus rate/‰
阴性对照组Negative control group 1.13±0.02 2.40±0.89Bb
雄性Male 阳性对照组Positive control group 1.15±0.01 22.40±6.91Aa
低剂量组Low-dose group 1.13±0.02 2.00±1.00Bb
中剂量组Middle-dose group 1.14±0.02 1.80±1.09Bb
高剂量组High-dose group 1.14±0.02 1.80±0.83Bb
阴性对照组Negative control group 1.13±0.02 2.20±1.30Bb
雌性Female 阳性对照组Positive control group 1.13±0.02 21.00±2.54Aa
低剂量组Low-dose group 1.14±0.01 2.20±1.09Bb
中剂量组Middle-dose group 1.42±0.02 2.00±1.00Bb
高剂量组High-dose group 1.15±0.02 1.60±0.54Bb

3 讨论

急性毒性试验是评价药物毒性的基本方法,它可以基于试验数据来确定受试物的毒性大小及其作用的靶器官,其结果为后续的亚慢性毒性试验设计提供参考依据[6-7]。在急性毒性试验中,测得聚β-胡萝卜素聚合物的LD50为2 260 mg/kg BW,95%置信区间为2 067~2 470 mg/kg BW。中毒小鼠死亡时间均位于给药后12~24 h,根据小鼠死亡时间和死亡特征,推测高剂量的聚β-胡萝卜素聚合物可能对其胃肠道有损伤作用,后续试验可以进一步探究聚β-胡萝卜素聚合物影响胃肠道的作用机制。依据《兽药研究技术指导原则汇编》[4]急性毒性分级评价标准规定,聚β-胡萝卜素聚合物属低毒级别。畜禽养殖中聚β-胡萝卜素聚合物的建议添加剂量为5~30 mg/kg[8⇓⇓⇓-12],而本试验所测的LD50相当于推荐剂量的7万倍以上,因此在推荐的剂量范围内使用聚β-胡萝卜素聚合物是安全的。Burton等[13]采用急性毒性等级法,得出聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠的LD50>10 000 mg/kg BW,最大耐受量为5 000 mg/kg BW,中毒小鼠出现流涎、多尿、阴部湿润、活动减退和脱水等症状,对死亡小鼠剖检未发现异常。Burton等[13]得出的聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠的LD50与本试验结果不一致,这可能是因为原材料加工工艺的差异,聚β-胡萝卜素聚合物的成分可能不尽相同,这可能会导致不同的毒性评测结果。
亚慢性毒性试验是药物安全评价的主要内容之一。该试验是通过连续30 d或90 d给予动物受试物,并观察动物的不良反应和其他指标情况,以此来判断受试物的毒性大小以及潜在的作用靶器官。判定指标包括受试动物采食量和体重的变化、生理生化指标变化以及脏器指数和组织病理学变化等[14⇓-16]。在亚慢性毒性试验中,各剂量组的大鼠均未观察到精神状况、大小便和饮食等评测指标有任何异常现象,各剂量组的大鼠均无中毒和死亡的情况,这与Burton等[13]研究结果一致。试验动物体重变化是反映动物机体中毒毒性的最基本指标[17]。Riley等[9]研究发现,饲粮中添加2 mg/kg的聚β-胡萝卜素聚合物,肉鸡的日采食量、平均日增重、饲料转化率以及体重显著升高。Kang等[18]研究发现,在肉鸡坏死性肠炎模型中,添加2、4、6 mg/kg的聚β-胡萝卜素聚合物,肉鸡的平均日增重显著升高,并可以减少肠道产气荚膜梭菌的数量,改善坏死性肠炎的病变,提示聚β-胡萝卜素聚合物还可以作为抗生素生长促进剂的替代品。本试验结果与上述研究结果一致,这表明聚β-胡萝卜素聚合物无明显毒性作用,且能显著提高大鼠的生长性能。有研究表明,聚β-胡萝卜素聚合物中存在的几种风味剂,这些风味剂对大鼠的食欲、食物摄取和肠道营养吸收功能产生了积极作用,从而提高了大鼠平均日采食量和平均日增重。
血液指标可以反映动物机体对营养物质的消化吸收以及营养代谢和机体的健康状态,通过检测机体血液生理和血清生化指标是否变化,可以更加准确评估受试物的毒性[19-20],本试验结果显示,低、中、高剂量组以及对照组的大鼠血液生理指标、血清生化指标均在正常范围之内,除了中剂量组雄性大鼠血液红细胞压积显著低于低剂量组外,各组之间其他指标均无显著差异。尽管中剂量组的雄性大鼠血液红细胞压积低于低剂量组,但其数值仍然处于正常范围内[21],同时,中剂量组的红细胞计数和血红蛋白含量也没有异常,综合考虑其他各项指标,中剂量组红细胞压积的降低可能并不具有实际意义,其变化情况也需要进一步的研究。上述结果表明聚β-胡萝卜素聚合物对大鼠血液生理指标和血清生化指标无不良影响。
脏器指数作为评估受试物毒性的一个常用指标,在一定程度上可以反映药物对动物内脏器官产生影响的程度[22]。在本试验中,中剂量组和高剂量组雌鼠肾脏指数相较于对照组显著降低,综合血清生化肾功能指标和肾脏组织病理学检查,推测可能是因为中、高剂量组雌鼠平均日增重高于对照组,但器官发育程度各组之间无差异,所以造成肾脏的脏器指数偏低。因此,聚β-胡萝卜素聚合物对肾脏无毒性作用,但聚β-胡萝卜素聚合物降低大鼠肾脏指数的机制还需要进一步研究。病理组织学检查可以更加直观地反映药物对组织器官的毒性损伤作用[23]。本试验对大鼠的主要器官组织进行组织形态学观察,未见到坏死、炎症等病理学变化,进一步证明了聚β-胡萝卜素聚合物无亚慢性毒性且具有较高的安全性。
小鼠骨髓微核试验通过检测小鼠骨髓细胞中嗜多染红细胞中的微核出现率来判断受试物是否具有致突变作用[24⇓-26]。Burton等[27]研究报道,最大剂量1 800 mg/kg的聚β-胡萝卜素聚合物不会诱发小鼠骨髓细胞微核的形成。与上述报道结果相似,本试验结果显示,与阴性对照组相比,阳性对照组小鼠嗜多染红细胞微核率极显著增加,各剂量组的嗜多染红细胞微核率无显著差异,嗜多染红细胞/红细胞比值在正常范围内[28],以上结果表明,聚β-胡萝卜素聚合物对嗜多染红细胞的形成无抑制作用。

4 结论

① 急性毒性试验结果表明,聚β-胡萝卜素聚合物的LD50为2 260 mg/kg BW,为推荐剂量的7万倍,属低毒级别,在推荐剂量范围内使用安全。
② 亚慢性毒性试验结果表明,聚β-胡萝卜素聚合物可提高大鼠的平均日采食和平均日增重,降低料重比,对大鼠生长性能具有积极的促进作用;对体征、血液指标和脏器指数无显著影响,大体解剖及组织学观察无异常,在推荐剂量范围内对动物机体无任何不良反应。
③ 小鼠骨髓微核试验结果为阴性,证明聚β-胡萝卜素聚合物无致突变性。
④ 综上所述,聚β-胡萝卜素聚合物安全性较高,毒副作用较小,可作为绿色饲料添加剂在畜禽养殖中应用。

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