动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 6072 - 6082

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.515

研究论文

美洲大蠊抗菌肽的提取及其对不同致病菌抑菌活性的影响

  • 柳婷婷 ,
  • 王政力 ,
  • 闫佳许 ,
  • 马艳 ,
  • 朱建军 ,
  • 申红 , *
展开
  • 石河子大学动物科技学院,石河子 832061
* 申 红,教授,博士生导师,E-mail:

柳婷婷(2000—),女,河南南阳人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Office editor: 武海龙

收稿日期: 2024-03-04

  网络出版日期: 2024-09-08

基金资助

国家自然科学基金(31660703)

收起

Extraction of Antimicrobial Peptides from Periplaneta americana and Their Effects on Antibacterial Activity of Different Pathogenic Bacteria

  • LIU Tingting ,
  • WANG Zhengli ,
  • YAN Jiaxu ,
  • MA Yan ,
  • ZHU Jianjun ,
  • SHEN Hong , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832061, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-03-04

  Online published: 2024-09-08

Fold

摘要

本试验旨在探究美洲大蠊抗菌肽的最佳提取时间及其对不同致病菌抑菌活性的影响。选取100只5龄美洲大蠊,随机分为2组,每组5个重复,每个重复10只。试验以大肠杆菌为诱导源诱导美洲大蠊产生抗菌肽,诱导组注射1 μL 1×108 CFU/kg的大肠杆菌,对照组注射1 μL的生理盐水,分别在诱导后12、24、36、48、60和72 h提取美洲大蠊抗菌肽。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验确定美洲大蠊抗菌肽的分子质量,通过BCA试剂盒测定美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度,通过药敏片法测定美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌活性,同时测定其最小抑菌浓度(MIC)、热稳定性、pH稳定性和反复冻融稳定性。结果表明:1)美洲大蠊抗菌肽的分子质量在7.5 ku左右。诱导后12、24、36、48、60、72 h,诱导组美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度极显著高于对照组(P<0.01),诱导后48 h时美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度最高,因此选择48 h时诱导产生的美洲大蠊抗菌肽进行后续的抑菌试验。2)与对照组相比,诱导组的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径极显著升高(P<0.01)。美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1.0 mg/L,对沙门氏菌的最小抑菌浓度为3.0 mg/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.5 mg/L。3)与对照组相比,经75、85、95、100 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌直径显著降低(P<0.05),冻融2、4、6、8、10次的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05),pH为1、3、7、9、11溶液处理后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05)。综上所述,大肠杆菌诱导后48 h为美洲大蠊抗菌肽的最佳提取时间,同时具备浓度高、热稳定性强和耐酸碱等特性。

关键词： 美洲大蠊抗菌肽; 抑菌活性; 大肠杆菌; 沙门氏菌; 金黄色葡萄球菌

本文引用格式

柳婷婷 , 王政力 , 闫佳许 , 马艳 , 朱建军 , 申红 . 美洲大蠊抗菌肽的提取及其对不同致病菌抑菌活性的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(9) : 6072 -6082 . DOI: 10.12418/CJAN2024.515

Abstract

This experiment was conducted to explore the optimal extraction time of antimicrobial Peptides from Periplaneta americana and their effects on antibacterial activity of different pathogenic bacteria. A total of 100 Periplaneta americana were randomly divided into 2 groups with 5 replicates per group and 10 Periplaneta americana per replicate. The experiment used Escherichia coli as the inducer to induce the production of antimicrobial peptides from Periplaneta americana, the induction group was injected with 1 μL 1×108 CFU/kg Escherichia coli, while the control group was injected with 1 μL physiological saline, the antimicrobial peptides from Periplaneta americana were extracted at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h after induction, respectively. The molecular weight of antimicrobial peptides from Periplaneta americana was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) test, the protein concentration of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana was determined by BCA kit, the antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana was determined by the drug sensitive tablet method, and the minimum inhibitory concentration (MIC), thermal stability, pH stability and repeated freeze-thaw stability were also determined. The results showed as follows: 1) the molecular weight of the antimicrobial peptides from Periplaneta americana was about 7.5 ku. After induction at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h, the protein concentration of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana of induction group was significantly higher than that of the control group (P<0.01), the protein concentration of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana after induction at 48 h was the highest, therefore, selected the antimicrobial peptides from Periplaneta americana after induction at 48 h for the subsequent antibacterial tests. 2) Compared with the control group, the diameter of antibacterial circle of Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureus of induction group was significantly increased (P<0.01). The antimicrobial peptides from Periplaneta americana minimum inhibitory concentration against Escherichia coli was 1.0 mg/L, the minimum inhibitory concentration against Salmonella was 3.0 mg/L, and the minimum inhibitory concentration against Staphylococcus aureus was 2.5 mg/L. 3) Compared with the control group, the diameter of antibacterial circle of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana after heating in water baths at 75, 85, 95 and 100 ℃ was significantly decreased (P<0.05), the diameter of antibacterial circle of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana after freeze-thaw 2, 4, 6, 8 and 10 times was significantly decreased (P<0.05), and the diameter of antibacterial circle of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana after treatment with solutions with pH of 1, 3, 7, 9 and 11 was significantly decreased (P<0.05). In conclusion, the 48 h after Escherichia coli induction is the optimal extraction time for antimicrobial peptides from Periplaneta americana, which has the characteristics of high concentration, strong thermal stability and acid and alkali resistance.

Key words： antimicrobial peptides from Periplaneta americana; antibacterial activity; Escherichia coli; Salmonella; Staphylococcus aureus

在现代家禽养殖业中,细菌性疾病严重影响禽类的健康成长及产业经济效益[1]。由于急性败血症、关节炎、雏鸡脐炎、输卵管炎等多种疾病的频发以及由此导致的雏鸡和中雏死亡率增加,使得家禽业的健康发展受到严重制约[2]。尽管传统上使用抗生素可以有效抑制这些细菌感染,但长期滥用抗生素已引发了全球范围内的细菌耐药性问题[3],致使我国已全面禁止抗生素在饲料中的添加和使用[4]。因此,研发新型、安全、高效的抗生素替代品成为重要课题[5]。抗菌肽作为一种天然存在于生物体内的免疫活性物质,因其广谱抗菌、低耐药性、无药物残留等优势,成为了替代抗生素的理想候选[6]。昆虫抗菌肽是一类由昆虫产生的小分子蛋白质,它们是昆虫先天免疫系统的重要组成部分,在对抗病原微生物如细菌、真菌、病毒等入侵时起到关键作用[7]。这些抗菌肽是在昆虫受到感染或者外部刺激后,通过特定的信号传导途径被诱导产生的[8]。昆虫抗菌肽的研究对于理解昆虫免疫机制以及开发新的抗生素替代品具有重要意义[9]。
美洲大蠊作为蜚蠊目蜚蠊科的一种古老昆虫,虽携带多种致病菌却能自我抵抗,体内富含多种活性物质,具有良好的抗菌特性及丰富的营养价值,是潜在的抗菌肽资源[10]。研究表明,美洲大蠊体内能产生1种或多种抗菌肽[11],这类抗菌肽具有显著的抗菌活性,不仅能够抑制甚至杀死多种细菌,如大肠杆菌,而且其抗菌作用机制可能涉及到直接破坏细菌细胞膜的结构[12]。此外,进一步的研究还发现,美洲大蠊抗菌肽可能具有更广泛的生物活性,包括但不限于抗癌活性,能够抑制癌细胞增殖,促进正常细胞修复,并增强正常细胞活性[13]。因此,本研究旨在以大肠杆菌为诱导源使美洲大蠊产生抗菌肽,并测定其对不同致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌)的抑菌效果,为其进一步在家禽业中作为饲料添加剂替代抗生素提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫

美洲大蠊由石河子大学农学院昆虫研究所提供,虫龄为5龄。饲养温度保持在28~30 ℃,相对湿度保持在65%~75%。

1.1.2 供试菌株

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌由石河子大学动物科技学院微生物实验室提供。

1.1.3 主要试剂

主要试剂有LB肉汤液体培养基(青岛海博生物有限公司)、LB肉汤固体培养基(青岛海博生物有限公司)、琼脂粉(上海生物工程有限公司)、乙酸铵缓冲溶液(上海生物工程有限公司)、苯甲基磺酰氟(上海生物工程有限公司)、疏基乙醇(上海生物工程有限公司)和环丙酰胺(上海生物工程有限公司)。

1.1.4 主要仪器

主要仪器有真空冷冻干燥机(美国Thermo Fisher公司)、分析天平(北京楚齐仪表责任有限公司)、超清台(美国Thermo Fisher公司)、紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)、酶标仪(美国Thermo Fisher公司)、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)、组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)、无菌离心管(上海生物工程有限公司)和微量移液枪(艾本德生物有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌制备

将已有的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌置于LB液体肉汤培养基中,37 ℃摇床培养12 h,收集细菌调至浓度为1×108 CFU/kg,用于后续试验。

1.2.2 美洲大蠊抗菌肽诱导及提取

选取100只5龄美洲大蠊,随机分为2组,每组5个重复,每个重复10只。诱导组以1×108 CFU/kg的大肠杆菌为诱导源,用微量注射器向美洲大蠊的背腹部注射1 μL的诱导源,对照组注射1 μL的生理盐水,适宜环境下饲养,分别在诱导后12、24、36、48、60、72 h后挑取活的虫体。
美洲大蠊抗菌肽提取方法参照本课题组朱小奇等[14]的方法并进行改进。按照分组将美洲大蠊处理干净后放入研钵中,按重量体积比为1∶3加入提取液(0.05 mol/L,pH=5的乙酸铵缓冲液,35 μg/mL苯甲基磺酰氟,2‰巯基乙醇),匀浆液在高速冷冻离心机8 049×g离心30 min,重复3次合并上清液,100 ℃水浴5 min,1 288×g离心30 min,去除变性蛋白,取上清液装入超滤离心管浓缩,截留分子质量在3.5 ku的浓缩液于-20 ℃保存。

1.2.3 美洲大蠊抗菌肽蛋白浓度测定

使用BCA试剂盒测定美洲大蠊抗菌肽蛋白浓度,按试剂盒说明书稀释标准液和配制BCA工作液。按照加样顺序在96孔板中加牛血清白蛋白(BSA)蛋白标样以及适当稀释的BSA蛋白样品(20 μL),BSA蛋白标准样需要用磷酸盐缓冲液稀释液补足到20 μL;每孔加BCA工作液200 μL,振荡混匀后在37 ℃培养箱中静置30 min,之后用酶标仪测量吸光度值(波长设为562 nm),每个样品反复测3次,以标准蛋白浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线(图1),并计算待测样品蛋白浓度。
图1 标准曲线

Fig.1 Standard curve

1.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定

采用不连续体系制备聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%,简要操作步骤为:0.5 mL菌液→2 124×g离心10 min收集菌体→弃上清→加40 μL TE缓冲液菌体悬浮→加40 μL 2×蛋白样品缓冲液,混匀→100 ℃水浴煮沸10 min→冷却后取30 μL上样→电泳4 h(浓缩胶90 V 1.5 h,分离胶120 V 3 h)→倒出电泳缓冲液,用水冲洗电泳槽→小心撬开玻璃,剥胶→用考马斯亮蓝R250染色1 h→加约200 mL脱色液脱色过夜→弃去脱色液,用水冲洗凝胶并用Image MasterVDS系统扫描拍照。

1.2.5 美洲大蠊抗菌肽抑菌活性测定(滤纸片扩散法)

取30 μL的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,均匀涂布在LB固体培养基上。将直径为6 mm的滤纸片高压灭菌后,放入装有不同时间段提取的美洲大蠊抗菌肽和抗生素(20 μg/mL)的无菌烧杯中浸泡5 min,用无菌镊子取出,在超清台中放置5 min,制成药敏片。在涂好大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的LB固体培养基中分别放入不同时间提取的美洲大蠊抗菌肽和抗生素制成的药敏片,二者中心距离不低于23 mm,纸片距培养皿内缘距离不小于15 mm,在37 ℃培养箱中培养18~24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径的大小,重复试验3次并记录数据。抑菌圈直径=0 mm为不抑菌,0~15 mm为低度抑菌,15~19 mm为中度抑菌,≥19 mm为高度抑菌。

1.2.6 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定

采用微量肉汤稀释法测定美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度。将浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌和金葡萄球菌经MH肉汤(Mueller-Hinton broth)培养基、7.5% NaCl肉汤培养基1∶1 000稀释后,向每孔加入100 μL。美洲大蠊抗菌肽提取液和环丙沙星分别按照0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/L的浓度添加到无菌的96孔板中,每孔加10 μL。封好后将96孔板于37 ℃培养12~24 h,观察结果。

1.2.7 美洲大蠊抗菌肽热稳定性测定

将美洲大蠊抗菌肽提取液分别在55、65、75、85、95和100 ℃水浴10 min后,以高速冷冻离心机(8 049×g,4 ℃)离心15 min,收集上清液,测定对大肠杆菌的抑菌效果,每个处理重复测定3次。以未经水浴的样品作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。

1.2.8 美洲大蠊抗菌肽反复冻融性测定

将冻存在-20 ℃的美洲大蠊抗菌肽提取液分别反复冻融1、2、4、6、8和10次,高速冷冻离心机(8 049×g,4 ℃)离心15 min。收集上清液,测定上清液对大肠杆菌的抑菌效果,每个处理重复测定3次。以未经处理的美洲大蠊抗菌肽提取液作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。

1.2.9 不同pH对美洲大蠊抗菌肽活性的影响

配制pH分别为1、3、5、7、9和11的磷酸盐缓冲溶液,按体积比1∶1将不同pH溶液与美洲大蠊抗菌肽提取液混匀,室温静置1 h后检测其对大肠杆菌的抑菌效果,重复测定3次。以未经处理的美洲大蠊抗菌肽提取液作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。

1.3 数据分析

应用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析,Duncan氏多重比较法检验组间差异显著性,数据用“平均值±标准误”表示,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE结果

如图2所示,与对照组相比,大肠杆菌诱导组的美洲大蠊抗菌肽提取液增加了1条分子质量在7.5 ku左右的蛋白条带。
图2 美洲大蠊抗菌肽提取液SDS-PAGE结果

M:标准蛋白标记 standard protein marker;D:诱导组 induction group;C:对照组 control group。

Fig.2 SDS-PAGE results of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana

2.2 不同时间点美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度

如表1所示,诱导后12、24、36、48、60、72 h,诱导组美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度极显著高于对照组(P<0.01)。诱导后12~48 h,美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加而增加;诱导后60~72 h,美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加呈现下降趋势。美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度在诱导后48 h时最高,因此选择48 h时诱导产生的美洲大蠊抗菌肽进行后续的抑菌试验。
表1 不同时间美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度

Table 1 Protein concentration of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana at different timemg/mL

项目
Items		 时间Time/h
12 24 36 48 60 72
对照组Control group 0.987±0.010A 0.987±0.020A 0.984±0.025A 0.999±0.033A 1.023±0.026A 1.021±0.030A
诱导组Induction group 1.121±0.018B 1.313±0.050B 1.521±0.040B 1.673±0.036B 1.496±0.035B 1.323±0.034B

同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.3 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果

如表2所示,与对照组相比,诱导组的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径极显著升高(P<0.01)。诱导组的大肠杆菌的抑菌圈直径高达23 mm左右,显著高于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌(P<0.05),且金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著高于沙门氏菌(P<0.05)。对照组的大肠杆菌的抑菌圈直径显著高于沙门氏菌(P<0.05),但金黄色葡萄球菌与大肠杆菌、沙门氏菌之间的抑菌圈直径无显著差异(P>0.05)。
表2 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径

Table 2 Diameter of antibacterial circle of antimicrobial peptides from Periplaneta americana on Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureusmm

项目
Items		 抑菌圈直径Diameter of antibacterial circle
大肠杆菌
Escherichia coli		 沙门氏菌
Salmonella		 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
对照组Control group 17.85±0.40Aa 15.94±0.25Ab 16.86±0.39Aab
诱导组Induction group 23.86±1.39Bc 17.94±0.24Ba 18.87±0.29Bb

同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

如图3所示,诱导组的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径明显大于对照组。
图3 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果

从上到下,依次是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈,左边为对照组,右边为诱导组。

Fig.3 Antibacterial effects of antimicrobial peptides from Periplaneta americana on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella

From top to bottom, the inhibition circles of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella were shown successively, the control group on the left and the induction group on the right.

2.4 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度

如表3所示,美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度1.0 mg/L,对沙门氏菌的最小抑菌浓度为3.0 mg/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.5 mg/L。
表3 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度

Table 3 Minimum inhibitory concentration of antimicrobial peptides from Periplaneta americana

美洲大蠊抗菌
肽浓度
Antimicrobial peptides
from Periplaneta
americana/(mg/L)		 大肠杆菌
Escherichia
coli		 沙门氏菌
Salmonella		 金葡萄球菌
Staphylococcus
aureus		 环丙沙星浓度
Ciprofloxacin
concentration/
(mg/L)		 大肠杆菌
Escherichia
coli		 沙门氏菌
Salmonella		 金葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
5.0 - - - 5.0 - - -
4.5 - - - 4.5 - - -
4.0 - - - 4.0 - - -
3.5 - - - 3.5 - - -
3.0 - + - 3.0 - - -
2.5 - + + 2.5 - + -
2.0 - ++ ++ 2.0 - + +
1.5 - ++ ++ 1.5 - ++ ++
1.0 + ++ ++ 1.0 - ++ ++
0.5 ++ ++ ++ 0.5 + ++ ++
0.0 ++ ++ ++ 0.0 ++ ++ ++

-:无细菌生长;++:细菌正常生长;+:只有少量细菌生长。

-: no bacterial growth; ++: bacteria normal growth; +: only a small number of bacteria grow.

2.5 美洲大蠊抗菌肽热稳定性

如表4所示,与对照组相比,经55、65 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径差异不显著(P>0.05),抑菌率分别为99.1%和96.3%;经75 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌直径显著降低(P<0.05),抑菌率在90%以上;经85、95、100 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌直径显著降低(P<0.05),自85 ℃起,随着温度的升高美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率逐渐降低,但仍然维持在68%以上。以上结果表明,经大肠杆菌诱导的美洲大蠊抗菌肽提取液具有较好的热稳定性。
表4 不同温度对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响

Table 4 Effects of different temperatures on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana

项目
Items		 抑菌圈直径
Diameter of antibacterial circle/mm		 抑菌率
Bacteriostasis rate/%
温度Temperature/℃
55 22.176±0.167a 99.1
65 21.759±0.113a 96.3
75 20.447±0.299b 90.5
85 19.968±0.726b 88.4
95 17.361±0.669c 76.8
100 15.554±0.712d 68.8
对照组Control group 22.485±0.040a 100.0

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.6 美洲大蠊抗菌肽反复冻融稳定性

如表5所示,与对照组相比,随着冻融次数的增加,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径出现不同程度地下降;冻融2、4、6、8、10次的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05)。在冻融次数6次以内时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率仍然维持在90%以上。以上结果表明,少次的反复冻融不会对美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌活性产生影响,但是随着冻融次数的增加,会降低美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌活性。
表5 不同冻融次数对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响

Table 5 Effects of different time of freezing and thawing on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana

项目
Items		 抑菌圈直径
Diameter of antibacterial circle/mm		 抑菌率
Bacteriostasis rate/%
冻融次数Times of freezing and thawing/次
1 22.369±0.269a 97.7
2 21.875±0.143b 95.6
4 21.659±0.090b 94.6
6 20.569±0.122c 90.3
8 19.952±0.073d 87.0
10 17.903±0.225e 78.2
对照组Control group 22.879±0.139a 100.0

2.7 美洲大蠊抗菌肽pH稳定性

如表6示,与对照组相比,经不同pH溶液处理后,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径出现不同程度地下降,pH为1、3、7、9、11溶液处理后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05)。经不同pH溶液处理后,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率仍然维持在60%以上;在pH为5、7时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率为90%以上;在pH为5时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率最高,达99.3%。以上结果表明,过酸或过碱的环境均不利于美洲大蠊抗菌肽提取液的稳定性。
表6 不同pH对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响

Table 6 Effects of different pH on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana

项目
Items		 抑菌圈直径
Diameter of antibacterial circle/mm		 抑菌率
Bacteriostasis rate/%
pH
1 9.683±0.246e 57.3
3 12.402±0.500b 73.3
5 16.715±0.770a 99.3
7 15.606±0.173c 92.3
9 13.483±0.289d 79.7
11 10.408±0.375e 61.5
对照组Control group 16.898±0.336a 100.0

3 讨论

昆虫的蛋白质资源丰富,粗蛋白质含量是畜禽的2~3倍,同时富含各种氨基酸,抗菌肽、溶菌蛋白、各类防御素等,具有抑制细菌繁殖、抗真菌和抗病毒等多种作用[15-16]。美洲大蠊体内蛋白质含量丰富,高达63.1%,与秘鲁鱼粉的粗蛋白质含量(62%)相近[17]。昆虫抗菌肽是指昆虫体内经诱导后产生的一种具有抗菌活性,且分子质量在2~7 ku的活性多肽[18]。本研究通过SDS-PAGE试验发现,经大肠杆菌诱导后的美洲大蠊抗菌肽出现了一条分子质量在7.5 ku左右的蛋白质条带。张雪等[19]研究表明,在鹌鹑的饲粮里添加浓度为23.19 mg/L蝇蛆抗菌肽可以观察到鹌鹑血液的免疫球蛋白含量显著升高,肠道内的优势菌群数量显著升高。何晓辉等[20]试验表明,经大肠杆菌诱导的黄粉虫幼虫会产生一种特别的物质,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等相关致病菌有抑制作用。抑菌活性受到蛋白浓度高低的直接影响[21]。本试验通过对不同时间段美洲大蠊抗菌肽提取液蛋白浓度的测定发现,在诱导后48 h之内美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加而升高,在48 h时达到最高,之后开始逐渐降低,这与前人研究的抗菌肽最佳的提取时间在诱导后48 h相符[22]。抑菌圈的大小代表着抑菌活性的高低[23]。朱小奇等[14]在研究黄粉虫抗菌肽的提取及其理化性质的结果表明,黄粉虫抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径在23 mm左右。阿琪玛[24]研究发现,厩螫蝇的抗菌蛋白提取液对大肠杆菌的抑菌直径为25.55 mm左右。本试验采用大肠杆菌诱导后48 h时产生的美洲大蠊抗菌肽来进行抑菌试验,结果表明对大肠杆菌的抑菌效果最好,抑菌圈的直径在23 mm左右。不同的方法和诱导源所产生的抗菌肽也不相同[25],同一抗菌肽或不同抗菌肽对同一种菌或不同菌的抑菌效果也不同[26]。在家禽业的生产过程中,除了大肠杆菌之外,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌也是引起家禽发病的主要致病菌[27]。本研究通过美洲大蠊抗菌肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性的测定,结果表明美洲大蠊抗菌肽对这2种致病菌也存在一定的抑菌效果。
从温度稳定性来看,美洲大蠊抗菌肽提取液在55~65 ℃保持良好的热稳定性,抑菌率超过90%,但在75 ℃及以上温度下,抑菌活性降低,但仍能维持一定的抑菌效果,特别是在85~100 ℃时,抑菌圈直径显著变小。另外,针对反复冻融稳定性的结果表明,美洲大蠊抗菌肽提取液经过多次冻融处理后,尽管抑菌圈直径有所下降,但在冻融次数6次以内仍能保持90%以上的抑菌率,暗示少量的冻融循环不影响其抑菌活性,但频繁冻融会影响其抑菌活性。在pH稳定性的结果表明,美洲大蠊抗菌肽提取液在中性偏酸环境(pH为3~5)中具有最佳抑菌活性,尤其在pH为5时抑菌率高达99.3%,而在极端酸性和碱性条件下抑菌活性减弱,但即使在较低抑菌率下,抑菌活性依然维持在60%以上,说明其在一定酸碱变化范围内具有一定稳定性。以上结果与大多数的研究结果相一致,张建新等[28]研究表明,黄粉虫抗菌肽在121 ℃加热25 min后,抑菌活性有所降低,但是仍然能保持基本的抑菌效果,显示黄粉虫抗菌肽具有较好的热稳定性。高诗琪等[29]在研究斗米虫抗菌肽生化特性的时候,发现斗米虫抗菌肽经不同温度水浴后,其抑菌活性仍然维持在一定的范围内,证明斗米虫抗菌肽具有较好的热稳定性;在不同的pH溶液处理后,显示过酸或过碱的环境都会影响斗米虫抗菌肽的抑菌活性;少次的反复冻融不会影响斗米虫抗菌肽的抑菌活性,但随着冻融次数的增加会逐渐降低。

4 结论

本试验在前人的研究基础上进行改进提取出了美洲大蠊抗菌肽,采用SDS-PAGE试验确定了美洲大蠊抗菌肽的分子质量在7.5 ku左右。通过对美洲大蠊抗菌肽提取液蛋白浓度和抑菌活性的测定,表明美洲大蠊抗菌肽的最佳提取时间在诱导后48 h,其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌效果,为美洲大蠊抗菌肽作为饲料添加剂在家禽业的应用奠定了基础。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
叶春燕, 李昌诚. 家禽各种血清型细菌的耐药性不断上升[J]. 广西畜牧兽医, 2023, 39(4):186.

YE C Y, LI C C. Drug resistance of various serotypes of poultry bacteria is on the rise[J]. Guangxi Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2019, 39(4):186. (in Chinese)

[2]
刘新亮, 李正波, 徐树江. 抗生素对家禽疾病防治的作用[J]. 农民致富之友, 2019(3):130.

LIU X L, LI Z B, XU S J. Effect of antibiotics on prevention and treatment of poultry diseases[J]. Friends of Farmers to get Rich, 2019(3):130. (in Chinese)

[3]
张腾飞, 罗青平, 汪宏才, 等. 中国家禽肠道细菌病流行及防控现状与分析[J]. 湖北畜牧兽医, 2014, 35(9):67-69,72.

ZHANG T F, LUO Q P, WANG H C, et al. Prevalence,prevention and control status and analysis of intestinal bacterial diseases in poultry in China[J]. Hubei Animal Husbandry and Veterinary Science, 2014, 35(9):67-69,72. (in Chinese)

[4]
纪金芝. 抗菌脂肽在断奶仔猪养殖中的应用[J]. 中国畜牧业, 2024(1):48-49.

JI J Z. Application of antimicrobial lipopeptids in feeding of weaned piglets[J]. China Animal Industry, 2024(1):48-49. (in Chinese)

[5]
宋雪莹, 高圣玥, 李静, 等. 抗菌肽种类、生物学功能及在畜禽生产中的应用[J]. 中国饲料, 2024(5):64-68.

SONG X Y, GAO S Y, LI J, et al. The types,biological function of antibacterial peptides and its application in livestock and poultry production[J]. China Feed, 2024(5):64-68. (in Chinese)

[6]
段旭彤, 李浩杨, 张嵘, 等. 昆虫抗菌肽的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报, 2023, 40(10):1401-1408.

DUAN X T, LI H Y, ZHANG R, et al. Progress of insect antimicrobial peptides[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2023, 40(10):1401-1408. (in Chinese)

[7]
崔会程, 夏嫱. 昆虫抗菌肽抗炎活性及基于信号通路抗炎机制的研究进展[J]. 天津医药, 2022, 50(9):1002-1008.

CUI H C, XIA Q. Research progress in anti-inflammatory activity of insect antimicrobial peptides and anti-inflammatory mechanism based on signal pathway[J]. Tianjin Medical Journal, 2022, 50(9):1002-1008. (in Chinese)

[8]
许晓燕. 昆虫抗菌肽免疫调控作用及机制研究进展[J]. 医学研究生学报, 2020, 33(7):771-776.

XU X Y. Progress in immunomodulatory effects and their mechanisms of insect antimicrobial peptides[J]. Journal of Medical Postgraduates, 2020, 33(7):771-776. (in Chinese)

[9]
王青, 陈俊, 李潇潇, 等. 黑水虻抗菌肽的研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2021, 33(11):1982-1989.

WANG Q, CHEN J, LI X X, et al. Research advances on antibacterial peptides from Hermetia illucens[J]. Natural Product Research and Development, 2021, 33(11):1982-1989. (in Chinese)

[10]
查伦贵, 顾庆慧, 吴明一, 等. 美洲大蠊油脂成分测定及抗氧化活性研究[J/OL]. 云南民族大学学报(自然科学版):1-7(2023-04-27)[2024-03-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/53.1192.N.20230427.1107.006.html.

ZHA L G, GU Q H, WU M Y, et al. Determination of oil composition and antioxidant activity of Periplaneta americana[J]. Journal of Yunnan Minzu University(Natural Sciences Edition):1-7(2023-04-27)[2024-03-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/53.1192.N.20230427.1107.006.html. (in Chinese)

[11]
何正春, 刘光明, 王晓雨, 等. 美洲大蠊神经肽的研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2008, 20(1):180-186.

HE Z C, LIU G M, WANG X Y, et al. Research advance on neuropeptides from Periplaneta americana[J]. Natural Product Research and Development, 2008, 20(1):180-186. (in Chinese)

[12]
顾牙焕, 陈荔, 赵成法, 等. 饲料中添加美洲大蠊粉对虹鳟幼鱼消化道组织学及微生物群落的影响[J]. 中国饲料, 2023(17):72-80.

GU Y H, CHEN L, ZHAO C F, et al. Effects of dietary supplementation of American cockroach Periplaneta americana meal on the gut histology and microflora of juvenile rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J]. China Feed, 2023(17):72-80. (in Chinese)

[13]
张文博, 高洁, 麻锦楠, 等. 美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化[J]. 生物技术, 2018, 28(1):24-29.

ZHANG W B, GAO J, MA J N, et al. Expression and purification of antimicrobial peptide AMPPA13 of Periplaneta americana[J]. Biotechnology, 2018, 28(1):24-29. (in Chinese)

[14]
朱小奇, 赵肖, 武玉飞, 等. 大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽的提取及抑菌活性的测定[J]. 石河子大学学报(自然科学版), 2014, 32(4):444-448.

ZHU X Q, ZHAO X, WU Y F, et al. The extraction of antimicrobial peptide of Tenebrio molitor induced by E.coli and the determination of its antibacterial activity[J]. Journal of Shihezi University (Natural Science), 2014, 32(4):444-448. (in Chinese)

[15]
王立新, 王姗姗, 戴四发, 等. 黄粉虫不同生长阶段诱导抗菌肽的效果分析[J]. 中国农学通报, 2009, 25(5):10-13.

WANG L X, WANG S S, DAI S F, et al. Analysis on antibacterial activity and antibacterial peptide of different growth stages from Tenebrio molitor[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(5):10-13. (in Chinese)

[16]
檀晓萌, 陈辉, 黄仁录, 等. 昆虫蛋白质饲料的开发研究进展[J]. 饲料博览, 2015(3):32-34.

TAN X M, CHEN H, HUANG R L, et al. Research progress of the insect protein feed development[J]. Feed Review, 2015(3):32-34. (in Chinese)

[17]
王韫, 李芳, 熊东艳, 等. 美洲大蠊饲用安全性和饲喂效果研究[J]. 中国饲料, 2022(20):116-119.

WANG Y, LI F, XIONG D Y, et al. Study on feeding safety and effects of Periplaneta americana L.[J]. China Feed, 2022(20):116-119. (in Chinese)

[18]
赵梓含, 张爱忠, 潘春媛, 等. 昆虫抗菌肽及其活性机制[J]. 动物营养学报, 2021, 33(12):6641-6647.

DOI

ZHAO Z H, ZHANG A Z, PAN C Y, et al. Insect antimicrobial peptides and their bioactive mechanism[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(12):6641-6647. (in Chinese)

[19]
张雪, 高盛杰, 罗姝妍, 等. 蝇蛆抗菌肽对鹌鹑血液免疫指标、肠道菌群和免疫器官指数的影响[J]. 饲料研究, 2021, 44(12):46-50.

ZHANG X, GAO S J, LUO S Y, et al. Effect of maggot antibacterial peptides on blood immunity indexes,intestinal flora and immune organ indexes of quails[J]. Feed Research, 2021, 44(12):46-50. (in Chinese)

[20]
何晓辉, 王立霞, 方琴, 等. 黄粉虫抗菌肽对耐药粪肠球菌抑菌效果的研究[J]. 新疆农业科学, 2016, 53(2):317-323.

HE X H, WANG L X, FANG Q, et al. Study of the effects of Tenebrio molitor antimicrobial peptides acting on resistant enterococcus faecalis antibacterial[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2016, 53(2):317-323. (in Chinese)

[21]
张钰, 马曦, 赵金标, 等. 地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(7):2812-2819.

DOI

ZHANG Y, MA X, ZHAO J B, et al. Optimization of fermentation conditions and determination of antibacterial activity of Bacillus licheniformis[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2022, 49(7):2812-2819. (in Chinese)

[22]
胡漂琪, 张飞骏, 陈杏洲, 等. 黑水虻抗菌肽的诱导及抑菌活性研究[J]. 饲料研究, 2022, 45(12):67-71.

HU P Q, ZHANG F J, CHEN X Z, et al. Hermetia illucens antimicrobial peptides induced conditions optimization and research of crude extracts activity[J]. Feed Research, 2022, 45(12):67-71. (in Chinese)

[23]
王瑞, 刘涛, 闫明. 不同工艺下姜茎提取物的抑菌效果分析[J]. 畜禽业, 2023, 34(11):12-16.

WANG R, LIU T, YAN M. Analysis of the bacteriostatic effect of ginger stem extract under different processes[J]. Livestock and Poultry Industry, 2023, 34(11):12-16. (in Chinese)

[24]
阿琪玛. 厩螫蝇抗菌蛋白提取液对致病性大肠杆菌的抑菌作用机制研究[D]. 博士学位论文. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2017.

A Q M. Study on the mechanism of antibacterial activity of stings fly antibacterial protein extract against pathogenic Escherichia coli[D]. Ph.D.Thesis. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[25]
李晓, 潘道东, 王璇, 等. 竹叶黄酮对大肠杆菌抑菌能力及抑菌机理的研究[J]. 中国食品添加剂, 2023, 34(12):197-204.

LI X, PAN D D, WANG X, et al. Study on the antibacterial activity and mechanism of bamboo leaf flavonoids on E.coli[J]. China Food Additives, 2023, 34(12):197-204. (in Chinese)

[26]
张琦, 王凤扬, 鄢梦, 等. 山苍子蛋白抗菌肽的抑菌特性及稳定性研究[J]. 中国测试, 2019, 49(8):81-86.

ZHANG Q, WANG F Y, YAN M, et al. Study on antibacterial properties and stability of antibacterial peptides from litsea cubeba protein[J]. China Measurement & Testing Technology, 2019, 49(8):81-86. (in Chinese)

[27]
江海凤. 家禽养殖常见疾病的发病原因与预防措施[J]. 养殖与饲料, 2022, 21(8):118-120.

JIANG H F. Pathogenic causes and preventive measures of common diseases in poultry breeding[J]. Animals Breeding and Feed, 2022, 21(8):118-120. (in Chinese)

[28]
张建新, 孙长江. 黄粉虫抗菌肽的分离纯化及生物活性研究[J]. 现代食品科技, 2016, 32(1):116-121.

ZHANG J X, SUN C J. Separation,purification and biological activity evaluation of antimicrobial peptides from Tenebrio molitor[J]. Modern Food Science & Technology, 2016, 32(1):116-121. (in Chinese)

[29]
高诗琪, 周卫青, 苏兰, 等. 斗米虫抗菌肽粗提液抑菌活性及其生化特性研究[J]. 动物营养学报, 2023, 35(1):673-680.

DOI

GAO S Q, ZHOU W Q, SU L, et al. Antibacterial activity and biochemical properties of antimicrobial peptide crude extract from Apriona swainsoni larvae[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023, 35(1):673-680. (in Chinese)

Options
文章导航

/

〈 〉

    联系我们

  • 地址：北京市海淀区圆明园西路2号
    　　　中国农业大学动科动医大楼153室
  • 邮编：100193
  • 电话：010－62817823
  • 网址：http://www.chinajan.com
  • E-mail：cjan@chinajan.com
京公网安备 11010802041926号    京ICP备17050989号-2