动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 6083 - 6094

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.516

研究论文

一株羊源巨大芽孢杆菌BM24的分离鉴定及安全性评价

  • 贾盛 , 1 ,
  • 候萌 1 ,
  • 陈伟丽 2 ,
  • 戴宗茂 1 ,
  • 彭啟敏 1 ,
  • 石蕊 1 ,
  • 王旭翔 1 ,
  • 谢怀茹 1 ,
  • 肖莹 1 ,
  • 王金泉 , 1, *
展开
  • 1 新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052
  • 2 乌鲁木齐县农产品质量安全检测中心,乌鲁木齐 830036
* 王金泉,教授,博士生导师,E-mail:

贾 盛(1997—),男,山西临汾人,硕士研究生,研究方向为动物生长发育调控及保健。E-mail:

Office editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-03-15

  网络出版日期: 2024-09-08

基金资助

国家自然科学基金项目(32160823)

新疆农业大学校级研究生科研创新项目(XJAUGRI2023033)

收起

Isolation, Identification and Safety Evaluation of a Sheep-Derived Bacillus megaterium BM24

  • JIA Sheng , 1 ,
  • HOU Meng 1 ,
  • CHEN Weili 2 ,
  • DAI Zongmao 1 ,
  • PENG Qimin 1 ,
  • SHI Rui 1 ,
  • WANG Xuxiang 1 ,
  • XIE Huairu 1 ,
  • XIAO Ying 1 ,
  • WANG Jinquan , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
  • 2 Urumqi County Agricultural Products Quality and Safety Testing Centre, Urumqi 830036, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-03-15

  Online published: 2024-09-08

Fold

摘要

本试验旨在评估一株从健康细毛羊粪便中分离得到的巨大芽孢杆菌BM24的体外益生潜力及体内安全性。采集饲养过程中没有添加抗生素的健康新疆细毛羊的新鲜粪便,先通过形态学鉴定、生化鉴定、16S rRNA测序,初步获得羊源芽孢杆菌菌株,后续通过对酸和高浓度胆盐环境的耐受性,以及菌株的体外抗菌能力、耐药性、溶血活性和生长曲线等方面的检测,初步判断分离出的芽孢杆菌菌株的体外安全性,最后进行小鼠体内试验,评估其安全性。结果表明:1)初步分离得到1株羊源芽孢杆菌,结合生化鉴定和测序结果确定为巨大芽孢杆菌,将其命名为巨大芽孢杆菌BM24;2)该菌株可在pH=1.0条件下存活,0.3%胆盐培养4 h后存活率为49%,在15种常见抗生素中对12种抗生素高度敏感,对常见腹泻致病菌沙门氏菌和大肠杆菌抑制效果较好,无溶血活性;3)该菌株在37 ℃培养2 h后进入生长对数期,6 h后进入生长平稳期;4)灌胃该菌株后小鼠无死亡、体重变化正常,剖检体腔脏器无眼观病理现象,对肝脏、肾脏、脾脏指数及血细胞指标均无显著影响(P>0.05);腹腔注射该菌株,小鼠体征正常、无死亡现象,体腔脏器无眼观病理变化。综上可知,本试验分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24具有良好的体外益生潜力,且无急性毒性作用,可作为羊源益生菌的候选菌株。

关键词： 巨大芽孢杆菌; 益生菌; 细毛羊; 分离鉴定; 安全性

本文引用格式

贾盛 , 候萌 , 陈伟丽 , 戴宗茂 , 彭啟敏 , 石蕊 , 王旭翔 , 谢怀茹 , 肖莹 , 王金泉 . 一株羊源巨大芽孢杆菌BM24的分离鉴定及安全性评价[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(9) : 6083 -6094 . DOI: 10.12418/CJAN2024.516

Abstract

The aim of this study was to evaluate the in vitro probiotic potential and in vivo safety of a strain of Bacillus megaterium BM24 isolated from the feces of healthy fine wool sheep. Collection of fresh faeces from healthy, antibiotic-free Xinjiang fine-haired sheep. The Bacillus strain was initially obtained by morphological identification, biochemical identification and 16S rRNA sequencing. Subsequently, through the detection of Bacillus-tolerance to the environments of acidic and high bile salt concentrations, in vitro antibacterial ability, drug resistance, hemolytic activity and growth curve of the strain, the isolated Bacillus strain was eventually judged to have in vitro safety. Finally, the safety of the isolated Bacillus strain was evaluated by in vivo test in mice. The results showed that: 1) a Bacillus strain was preliminarily isolated and named Bacillus megaterium BM24 according to the results of biochemical identification and 16S rRNA sequencing. 2) Bacillus megaterium BM24 could survive at pH=1.0, with a survival rate of 49% after 4 h of incubation with 0.3% bile salt. Bacillus megaterium BM24 was highly sensitive to 12 of 15 common antibiotics, had good inhibitory effect on common diarrhea pathogens Salmonella and Escherichia coli, and had no hemolytic activity. 3) The growth entered the logarithmic phase after 2 h at 37 ℃,after 6 h, the growth reached a plateau. 4) No death, normal body weight change, and no pathological changes in organs in the body cavity of mice when the Bacillus megaterium BM24 treated by gavage. There were no significant effects on the liver, kidney, spleen, organ indexes and blood cell indexes (P>0.05); no death, normal vital signs and no pathological changes in the organs in body cavity of mice at the Bacillus megaterium BM24 treated by intraperitoneal injection. In summary, the sheep-derived Bacillus megaterium BM24 isolated in this experiment has terrific in vitro probiotic potential without acute toxic effect, which can be used as a candidate strain of sheep probiotics.

Key words： Bacillus megaterium; probiotic; fine wool sheep; isolation and identification; safety

近年来,由于养殖业中抗生素的过度使用,导致耐药菌株增多、药物残留、污染环境、甚至危害人体健康等问题频发,2020年7月,我国开始全面禁止使用促进生长的抗生素作为饲料添加剂,因此开发绿色健康的饲料添加剂是大势所趋[1],已有研究证明益生菌可作为常规抗生素饲料添加剂的替代品,发挥调节动物的肠道微生态平衡、增强动物免疫功能、促进消化与吸收、提高动物的生产性能等有益作用[2]。
芽孢杆菌是一类能够在逆境下形成内生孢子以抵制不良环境的饲用益生菌,正是因为芽孢杆菌能够产生内生孢子的这一特性,使得其相较于其余几种常用益生菌更具优势,目前畜禽业饲料添加剂中广泛应用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等[3]。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)作为芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性杆菌,常见于土壤、植物表面和水底沉淀物中,具有解磷固氮、消除异味、净化水体、改善养殖环境、提高机体免疫力、改善动物生长性能等作用[4]。Yao等[5]研究发现,巨大芽孢杆菌可改善哺乳犊牛的生长性能,提高免疫功能及肠道氧化状态;贡笑笑等[6]研究发现,土壤来源的巨大芽孢杆菌1259制剂能够促进山羊瘤胃细菌丰度以及肠道中有益微生物的增殖,提高荷斯坦奶牛标准乳产量;饲料中添加60 mg/kg巨大芽孢杆菌1259可显著增加56日龄扬州鹅体重,缩短出栏时间,提高经济效益[7]。
研究显示,微生物的益生特性与宿主种属特异性有关,同一宿主来源的微生物更易于在该宿主肠道定植并表达其生物活性[8-9],并可改善宿主的生长性能与肠道健康[10]。目前,国内外尚未见羊源益生性巨大芽孢杆菌的相关报道。因此,本研究拟从成年健康新疆细毛羊粪便分离出具有拮抗病原菌、对抗生素敏感的潜在益生性芽孢杆菌,并评估其耐受性、溶血活性、体内安全性,目的是为羊源益生性芽孢杆菌的开发提供参考,也为羊用微生态制剂在新疆养羊业中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 粪便样品和试验动物

粪便样品来源于新疆农业大学动物医学学院试验基地饲养的成年雄性新疆细毛羊,饲粮为精饲料和苜蓿,自由饮水,并经兽医健康认定无抗生素使用史。无特定病原体(SPF)级雄性昆明小鼠,共20只,体重(26±2) g,购自新疆医科大学实验动物中心,自由采食和饮水。

1.1.2 主要试剂及供试菌株

LB肉汤及琼脂培养基、HBI芽孢杆菌生化鉴定条购自青岛海博生物技术有限公司;脱纤维绵羊血、牛胆盐购自北京索莱宝科技有限公司;细菌药敏纸片(批号:20172400206)为杭州滨和微生物试剂有限公司产品;牛源大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌菌株为新疆农业大学动物医学学院临床产科实验室保存菌株。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢杆菌分离

取新鲜粪便放入无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中,涡旋混匀,水浴锅80 ℃加热处理20 min,静置后取100 μL上清液接种于LB肉汤中,37 ℃下恒温培育18 h,梯度稀释,取10-4、10-5和10-6稀释度的菌液于LB琼脂平板上涂布,倒置培养。挑出不同形态的单菌落,接种纯化3代,直至平板上的菌落形状、大小、颜色一致,采用革兰氏染色与芽孢染色法观察形态,镜检筛选出形态呈杆状且有内生孢子的菌株,将其菌液与60%灭菌甘油等体积混合,于-80 ℃冻存备用。

1.2.2 分离菌株生化鉴定

使用HBI芽孢杆菌生化鉴定条对分离菌株进行生化反应鉴定,鉴定结果与《伯杰氏系统细菌手册》比对。

1.2.3 分离菌株16S rRNA基因序列分析

参考水煮法提取细菌DNA作为PCR扩增模板,细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')用于PCR扩增鉴定,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增体系:Premix Taq 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,基因组DNA 5 μL,ddH2O 4 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;72 ℃延伸 5 min;扩增产物4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析,测序结果上传于NCBI网站进行序列比对,分析其种属。

1.2.4 分离菌株的益生潜力评估

1.2.4.1 耐酸性

调整LB肉汤的pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,灭菌后备用。将冻存的分离菌株接种至LB肉汤,37 ℃、180 r/min摇床过夜培养,按1%的接种量接入不同pH的LB肉汤中,37 ℃摇床培养4 h后吸取200 μL菌悬液至酶标板中,于酶标仪检测其在600 nm处的吸光度(OD600)值,以LB肉汤(pH 7.0)为对照,测量样品分为3份,每份重复测定3次[11],计算菌株相对存活率。
相对存活率(%)=(试验组OD600值/对照组OD600值)×100。

1.2.4.2 耐胆盐

配制分别含有0.1%、0.2%、0.3%胆盐的LB肉汤备用。将冻存的分离菌株接种至LB肉汤,37 ℃、180 r/min摇床过夜培养,按1%的接种量接入不同胆盐浓度的LB肉汤中,37 ℃摇床培养4 h后吸取200 μL菌悬液至酶标板中,于酶标仪检测其OD600值,以不添加胆盐的LB肉汤为对照,测量样品分为3份,每份重复测定3次[12],按照1.2.4.1中公式计算菌株相对存活率。

1.2.4.3 药敏试验

采用纸片扩散法(K-B法)测定分离菌株对青霉素G、万古霉素、链霉素等15种抗菌药物的抗生素敏感性。取100 μL过夜培养的菌悬液均匀涂布于LB琼脂培养基上,再将所选药敏片贴在培养基表面,并轻轻压实,于37 ℃恒温培养箱中过夜培养,通过测量药敏片周围抑菌圈直径大小来判断菌株的药物敏感性。结果判定参照《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(WS/T 125-1999)。

1.2.4.4 溶血活性

使用无菌脱纤维绵羊血制备绵羊血平板备用。分离菌株活化后在绵羊血平板上划线,于37 ℃恒温培养箱中过夜培养,观察菌落周围是否出现溶血环。

1.2.4.5 抗菌活性

采用牛津杯法测定分离菌株的抗菌活性。将病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌)均匀涂布于LB琼脂培养基,将牛津杯放置于LB琼脂平板上,轻轻按压,在牛津杯中加入200 μL(108 CFU/mL)分离菌株的菌悬液,37 ℃恒温培养箱过夜培养,测定抑菌圈直径。

1.2.5 生长曲线

取过夜培养的菌悬液,按1%的接种量接入LB肉汤中,37 ℃、180 r/min振荡培养24 h,每隔2 h取菌悬液1次,共取12次,以无菌LB肉汤为对照,测定OD600值,重复测定3次,绘制生长曲线。

1.2.6 体内安全性

参照农业农村部制定的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》对分离菌株进行安全性评估。

1.2.6.1 灌胃

10只小鼠适应环境7 d后随机分为2组,对照组灌胃生理盐水(0.2 mL/只),试验组灌胃活菌数为108 CFU/mL的分离菌株(0.2 mL/只),持续灌胃14 d。小鼠自由采食和饮水[13]。每日灌胃前记录小鼠的体重变化,同时观察小鼠毛色、整体精神状态及分泌物、排泄物状况。灌胃结束后,采集小鼠血液,进行血细胞指标分析;将小鼠安乐死后取肝脏、脾脏、肾脏,无尘纸擦干表面水分后称重,计算脏器指数。
脏器指数(%)=[脏器重(g)/体重(g)]×100。

1.2.6.2 腹腔注射

10只小鼠适应环境7 d后随机分为2组,对照组腹腔注射生理盐水(0.2 mL/只),试验组腹腔注射活菌数为108 CFU/mL的分离菌株(0.2 mL/只),小鼠自由采食和饮水,仅在第1天注射,观察小鼠毛色、整体精神状态及分泌物、排泄物状况,连续观察7 d。7 d后将小鼠安乐死,解剖观察各组织器官是否存在病理变化。

1.3 数据处理与分析

试验数据用SPSS 26.0进行t检验,GraphPad Prism 8作图,数据结果表示为平均值±标准差。P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 分离菌株鉴定结果

2.1.1 形态学鉴定

分离菌株在LB琼脂培养基上培养后单菌落呈淡黄色圆形或椭圆形,微凸起,不透明,表面光滑,边缘整齐(图1-A);革兰氏染色结果显示该菌株为革兰氏阳性杆状细菌(图1-B);芽孢染色可见内生孢子(图1-C)。
图1 分离菌株形态

A:LB琼脂平板上的形态 ;B:革兰氏染色(100×);C:芽孢染色(100×)。

Fig.1 Morphology of isolated strains

A: morphology on LB agar plates; B: Gram staining (100×); C: spore staining (100×).

2.1.2 生化鉴定

如表1所示,对分离菌株的生化鉴定结果为V-P、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明胶液化、pH 5.7生长试验结果呈阳性,柠檬酸盐、丙酸盐、7%氯化钠、硝酸盐还原、淀粉水解试验结果呈阴性。据此,初步判断该分离菌株为芽孢杆菌属。
表1 分离菌株的生化鉴定结果

Table 1 Biochemical identification results of isolated strains

项目
Items		 鉴定结果
Identification results
V-P试验V-P test +
柠檬酸盐Citrate -
丙酸盐Propionate -
D-木糖D-xylose +
L-阿拉伯糖L-arabinose +
D-甘露醇D-mannitol +
明胶液化Gelatin liquefaction +
7%氯化钠7% sodium chloride -
pH 5.7生长pH 5.7 growth +
硝酸盐还原Nitrate reduction -
淀粉水解Starch hydrolysis -

“+”表示阳性反应,“-”表示阴性反应。

“+” indicates positive reaction, and “-” indicates negative reaction.

2.1.3 16S rRNA基因序列分析

分离菌株16S rRNA基因扩增产物片段大小约为1 500 bp(图2),PCR扩增产物测序后结果制作进化树(图3),分离菌株序列与NCBI上已发布的巨大芽孢杆菌基因组序列同源相似性均在90%以上,因此确定该分离菌株为巨大芽孢杆菌,将其命名为巨大芽孢杆菌BM24。
图2 分离菌株16S rRNA基因序列鉴定结果

M:DNA分子量标准DL2000;+:阳性对照;NC:阴性对照;BM24:分离菌株。

Fig.2 Identification result of 16S rRNA gene sequence in isolated strains

M: DNA Maker DL2000; +: positive control; NC: negative control; BM24: isolated strain.

图3 分离菌株和芽孢杆菌属细菌进化树

Bacillus:芽孢杆菌属;Bacillus megateriun:巨大芽孢杆菌;Bacillus aryabhattai:阿氏芽孢杆菌;Bacteria:细菌;starin:菌株。

Fig.3 Evolutionary tree of isolated strain and bacteria in Bacillus

2.2 羊源巨大芽孢杆菌BM24的益生潜力评估结果

2.2.1 耐酸性

由图4可知,羊源巨大芽孢杆菌BM24能够在不同的pH下存活,在pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的条件下培养4 h后,其相对存活率分别为28.28%、27.33%、73.63%、100.37%、103.24%、97.98%。
图4 羊源巨大芽孢杆菌BM24在不同pH条件下的相对存活率

Fig.4 Relative survival rate of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 under different pH conditions

2.2.2 耐胆盐

由图5可知,羊源巨大芽孢杆菌BM24在0.1%、0.2%、0.3%胆盐条件下培养4 h后,相对存活率分别为47.93%、48.66%、49.95%,表现出较好的胆盐耐受性。
图5 羊源巨大芽孢杆菌BM24在不同浓度胆盐条件下的相对存活率

Fig.5 Relative survival rate of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 under different bile salt concentration conditions

2.2.3 药敏试验

选取15种常用抗菌药物对羊源巨大芽孢杆菌BM24进行药敏试验,结果表明该菌株除对克林霉素与青霉素G耐药、红霉素中度敏感外,对其余12种抗菌药物均表现出敏感性(表2)。
表2 羊源巨大芽孢杆菌BM24药敏试验结果

Table 2 Results of drug sensitivity test for sheep-derived Bacillus megaterium BM24

抗生素名称
Antibiotics name		 每片含量
Content per
piece		 判定标准:抑菌圈直径
Judgment standard: antibacterial ring diameter/mm		 敏感性
Susceptibility
耐药
Resistance (R)		 中介
Intermediate (I)		 敏感
Sensitive (S)
克林霉素Clindamycin 2 μg ≤13 14~17 ≥18 R
万古霉素Vancomycin 30 μg — — ≥15 S
庆大霉素Gentamycin 10 μg ≤12 13~14 ≥15 S
卡那霉素Kanamycin 30 μg ≤13 14~17 ≥18 S
链霉素Streptomycin 10 μg ≤11 12~14 ≥15 S
氯霉素Chloramphenicol 30 μg ≤12 13~17 ≥18 S
红霉素Erythromycin 15 μg ≤13 14~22 ≥23 I
氨苄西林Ampicillin 10 μg ≤13 14~16 ≥17 S
苯唑西林Benzoxicillin 1 μg ≤10 11~12 ≥13 S
青霉素G Penicillin G 10 U ≤28 — ≥29 R
诺氟沙星Norfloxacin 10 μg ≤12 13~16 ≥17 S
环丙沙星Ciprofloxacin 5 μg ≤15 16~20 ≥21 S
四环素Tetracycline 30 μg ≤14 15~18 ≥19 S
头孢噻肟Cefotaxime 30 μg ≤14 15~22 ≥23 S
头孢哌酮Cefoperazone 75 μg ≤15 16~20 ≥21 S

2.2.4 溶血活性

如图6所示,羊源巨大芽孢杆菌BM24在绵羊血平板上生长良好,菌落周围无溶血环,表明其无溶血活性。
图6 羊源巨大芽孢杆菌BM24在血琼脂平板上形态

Fig.6 Morphology of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 on blood agar plate

2.2.5 抗菌活性

由表3可知,羊源巨大芽孢杆菌BM24对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制效果,其中对沙门氏菌及大肠杆菌的抑制效果较强。
表3 羊源巨大芽孢杆菌BM24抑菌试验结果

Table 3 Results of bacteriostatic test of sheep-derived Bacillus megaterium BM24mm

供试菌
Test bacteria		 抑菌圈直径
Antibacterial ring
diameter
大肠杆菌Escherichia coli 22.46±2.32
沙门氏菌Salmonella 24.33±1.71
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus		 10.92±0.50

2.3 生长曲线

羊源巨大芽孢杆菌BM24的生长曲线如图7所示,菌株在0~2 h为生长迟缓期,2~6 h进入生长对数期,6 h后生长趋于平稳。
图7 羊源巨大芽孢杆菌BM24生长曲线

Fig.7 Growth curve of sheep-derived Bacillus megaterium BM24

2.4 羊源巨大芽孢杆菌BM24的安全性评价结果

2.4.1 灌胃小鼠剖检观察

整个试验期间,试验组与对照组小鼠均未见异常状态和死亡现象,毛色、精神状态和粪便均正常,口、鼻、耳及肛门处无异常分泌物。剖检观察时,试验组与对照组小鼠腹腔内主要器官均无明显肉眼可见病变,2组之间无明显眼观差异。

2.4.2 灌胃小鼠体重及脏器指数变化

由图8可知,试验期间2组小鼠的体重无显著差异(P>0.05);从表4可知,与对照组相比,试验组小鼠肝脏、肾脏、脾脏指数均无显著变化(P>0.05)。
图8 灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24对小鼠体重的影响

数据点上方标注的数据为t检验的P值。

Fig.8 Effects of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 on body weight of mice by gavage

The data marked above the data points are the P-value of the t-test.

表4 灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24对小鼠脏器指数的影响

Table 4 Effects of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 on organ indexes of mice by gavage %

项目Items 对照组Control group 试验组Test group P值P-value
肝脏指数Liver index 4.71±0.37 5.24±0.32 0.310
肾脏指数Kidney index 1.77±0.19 1.73±0.19 0.907
脾脏指数Spleen index 0.26±0.04 0.28±0.03 0.627

2.4.3 灌胃小鼠血细胞指标变化

如表5所示,灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24后小鼠血细胞指标与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。
表5 灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24对小鼠血细胞指标的影响

Table 5 Effects of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 on blood cell indexes of mice by gavage

项目Items 对照组Control group 试验组Test group P值P-value
白细胞数WBC/(×109个/L) 6.38±1.39 8.28±2.42 0.259
淋巴细胞数LYM/(×109个/L) 3.87±0.55 5.57±1.65 0.062
单核细胞数MON/(×109个/L) 2.27±1.85 1.90±0.44 0.095
中性粒细胞数GRA/(×109个/L) 1.24±1.05 1.16±0.29 0.111
血红蛋白浓度HGB/(g/L) 216.00±9.79 207.96±11.90 0.397
红细胞数RBC/(×1012个/L) 13.39±0.58 12.61±0.71 0.986

2.4.4 腹腔注射小鼠剖检观察

腹腔注射后的7 d观察期间试验组和对照组小鼠均未见异常症状和死亡现象,精神状态良好;2组小鼠剖检腹腔内脏器无明显眼观病理变化(图9)。
图9 腹腔注射羊源巨大芽孢杆菌BM24小鼠剖检观察

Fig.9 Autopsy observation of sheep-derived Bacillus megaterium BM24 mice by intraperitoneal injection

3 讨论

3.1 羊源巨大芽孢杆菌BM24体外益生潜力

宿主和肠道菌群之间存在着特异性相互选择关系,动物肠道内的微生物更易在本体动物内繁殖和定植[14]。因此,理想的羊用益生菌株应该来自健康羊的胃肠道。本研究从健康新疆细毛羊新鲜粪便中分离得到1株巨大芽孢杆菌,命名为巨大芽孢杆菌BM24,并对其进行体外益生潜力和小鼠体内安全性评价,以为今后养羊业羊源益生菌的应用提供参考。
良好的益生菌特性是:耐酸耐胆盐、无溶血活性、抗生素敏感性、抗有害微生物活性[15]。益生菌在宿主肠道定植并发挥作用,候选菌株需要对胃的酸性和肠道的胆汁盐具有一定的耐受性,动物胃液的pH通常在3.0左右,羊肠道中的胆盐浓度在0.03%~0.30%[16-17]。有研究发现,来源于绵羊乳制品中的植物乳杆菌对低pH及高浓度胆盐有较好的耐受性[18];田亮金等[19]研究表明,在人工胃液和肠液的作用下,巨大芽孢杆菌A20、A27、B47和B89的存活率均可高于60%。本试验分离出的羊源巨大芽孢杆菌BM24在pH为3.0时存活率为73.63%,pH为1.0时仍有28.28%的存活率,表明其具有良好的耐酸能力;同时,该菌株能够在0.1%~0.3%胆盐下存活,有较好的胆盐耐受性,与不同种属的芽孢杆菌耐胆盐特性[11,16,20-21]相似,表明羊源巨大芽孢杆菌BM24能够耐受胃肠道环境。
益生菌具有在肠道中转移抗生素抗性基因至病原菌中的潜在能力[22-23],因此候选益生菌在应用前必须进行抗生素耐药性评估。本研究使用15种常见抗生素对羊源巨大芽孢杆菌BM24进行药敏试验,发现其对其中12种抗生素表现出高度敏感,表明该菌株的耐药性低,安全性高。有研究发现,羊源地衣芽孢杆菌对万古霉素、庆大霉素和四环素等抗生素敏感[12,24];徐淑琴等[25]发现,来源于藏羊瘤胃液中的1株沙福芽孢杆菌对青霉素类、氨基糖苷类及多肽类等抗生素表现出敏感性;陈永亮等[26]从散养草鸡内脏中分离出的1株巨大芽孢杆菌201706J对诺氧沙星、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素等常用抗生素均敏感,与本试验结果一致。候选益生菌是否有溶血性是评估菌株益生潜力的重要条件之一[27],本研究分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24不具有溶血活性,与周海欧等[28]的研究结果相一致。
已有研究表明,芽孢杆菌可通过分泌细菌素、磷脂类、抗菌肽等抗菌物质,破坏病原菌的细胞壁和细胞膜,抑制病原菌的生长[19,29⇓⇓-32]。Rajput等[33]研究发现,从羊奶中分离到的肠球菌具有抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及铜绿假单胞菌生长的作用。来源于育肥绵羊空肠的海氏肠球菌对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有一定的抑制效果[34]。巨大芽孢杆菌L2发酵产物LE4-3可抑制胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1生长[35]。菌株L2粗提物LE4-5对2种食品植物病原菌株青枯雷尔氏菌RS-2和根癌农杆菌T-37的生长均有较好的抑制效果[36]。有研究发现巨大芽孢杆菌JX-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有很强的抑制效果[37],巨大芽孢杆菌N17-12对副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌有明显的抑制作用[38]。巨大芽孢杆菌MIT411对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及空肠弯曲杆菌有良好的抗菌活性[39]。在本研究中,羊源巨大芽孢杆菌BM24对常见腹泻致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均表现出良好的抑制能力。
益生菌进入肠道后,通常需要快速定植并迅速生长,从而在微生物竞争中获得优势,成为优势菌群[40-41]。赵龙妹等[42]研究发现,巨大芽孢杆菌XT2在2~10 h进入对数生长期,菌体增殖迅速,10~20 h进入生长稳定期。本研究分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24在2~6 h即可进入对数生长期,表明其具有良好的生长特性。

3.2 羊源巨大芽孢杆菌BM24体内安全性

潜在益生菌株在投入生产前需要进行体内安全性评价,急性口服毒性试验是评价益生菌是否安全的最基本安全性评估试验[27]。钟罗华等[37]研究发现,连续口服巨大芽孢杆菌液1周,整个试验期间小鼠无死亡及腹泻,且巨大芽孢杆菌组小鼠体重有明显的增加。在其他潜在益生菌株体内安全性研究中,白海等[43]以小鼠为动物模型评估了枯草芽孢杆菌的安全性。Abid等[44]从牛奶中分离发酵乳杆菌而后通过21 d连续灌胃小鼠证明其是安全无毒的。张楠驰等[45]采用高浓度菌悬液灌胃小鼠的方法评价羊源解淀粉芽孢杆菌fsznc-06的安全性,结果表明该菌对小鼠未造成负面影响。向微微等[46]通过对小鼠进行经口灌胃及腹腔注射试验发现羊源弯曲乳杆菌Y15具有良好的安全性。Hou等[12]发现,绵羊源地衣芽孢杆菌B63对昆明小鼠及SD大鼠无毒副作用。本试验中,腹腔注射羊源巨大芽孢杆菌BM24后的7 d观察期间,小鼠的生理状态均正常,无发病和死亡,解剖后小鼠体内脏器眼观均无异常症状,表明羊源巨大芽孢杆菌BM24无急性致病性;经过连续14 d的灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24,发现所有小鼠的饮水、采食、粪便及活动均正常,无小鼠死亡;灌胃试验结束后,试验组与对照组相比,小鼠体重、血细胞指标均无显著差异,肝脏、脾脏、肾脏均未发现明显的病理变化,且2组小鼠脏器指数无显著差异。综上所述,本试验分离得到的菌株羊源巨大芽孢杆菌BM24对小鼠无毒副作用,作为益生菌来使用是安全的。

4 结论

本研究从健康细毛羊粪便中分离的巨大芽孢杆菌BM24不仅在体外表现出对酸和胆盐良好的耐受性,对多种常见抗生素敏感,对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用,不具有溶血活性,生长速度快,而且在小鼠体内通过灌胃和腹腔注射试验证明了其具有良好的安全性,可作为羊源益生菌菌株今后在养羊产业中使用。

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