不同比例芦苇秸秆与残次香梨混合青贮对绵羊体外瘤胃发酵特性的影响

郁万瑞; 李明洋; 王芳芳; 陈亚飞; 高崎峰; 孙瑜良; 李祥浩; 唐利敏; 刘浩南; 陶大勇; 蒋慧; 蒋涛

doi:10.12418/CJAN2024.553

动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 10: 6511 - 6527

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.553

研究论文

不同比例芦苇秸秆与残次香梨混合青贮对绵羊体外瘤胃发酵特性的影响

郁万瑞 ^,¹ ,
李明洋 ¹ ,
王芳芳 ¹ ,
陈亚飞 ¹ ,
高崎峰 ¹ ,
孙瑜良 ¹ ,
李祥浩 ¹ ,
唐利敏 ¹ ,
刘浩南 ¹ ,
陶大勇 ¹^,²^,³ ,
蒋慧 ¹^,²^,³ ,
蒋涛 ^,¹^,²^,³^,^*

展开

¹ 塔里木大学动物科学与技术学院,阿拉尔 843300
² 农业农村部环塔里木畜草资源利用重点实验室, 阿拉尔 843300
³ 塔里木畜牧科技兵团重点实验室,阿拉尔 843300

^*蒋涛,教授,硕士生导师,E-mail: jiangtao888888@126.com

郁万瑞(1998—),男,甘肃兰州人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail: 2213042259@qq.com

Copy editor: 陈鑫

收稿日期: 2024-04-02

网络出版日期: 2024-10-14

基金资助

新疆维吾尔自治区奶产业技术体系(XJARS-11)

兵团农业关键核心技术攻关项目——华西牛乳肉兼用(军垦型)新品系培育(NYHXGG)

兵团农业关键核心技术攻关项目——华西牛乳肉兼用(军垦型)新品系培育(2023AA205)

师市重点领域科技攻关项目——甘草茎叶与全株玉米混合青贮在绵羊生产中高效利用及示范(S2023LY00007)

塔里木大学校长基金——甘草茎叶在44团肉牛生产中高效利用及示范(TDZXZX202303)

收起

Effects of Mixed Silage of Reed Straw and Defective Pear with Different Proportions on in Vitro Rumen Fermentation Characteristics in Sheep

YU Wanrui ^,¹ ,
LI Mingyang ¹ ,
WANG Fangfang ¹ ,
CHEN Yafei ¹ ,
GAO Qifeng ¹ ,
SUN Yuliang ¹ ,
LI Xianghao ¹ ,
TANG Limin ¹ ,
LIU Haonan ¹ ,
TAO Dayong ¹^,²^,³ ,
JIANG Hui ¹^,²^,³ ,
JIANG Tao ^,¹^,²^,³^,^*

Expand

¹ College of Animal Science, Tarim University, Alar 843300, China
² Key Laboratory of Animal and Grass Resources Utilization in the Tarim Basin, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Alar 843300, China
³ Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Alar 843300, China

^*professor, E-mail: jiangtao888888@126.com

Received date: 2024-04-02

Online published: 2024-10-14

Fold

摘要

本试验旨在探究不同比例芦苇秸秆与残次香梨混合青贮对绵羊瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率和微生物菌群组成动态变化的影响。试验以不同比例芦苇秸秆与残次香梨[鲜重质量比分别为100∶0(Ⅰ)、80∶20(Ⅱ)、60∶40(Ⅲ)、40∶60(Ⅳ)]混合青贮为发酵底物,体外发酵72 h,测定不同时间点的累积产气量、发酵参数、微生物菌群组成以及发酵后的营养物质降解率,并利用多项指标综合指数(MFAEI)进行综合评价。结果表明:混合青贮比例、体外发酵时间及其交互作用显著影响瘤胃体外发酵参数(产气量、pH及氨态氮、乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸含量与乙酸/丙酸)(P<0.05);随着混合青贮中残次香梨比例的升高,干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率显著增加(P<0.05);Ⅳ组的MFAEI显著高于Ⅱ组(P<0.05),但与Ⅲ组差异不显著(P>0.05);混合青贮比例、体外发酵时间及其交互作用显著影响绵羊瘤胃体外微生物菌群Chao1指数、ACE指数、Simpson指数和Shannon指数。(P<0.05)。门水平上,厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为优势菌,但其相对丰度受混合青贮比例与发酵时间的影响显著(P<0.01);属水平上,普雷沃氏菌属的相对丰度受混合青贮比例与发酵时间的显著影响(P<0.05)。综上所述,确定混合青贮中芦苇秸杆与残次香梨比例为40∶60对瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率及微生物组成影响较大。混合青贮中芦苇秸杆与残次香梨比例为40∶60时其饲用价值较好。

关键词： 芦苇秸秆; 残次香梨; 混合青贮; 体外发酵; 营养物质降解率; 微生物组成

本文引用格式

郁万瑞 , 李明洋 , 王芳芳 , 陈亚飞 , 高崎峰 , 孙瑜良 , 李祥浩 , 唐利敏 , 刘浩南 , 陶大勇 , 蒋慧 , 蒋涛 . 不同比例芦苇秸秆与残次香梨混合青贮对绵羊体外瘤胃发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(10) : 6511 -6527 . DOI: 10.12418/CJAN2024.553

Abstract

The aim of this experiment was to investigate the effects of different proportions of mixed silage of reed straw and defective pear on the in vitro rumen fermentation parameters, nutrient degradation rate and microbial composition dynamic change of sheep. The test was conducted with four groups of silage with the proportions of reed straw and defective pear of 0∶100 (Ⅰ), 20∶80 (Ⅱ), 40∶60 (Ⅲ), and 60∶40 (Ⅳ) as the fermentation substrate, and the in vitro fermentation was carried out for 72 h. The cumulative gas production (GP), the fermentation parameters and microbial compositions, and nutrient degradation rate after the fermentation were determined at different time points and evaluated by the multiple-factor associative effect index (MFAEI). The results showed as follows: the proportion of mixed silage, in vitro fermentation time and their interactions significantly affected the rumen in vitro fermentation parameters (gas production, pH, NH₃-N, acetic acid, propionic acid, butyric acid, total volatile fatty acid contents and acetic acid/propionic acid) (P<0.05); the degradation of dry matter, neutral detergent fibre and acid detergent fibre significantly increased with the proportion of defective pear in mixed silage (P<0.05); MFAEI was significantly higher in group Ⅳ than in groups Ⅰ and Ⅱ (P<0.05), and the difference with group Ⅲ was not significant (P>0.05); the mixed silage proportion, in vitro fermentation time and their interactions significantly affected Chao1 index, ACE index, Simpson index and Shannon index of sheep rumen microflora in vitro (P<0.05). At the phylum level, Firmicutes, Bacteroides and Proteobacteria were the dominant bacteria at the phylum level, but their relative abundance was significantly affected by mixed silage ratio and fermentation time (P<0.05). At the genus level, the relative abundance of Prevotella was significantly affected by mixed silage ratio and fermentation time (P<0.05). In conclusion, the proportion of reed straw and residual pear in mixed silage is 40:60, which has great influence on rumen fermentation parameters, nutrient degradation rate and microbial composition in vitro. The forage value of mixed silage is better when the proportion of reed straw and residual pear is 40∶60.

Key words： reed straw; defective pear; mixed silage; in vitro fermentation; degradation rate of nutrients; microbial composition

梨是我国产量仅次于苹果、柑橘的第三大水果,而新疆也是我国排名前4的产梨大省,2021年梨的产量约154.5万t^[1],香梨中含多糖、维生素、生物碱类、三萜类化合物等成分,具有抗氧化、抗溃疡、抗炎、抗癌等功效^[2],但每年因各种原因使香梨的浪费达38%以上^[3]。残次香梨指未成熟而脱落、有伤口、畸形、个头较小的梨子。新疆作为我国芦苇四大产区之一,拥有丰富的芦苇资源,芦苇种植面积达约6.667万hm²,年产量可达30万t,且芦苇秸秆中含有1/2以上植物光合作用沉积的能量,具有潜在利用价值,对家畜来说是良好的非常规饲料资源^[4]。Asano等^[5]研究发现,在繁殖母牛的饲粮中添加高达80%的芦苇青贮饲料不会对血液代谢产物产生不利影响。关于残次香梨与芦苇秸秆混合青贮体外发酵的研究较少。因此,本试验通过体外发酵,探究不同比例芦苇秸秆与残次香梨混合青贮对绵羊瘤胃体外发酵参数、营养物质降解率与微生物组成动态变化的影响,为反刍动物饲料资源开发与利用提供基础数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验经塔里木大学科技伦理委员会批准(批准编号:2024048),选取5只健康状况良好、装有永久瘤胃瘘管的成年绵羊,晨饲前采集瘤胃液,并用4层纱布过滤至暖壶中,带回实验室备用。

试验前将芦苇秸秆和残次香梨2种样品放入65 ℃烘箱内烘至恒重,粉碎,过40目筛,置于干燥密封环境保存。2种样品的干物质(DM)含量采用GB/T 6435—2014^[6]的方法测定;粗蛋白质(CP)含量采用GB/T 6432—2018^[7]凯氏定氮法测定;中性洗涤纤维(NDF)含量采用GB/T 20806—2022^[8]的方法测定;酸性洗涤纤维(ADF)含量采用NY/T 1459—2022^[9]的方法测定。可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法测定。不同比例混合青贮的营养水平见表1。

表1 不同比例混合青贮的营养水平(干物质基础)

Table 1 Nutrient levels of silage mixed in different proportions (DM basis)%

芦苇秸秆∶残次香梨 Reed straw∶defective pear	粗蛋白质 CP	中性洗涤纤维 NDF	酸性洗涤纤维 ADF	可溶性碳水化合物 WSC
100∶0	5.27	70.51	41.76	1.14
80∶20	5.12	65.25	40.72	1.82
60∶40	4.84	58.51	38.41	2.80
40∶60	4.74	49.69	36.63	3.93

1.2 试验设计

本试验以不同比例芦苇秸秆与残次香梨[鲜重质量比分别为100∶0(Ⅰ)、80∶20(Ⅱ)、60∶40(Ⅲ)、40∶60(Ⅳ)]混合青贮为发酵底物,每组每个时间点设置3个重复,同时设置3个空白组用以校正。

1.3 体外发酵试验

1.3.1 体外产气

准确称取200 mg待测饲料样本装入100 mL带刻度的注射器中,在注射器内塞上均匀涂抹适量凡士林以保证气密性防止漏气。采用Menke等^[10]方法配制人工瘤胃液,将瘤胃液与人工瘤胃液以1∶2的体积比混合,同时通入CO₂至无色,且在此期间一直通入CO₂并保持其温度在39 ℃。分别向注射器加入约30 mL混合培养液,排尽注射器管内空气,密封,并记录相应的初始刻度值。将培养注射器管迅速放入已预热(39 ℃)的水浴摇床中培养。分别在0、3、6、9、12、24、36、48和72 h记录各注射器的产气量并取样。

1.3.2 营养物质降解率测定

准确称取5 g(精确至0.000 1 g)饲料装入孔径为35 μm的尼龙布制作长×宽为14 cm×9 cm的尼龙袋中,放入培养瓶中,在培养瓶中加入培养液(瘤胃液与人工瘤胃液体积比为1∶2) 600 mL,通入30 s的CO₂排空里面的空气,盖紧盖子,放入培养箱中培养72 h。培养结束后用39 ℃水冲洗尼龙袋5 min后放入65 ℃的烘箱中烘干至恒重,饲料和残渣中的干物质(DM)含量采用GB/T 6435—2014^[6]的方法测定;中性洗涤纤维(NDF)含量采用GB/T 20806—2022^[8]的方法测定;酸性洗涤纤维(ADF)含量采用NY/T 1459—2022^[9]的方法测定,并按如下公式计算降解率:

降解率(%)=100×(a-b)/a。

式中:a为营养物质含量(g);b为发酵72 h后残渣营养物质含量(g)。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 产气量及产气参测定

分别记录0、3、6、9、12、24、36、48和72 h各注射器的产气量并用空白进行校正。产气参数按如下公式计算:

GP=a+b(1-e^-^ct)。

式中:t为发酵时间(h);GP为t时刻的产气量(mL);a为快速降解部分(mL);b为慢速降解部分(mL);c为产气速率常数(%/h);a+b为潜在产气量(mL)^[11]。

1.4.2 发酵参数测定

分别在每个时间点取出注射器,并立即放入冰水中停止发酵。取出发酵液测定pH,并将样品一部分冻存于-20 ℃冰箱中,用于测定氨态氮(NH₃-N)和挥发性脂肪酸(VFA)的含量;另一部分样品放入-80 ℃冰箱中,用于瘤胃细菌16S rDNA基因测序分析。发酵液中的pH用pH计(艾沃斯AS-PH8)测定;NH₃-N含量采用Searle^[12]报道的方法进行测定;乙酸、丙酸和丁酸含量采用Thermo Scientific TRACE 1310型气相色谱仪(Agilent HP-INNOWax色谱柱;进样口温度:250 ℃;载气流速:1 mL/min;分流比:75∶1;升温程序:60 ℃,保持时间2 min,然后以10 ℃/min的速率升温至220 ℃,保持时间1 min;检测器温度250 ℃)测定。

1.4.3 瘤胃微生物多样性测定

先用E.Z.N.A.Water DNA Kit试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)提取总DNA。使用引物(338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对16S rDNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增,并对其产物进行纯化、定量。使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序(北京擎科生物科技有限公司)。

1.4.4 单项组合效应指数(SFAEI)与多项指标综合指数(MFAEI)的计算

SFAEI及MFAEI的计算参考卢德勋^[13]的计算方法。具体计算方法如下:

SFAEI= $∑ m = 1 n (A 2 m - A 1 m) / n A 2 m$ 。

式中:m为各培养时间点;n为培养时间点的个数;A_1m为对照组(Ⅰ组)各单一指标不同采样时间的数值;A_2m为试验组各单一指标不同培养时间的数值;单项指标为pH、氨态氮、总挥发性脂肪酸含量和总产气量。

MFAEI为各单项组合效应值之和。

1.5 微生物测序数据分析

微生物测序原始数据首先使用Trimmomatic (version 0.33)进行质量过滤,然后使用Cutadapt(version 1.9.1)进行引物序列的识别与去除,其后使用USEARCH(version 10)对双端reads进行拼接并去除嵌合体(UCHIME,version 8.1),并在相似性97%(默认)的水平上对序列进行聚类,以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤操作分类单元(OTU),通过QIIME2(versoin 2020.6)中classify-sklearn对每条序列进行物种分类注释,用Silva(Release138, http://www.arb-silva.de)数据库进行对比。

1.6 数据统计分析

试验数据用Excel 2016进行整理,采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析,Duncan氏法进行多重比较,结果用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著,P≥0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同比例混合青贮对体外发酵产气量和产气参数的影响

由表2可知,随着发酵时间的延长,各组产气量显著上升(P<0.05),并且青贮比例与发酵时间存在显著交互作用(P<0.05)。在3~12 h产气速度较快,随后速度减慢。其中,Ⅳ组3、6、9、12、36和72 h的产气量均显著高于其他3组(P<0.05)。

表2 不同比例混合青贮对体外发酵产气量和产气参数的影响

Table 2 Effects of different proportions of mixed silage on in vitro fermentation gas production and gas production parameters

项目 Items	组别 Groups				SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	比例 Proportion	时间 Time	比例×时间 Proportion×time
产气量 Gas production/mL
3 h	5.33^Hc	7.67^Hb	8.33^Hb	10.33^Ha	0.56	<0.001	<0.001	<0.001
6 h	9.00^Gc	11.33^Gbc	12.67^Gb	16.00^Ga	0.83	0.001
9 h	11.33^Fc	15.67^Fb	17.33^Fb	20.33^Fa	1.01	<0.001
12 h	14.67^Ed	18.00^Ec	21.00^Eb	26.33^Ea	1.33	<0.001
24 h	23.67^Dc	28.33^Db	30.33^Dab	36.00^Da	1.37	<0.001
36 h	30.33^Cc	37.33^Cb	39.33^Cb	45.00^Ca	1.60	<0.001
48 h	36.00^Bc	42.67^Bb	46.67^Ba	51.00^Ba	1.69	<0.001
72 h	43.67^Ac	51.33^Ab	56.33^Ab	59.00^Aa	1.80	<0.001
产气参数 Gas production parameters
快速产气部分 a/mL	2.34^c	4.00^bc	5.27^ab	6.07^a	0.48	0.006
慢速产气部分 b/mL	52.30^b	58.50^b	59.07^b	65.74^a	1.67	0.011
潜在产气量 a+b/mL	54.64^c	62.50^b	64.34^b	71.81^a	2.02	0.002
产气速率常数 c	0.022^b	0.023^b	0.021^b	0.031^a	0.001	0.016

	同列数据肩标不同大写字母表示不同时间之间差异显著(P<0.05),同行数据肩标不同小写字母表示不同组之间差异显著(P<0.05)。表3、4、7、8、9同。
	In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant differences among different time (P<0.05); in the same row, values with different small letter superscripts mean significant differences among groups (P<0.05). The same as Table 3, Table 4, Table 7, Table 8, and Table 9.

随着残次香梨比例的升高,快速产气部分、慢速产气部分和潜在产气量逐渐升高。Ⅳ组慢速产气部分、潜在产气量和产气速率常数显著高于其他3组(P<0.05)。

2.2 不同比例混合青贮对体外发酵参数的影响

由表3可知,随着发酵时间的延长,pH显著降低(P<0.05),且青贮比例与发酵时间存在显著交互作用(P<0.05)。Ⅳ组48与72 h的pH差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组pH在3、9、12和36 h显著高于其他3组(P<0.05)。NH₃-N含量随着发酵时间的延长显著升高(P<0.05),且青贮比例与发酵时间存在显著交互作用(P<0.05)。Ⅰ组24、36、48和72 h的NH₃-N含量显著高于其他3组(P<0.05)。

表3 不同比例混合青贮对体外发酵pH和氨态氮含量的影响

Table 3 Effects of different proportions of mixed silage on in vitro fermentation pH and ammonia nitrogen content

项目 Items	组别 Groups						SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ			SEM	比例 Proportion	时间 Time	比例×时间 Proportion×time
pH
0 h	6.88^A	6.85^A	6.84^A		6.86^A		0.01	0.317	<0.001	<0.001
3 h	6.76^Ba	6.70^Bb	6.63^Bc		6.56^Bd		0.02	<0.001
6 h	6.71^Ca	6.64^Cab	6.57^Cbc		6.50^Cc		0.03	0.006
9 h	6.65^Da	6.60^CDb	6.52^Dc		6.46^CDd		0.02	<0.001
12 h	6.61^Da	6.56^Db	6.49^Dc		6.44^Dd		0.02	<0.001
24 h	6.49^Ea	6.45^Ea	6.39^Eb		6.30^Ec		0.02	<0.001
36 h	6.39^Fa	6.35^Fb	6.30^Fc		6.23^Fd		0.02	<0.001
48 h	6.31^Ga	6.27^Ga	6.21^Gb		6.15^Gc		0.02	<0.001
72 h	6.25^Ha	6.23^Ga	6.19^Gb		6.15^Gc		0.01	0.002
氨态氮NH₃-N/(mg/dL)
0 h	8.52^G	8.53^H	8.52^I			8.53^I	0.04	1.000	<0.001	<0.001
3 h	9.52^F	9.43^G	9.34^H			9.24^H	0.06	0.478
6 h	11.00^EFa	10.44^Fab	10.03^Gb			9.82^Gb	0.17	0.047
9 h	12.11^Ea	11.26^Eab	10.68^Fb			9.99^Fb	0.29	0.024
12 h	13.56^Da	12.74^Dab	12.16^Ebc			11.51^Ec	0.28	0.012
24 h	16.17^Ca	15.85^Cb	15.31^Dc			14.64^Cd	0.17	<0.001
36 h	18.55^Ba	17.94^Bb	17.71^Cb			17.11^Bc	0.16	<0.001
48 h	20.54^Aa	19.31^Ab	19.13^Bb			18.23^Ac	0.25	<0.001
72 h	21.04^Aa	19.91^Ab	19.67^Ab			18.63^Ac	0.26	<0.001

由表4可知,总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量随着发酵时间的延长而显著升高(P<0.05),并且青贮比例与发酵时间对四者存在显著的交互作用(P<0.05)。Ⅰ组的总挥发性脂肪酸含量在6、9、12、24和48 h时显著低于Ⅲ组与Ⅳ组(P<0.05);乙酸含量在3、9、24、36、48和72 h时均显著高于其他3组(P<0.05);丙酸含量在6、9、24、36、48和72 h时均显著低于其他3组(P<0.05);丁酸含量在3、9、12、24、48和72 h时显著低于其他3组(P<0.05);乙酸/丙酸随着发酵时间的延长显著降低(P<0.05),6、9、12、24、36、48和72 h时Ⅰ组的乙酸/丙酸显著高于其他3组(P<0.05)。

表4 不同比例混合青贮对体外发酵VFA含量的影响

Table 4 Effects of different proportions of mixed silage on in vitro fermentation VFA contents

项目 Items	组别 Groups				SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	比例 Proportion	时间 Time	比例×时间 Proportion×time
总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L)
0 h	18.99^I	18.97^I	18.84^I	18.95^I	0.04	0.48	<0.001	<0.001
3 h	20.97^Hb	20.93^Hb	21.07^Hab	21.25^Ha	0.05	0.04
6 h	23.24^Gc	23.28^Gc	23.72^Gb	24.31^Ga	0.13	<0.001
9 h	25.35^Fd	25.66^Fc	26.15^Fb	26.09^Fa	0.13	<0.001
12 h	27.81^Ec	27.97^Ec	28.46^Eb	29.56^Ea	0.21	<0.001
24 h	32.54^Dc	32.76^Dc	33.18^Db	34.28^Da	0.21	<0.001
36 h	35.78^Cb	35.83^Cb	36.04^Cb	37.29^Ca	0.19	<0.001
48 h	37.64^Bc	37.77^Bbc	38.05^Bb	38.96^Ba	0.16	<0.001
72 h	38.79^Ab	39.01^Ab	39.12^Ab	40.17^Aa	0.17	<0.001
乙酸 AA/(mmol/L)
0 h	14.47^I	14.38^I	14.36^I	14.43^I	0.02	0.343	<0.001	<0.001
3 h	15.53^Ha	15.29^Hb	15.14^Hc	14.95^Hd	0.06	<0.001
6 h	16.40^Ga	16.25^Gab	16.11^Gb	15.91^Gc	0.06	0.001
9 h	17.48^Fa	17.32^Fb	17.09^Fc	16.96^Fd	0.06	<0.001
12 h	18.32^Ea	18.17^Ea	17.98^Eb	17.85^Eb	0.06	<0.001
24 h	21.13^Da	20.93^Db	20.68^Dc	20.47^Dd	0.08	<0.001
36 h	22.67^Ca	22.27^Cb	22.06^Cbc	21.94^Cc	0.09	<0.001
48 h	23.42^Ba	23.00^Bb	22.83^Bb	22.57^Bc	0.10	<0.001
72 h	23.84^Aa	23.56^Ab	23.31^Ac	23.12^Ac	0.09	<0.001
丙酸 PA/(mmol/L)
0 h	2.85^I	2.90^I	2.83^I	2.84^I	0.02	0.744	<0.001	<0.001
3 h	3.31^Hc	3.39^Hbc	3.51^Hb	3.79^Ha	0.06	<0.001
6 h	3.96^Gd	4.12^Gc	4.55^Gb	4.92^Ga	0.11	<0.001
9 h	4.57^Fd	4.81^Fc	5.22^Fb	5.91^Fa	0.15	<0.001
12 h	5.55^Ec	5.66^Ec	5.99^Eb	6.89^Ea	0.16	<0.001
24 h	6.93^Dd	7.12^Dc	7.52^Db	8.24^Da	0.15	<0.001
36 h	7.83^Cd	8.15^Cc	8.49^Cb	9.24^Ca	0.16	<0.001
48 h	8.77^Bd	9.08^Bc	9.43^Bb	10.01^Ba	0.14	<0.001
72 h	9.45^Ad	9.65^Ac	9.94^Ab	10.51^Aa	0.12	<0.001
丁酸 BA/(mmol/L)
0 h	1.67^H	1.70^H	1.65^H	1.68^I	0.02	0.919	<0.001	<0.001
3 h	2.13^Gc	2.26^Gb	2.41^Ga	2.51^Ha	0.05	<0.001
6 h	2.88^Fc	2.92^Fc	3.06^Fb	3.47^Ga	0.07	<0.001
9 h	3.30^Ed	3.53^Ec	3.85^Eb	4.33^Fa	0.12	<0.001
12 h	3.94^Dd	4.13^Dc	4.49^Db	4.82^Ea	0.10	<0.001
24 h	4.48^Cd	4.71^Cc	4.98^Cb	5.56^Da	0.12	<0.001
36 h	5.28^Bc	5.40^Bbc	5.49^Bb	6.11^Ca	0.10	<0.001
48 h	5.45^Ac	5.69^Ab	5.79^Ab	6.38^Ba	0.11	<0.001
72 h	5.50^Ac	5.80^Ab	5.87^Ab	6.54^Aa	0.12	<0.001
乙酸/丙酸 AA/PA
0 h	5.07^A	4.95^A	5.08^A	5.10^A	0.04	0.657	<0.001	<0.001
3 h	4.69^Ba	4.51^Ba	4.32^Bb	3.95^Bc	0.09	<0.001
6 h	4.14^Ca	3.94^Cb	3.54^Cc	3.24^Cd	0.11	<0.001
9 h	3.83^Da	3.61^Db	3.28^Dc	2.87^Dd	0.11	<0.001
12 h	3.31^Ea	3.21^Eb	3.00^Ec	2.59^Ed	0.08	<0.001
24 h	3.05^Fa	2.94^Fb	2.75^Fc	2.48^EFd	0.07	<0.001
36 h	2.89^Ga	2.73^Gb	2.60^Gc	2.38^Fd	0.06	<0.001
48 h	2.67^Ha	2.53^Hb	2.42^Hc	2.25^Gd	0.05	<0.001
72 h	2.52^Ia	2.44^Ib	2.34^Hc	2.20^Gd	0.04	<0.001

2.3 不同比例混合青贮体外发酵对营养物质降解率的影响

由表5可知,Ⅰ组的干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率显著低于其他3组(P<0.05),且随着混合青贮中残次香梨比例的升高,干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率也逐渐升高。

表5 不同比例混合青贮对体外发酵营养物质降解率的影响

Table 5 Effects of different proportions of mixed silage on in vitro fermentation degradation rate of nutrients %

项目 Items	组别 Groups				SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	P值 P-value
干物质降解率 DMD	56.40^d	58.40^c	61.60^b	63.86^a	0.87	<0.001
中性洗涤纤维降解率 NDFD	44.41^d	48.56^c	51.21^b	54.01^a	1.07	<0.001
酸性洗涤纤维降解率 ADFD	39.44^d	43.33^c	48.31^b	51.55^a	1.40	<0.001

	同行数据肩标不同小写字母表示不同组之间差异显著(P<0.05)。表6同。
	In the same row, values with different small letter superscripts mean significant differences among groups (P<0.05). The same as Table 6.

2.4 不同比例混合青贮对体外发酵多项组合效应值的影响

由表6可知,Ⅱ组MFAE显著低于Ⅲ组和Ⅳ组(P<0.05),Ⅲ组和Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。

表6 不同比例混合青贮对体外发酵多项组合效应值的影响

Table 6 Effects of different proportions of mixed silage on in vitro fermentation multiple combination effect values

项目 Items	组别 Groups			SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	P值 P-value
单项指标综合指数 SFAEI
pH	-0.68^a	-1.57^b	-2.43^c	0.13	0.002
氨态氮 NH₃-N	-4.47^a	-6.90^a	-11.31^b	0.86	<0.001
总挥发性脂肪酸 TVFA	0.56^b	0.84^b	3.44^a	0.27	<0.001
产气量 GP	14.92^c	22.47^b	25.98^a	1.52	<0.001
多项指标综合指数 MFAEI	10.34^b	14.85^a	15.68^a	1.16	<0.001

2.5 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物多样性分析

2.5.1 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物α多样性分析

由表7可知,9 h时Ⅰ组的Chao1指数和ACE指数显著高于其他3组(P<0.05);24 h时Ⅲ组和Ⅳ组的Chao1指数和ACE指数显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。青贮比例与发酵时间对Chao1指数和ACE指数存在显著交互作用(P<0.05)。

表7 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物α多样性分析

Table 7 Alpha diversity analysis of in vitro fermentation rumen microbiota of mixed silage with different proportions

项目 Items	组别 Groups				SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	比例 Proportion	时间 Time	比例×时间 Proportion× time
Chao1指数 Chao1 index
0 h	909.12^CDb	1 151.02^Aa	1 107.22^ABa	966.02^Cb	34.44	0.008	<0.001	<0.001
3 h	990.33^Ca	1 041.69^Ba	839.36^Cb	871.41^Db	28.98	0.009
6 h	842.92^Dab	886.31^CDa	917.05^Ca	777.83^Db	19.74	0.036
9 h	1 375.28^Aa	780.67^Dd	947.51^BCc	1 084.61^Bb	67.72	<0.001
12 h	995.86^Cb	1 111.71^ABab	1 026.33^Bb	1 161.45^ABa	24.92	0.035
24 h	861.42^Db	885.33^CDb	1 179.19^Aa	1 214.40^Aa	52.18	<0.001
36 h	946.88^CDa	932.67^Ca	964.21^BCa	796.37^Db	24.40	0.023
48 h	997.64^Ca	787.30^Dc	911.52^Cb	881.29^CDb	24.90	0.002
72 h	1 120.13^Ba	946.00^BCb	1 117.63^ABa	837.35^Dc	38.75	0.001
ACE指数 ACE index
0 h	912.39^Dc	1 153.63^Aa	1 109.42^Aa	968.47^Cb	30.39	<0.001
3 h	994.24^CDb	1 046.09^Ba	843.37^Dc	875.76^Dc	25.96	<0.001
6 h	846.85^Db	891.38^Cab	920.28^Ca	781.94^Ec	17.68	0.004
9 h	1 381.15^Aa	786.41^Dd	953.77^BCc	1 088.52^Bb	66.07	<0.001	<0.001	<0.001
12 h	999.81^Cc	1 118.11^ABab	1 028.45^Bbc	1 162.25^ABa	24.26	0.026
24 h	862.60^Db	883.43^Cb	1 184.34^Aa	1 218.15^Aa	50.95	<0.001
36 h	950.12^CDa	935.52^Ca	966.34^BCa	796.56^Ec	24.54	0.020
48 h	1 000.68^Ca	789.34^Dc	914.73^CDab	884.29^Dbc	26.87	0.014
72 h	1 126.56^Ba	950.52^Cb	1 124.25^Aa	839.09^DEc	40.13	0.002
Simpson指数 Simpson index
0 h	0.988 1^ABab	0.989 2^Aab	0.990 9^Aa	0.986 2^Ab	0.000 8	0.164	<0.001	0.025
3 h	0.987 3^AB	0.989 2^A	0.988 6^A	0.986 9^A	0.001 1	0.907
6 h	0.991 0^A	0.988 0^A	0.994 0^A	0.988 3^A	0.001 5	0.535
9 h	0.993 1^Aa	0.987 2^Ab	0.989 7^Aab	0.992 4^Aa	0.000 9	0.047
12 h	0.991 5^A	0.989 3^A	0.994 0^A	0.990 4^A	0.001 1	0.536
24 h	0.976 0^Cb	0.977 7^Bb	0.979 5^Bb	0.986 2^Aa	0.001 4	0.032
36 h	0.971 7^C	0.970 9^C	0.978 3^B	0.978 3^B	0.001 7	0.235
48 h	0.983 1^Bb	0.978 1^Bc	0.989 4^Aa	0.989 9^Aa	0.001 6	0.002
72 h	0.993 4^A	0.987 4^A	0.989 1^A	0.987 7^A	0.001 0	0.131
Shannon指数 Shannon index
0 h	8.19^Db	8.47^Aa	8.56^Ca	8.13^Cb	0.06	<0.001	<0.001	<0.001
3 h	8.05^Eb	8.29^Ba	8.03^Fb	7.91^Dc	0.04	<0.001
6 h	8.16^Db	7.93^Dc	8.51^Ca	7.92^Dc	0.07	<0.001
9 h	8.74^Aa	7.81^Ed	8.12^EFc	8.49^Bb	0.11	<0.001
12 h	8.47^Cb	8.25^Bc	8.67^Ba	8.46^Bb	0.05	<0.001
24 h	7.63^Fc	7.79^EFb	8.13^Ea	8.15^Ca	0.07	<0.001
36 h	7.59^Fc	7.71^Fb	7.83^Ga	7.74^Eb	0.03	<0.001
48 h	8.05^Eb	7.79^EFc	8.88^Aa	8.82^Aa	0.14	<0.001
72 h	8.65^Ba	8.16^Cb	8.26^Db	7.94^Dc	0.08	<0.001

3、6、12、36与72 h时各组的Simpson指数差异不显著(P>0.05);9 h时Ⅱ组的Simpson指数显著低于Ⅰ组和Ⅳ组(P<0.05);24 h时Ⅳ组的Simpson指数显著高于其他3组(P<0.05);48 h时Ⅲ组和Ⅳ组的Simpson指数显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。青贮比例与发酵时间对Simpson指数存在显著交互作用(P<0.05)。

9与72 h时Ⅰ组的Shannon指数显著高于其他3组(P<0.05);3 h时Ⅱ组的Shannon指数显著高于其他3组(P<0.05);6、12和36 h时Ⅲ组的Shannon指数显著高于其他3组(P<0.05);24和48 h时Ⅲ组和Ⅳ组的Shannon指数显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。青贮比例与发酵时间对Shannon指数存在显著交互作用(P<0.05)。

2.5.2 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物门水平分布

由表8可知,在各组瘤胃发酵液中,厚壁菌门、拟杆菌门与变形菌门相对丰度之和均达到90%以上,因此,厚壁菌门、拟杆菌门与变形菌门为优势菌。随着发酵时间的变化,厚壁菌门相对丰度先降低后升高,拟杆菌门与变形菌门相对丰度先升高后降低。

表8 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物门水平分布

Table 8 Distribution of in vitro fermentation rumen microbiota at phylum level of mixed silage with different proportions %

项目 Items	组别 Groups					SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ		Ⅲ	Ⅳ	SEM	比例 Proportion	时间 Time		比例×时间 Proportion×time
厚壁菌门 Firmicutes
0 h	58.75^Ca	56.00^Db	53.68^Bc		57.85^Ba	0.62	<0.001		<0.001	<0.001
3 h	52.88^Da	50.37^Fb	51.47^Cb		46.37^Ec	0.75	<0.001
6 h	35.25^Gd	37.38^Hc	44.19^Ga		39.56^Fb	1.01	<0.001
9 h	39.07^Fb	38.02^Hc	37.64^Hc		45.36^Ea	0.95	<0.001
12 h	47.00^Eb	45.49^Gc	47.32^Eb		49.89^Ca	0.50	<0.001
24 h	52.74^Db	54.52^Ea	54.07^Ba		47.43^Dc	0.86	<0.001
36 h	62.72^Ba	62.97^Aa	62.07^Aa		58.06^Bb	0.63	<0.001
48 h	64.39^Aa	61.64^Bb	49.74^Dc		48.14^Dd	2.15	<0.001
72 h	52.88^Db	59.80^Ca	45.28^Fc		59.58^Aa	1.80	<0.001
拟杆菌门 Bacteroidota
0 h	24.36^Hc	25.30^Ib	25.79^Ha		23.54^Gd	0.27	<0.001		<0.001	<0.001
3 h	29.10^Ebc	28.43^Fc	29.89^Eb		31.68^Ca	0.39	0.001
6 h	47.48^Aa	43.79^Ab	40.93^Bd		41.75^Ac	0.77	<0.001
9 h	38.74^Bc	42.42^Ba	41.68^Ab		35.74^Bd	0.80	<0.001
12 h	34.74^Dc	36.09^Cb	36.78^Ca		30.01^Dd	0.80	<0.001
24 h	27.20^Fc	29.83^Ea	28.23^Fb		28.37^Eb	0.30	0.001
36 h	27.13^Fbc	27.61^Gb	26.77^Gc		29.70^Da	0.35	<0.001
48 h	25.07^Gb	26.90^Ha	24.71^Ib		25.00^Fb	0.27	<0.001
72 h	35.61^Ca	30.53^Dc	34.70^Db		28.20^Ed	0.92	<0.001
变形菌门 Proteobacteria
0 h	10.99^Ec	12.26^Cb	13.02^Dab		13.96^Da	0.38	0.011		<0.001	<0.001
3 h	14.26^BCc	14.74^Bbc	15.05^Bb		18.33^Aa	0.49	<0.001
6 h	14.81^Bb	16.71^Aa	11.50^Eb		16.65^Ba	0.64	<0.001
9 h	16.99^Aa	16.96^Aa	17.59^Aa		15.05^Cb	0.31	<0.001
12 h	12.56^Dc	14.30^Bb	10.50^Fd		14.99^Ca	0.53	<0.001
24 h	13.79^Cb	9.66^Dd	11.33^Ec		16.87^Ba	0.82	<0.001
36 h	6.15^FGb	5.06^Fc	5.93^Gb		7.25^Fa	0.25	<0.001
48 h	6.45^Fc	7.13^Ec	14.30^Cb		15.50^Ca	1.24	<0.001
72 h	5.59^Gc	5.47^Fc	10.98^EFa		7.70^Eb	0.68	<0.001
髌骨菌门 Patescibacteria
0 h	2.75^Bbc	3.12^Ab	3.89^Aa		2.53^Cc	0.16	<0.001		<0.001	<0.001
3 h	1.91^Dab	2.51^Ba	2.04^Dab		1.74^Db	0.12	0.083
6 h	0.99^Eb	0.87^Db	1.48^Ea		1.09^Eb	0.08	0.001
9 h	1.68^Dab	1.75^Ca	1.40^Eb		1.83^Da	0.06	0.054
12 h	2.88^ABa	2.36^Bb	2.32^CDb		2.49^Cb	0.08	0.018
24 h	3.13^Ab	2.93^Ab	3.31^Bab		3.83^Aa	0.12	0.024
36 h	2.16^CDb	1.90^Cb	2.51^Ca		2.74^Ba	0.11	0.002
48 h	2.40^Ca	2.39^Ba	1.64^Ec		2.01^Db	0.10	<0.001
72 h	2.12^CDb	1.94^Cb	2.57^Ca		2.54^Ca	0.09	0.001
疣微菌门 Verrucomicrobiota
0 h	1.59^B	1.35^B		1.37^B	1.03^B	0.10	0.268		<0.001	<0.001
3 h	0.51^Db	1.02^Ca		0.31^Ec	0.48^CDbc	0.08	<0.001
6 h	0.22^E	0.15^E		0.25^E	0.16^D	0.02	0.135
9 h	0.44^DEa	0.18^Eb		0.51^DEa	0.39^Da	0.04	0.003
12 h	0.77^C	0.58^D		0.62^D	0.66^C	0.04	0.465
24 h	2.05^Aa	1.60^Ab		1.66^Ab	1.77^Aab	0.07	0.053
36 h	0.99^Cb	0.10^Fb		1.39^Ba	1.07^Bb	0.05	0.003
48 h	0.80^Cb	0.59^Db		1.84^Aa	1.85^Aa	0.18	<0.001
72 h	0.99^Cb	1.06^Cab		1.06^Cab	1.21^Ba	0.04	0.168

在3与48 h时Ⅰ组的厚壁菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在6 h时Ⅲ组的厚壁菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在9和12 h时Ⅳ组的厚壁菌门的相对丰度显著高于其他3组(P<0.05)。

在6和72 h时Ⅰ组的拟杆菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在9、24和48 h时Ⅱ组的拟杆菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在12 h时Ⅲ组的拟杆菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在3和36 h时Ⅳ组的拟杆菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05)。

在3、12、24、36和48 h时,Ⅳ组的变形菌门相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在24和36 h时Ⅱ组的变形菌门相对丰度显著低于其他3组(P<0.05);在12 h时Ⅲ组的变形菌门相对丰度显著低于其他3组(P<0.05);在9 h时Ⅳ组的变形菌门相对丰度显著低于其他3组(P<0.05)。

2.5.3 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物属水平分布

由表9可知,混合青贮体外发酵瘤胃微生物属水平的排名前10的物种中普雷沃氏菌属、理研菌科RC9肠道群和UCG_005为优势菌。其中,随着发酵时间的变化,普雷沃氏菌属相对丰度先升高后降低,各组普雷沃氏菌属相对丰度均在6 h时达到最高。在9、12和48 h时Ⅱ组的普雷沃氏菌属相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在72 h时Ⅰ组的普雷沃氏菌属相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);在3和36 h时Ⅳ组的普雷沃氏菌属相对丰度显著高于其他3组(P<0.05)。

表9 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物属水平分布

Table 9 Distribution of in vitro fermentation rumen microbiota at genus level of mixed silage with different proportions %

项目 Items	组别 Groups				SEM	P值 P-value
项目 Items	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	SEM	比例 Proportion	时间 Time		比例×时间 Proportion×time
普雷沃氏菌属 Prevotella
0 h	10.71^Ebc	10.44^Dc	11.10^Eb	12.62^Ea	0.26	<0.001	<0.001		<0.001
3 h	15.65^Cb	11.57^Cc	15.42^Cb	17.72^Ba	0.67	<0.001
6 h	23.59^Aa	23.42^Aa	21.67^Ac	22.12^Ab	0.25	<0.001
9 h	17.40^Bc	23.35^Aa	17.99^Bb	14.06^Cd	1.01	<0.001
12 h	11.74^Dd	15.12^Ba	13.47^Db	12.78^Dc	0.38	<0.001
24 h	8.17^Fc	10.26^Ea	10.66^Fa	8.95^Fb	0.31	<0.001
36 h	5.89^Gc	6.05^Fc	7.37^Gb	9.18^Fa	0.40	<0.001
48 h	4.34^Hb	4.65^Ga	3.68^Hc	3.82^Gc	0.12	<0.001
72 h	3.48^Ia	3.08^Hb	3.03^Ibc	3.01^Hc	0.77	<0.001
理研菌科RC9肠道群 Rikenellaceae_RC9_gut_group
0 h	3.71^G	3.63^G	3.53^H	3.54^F	0.04	0.479	<0.001		<0.001
3 h	5.34^Fc	6.55^Fa	5.80^Gb	4.63^Ed	0.22	<0.001
6 h	7.68^Ec	7.50^Ec	9.74^Ba	8.35^Cb	0.27	<0.001
9 h	8.46^CDb	7.99^Dc	8.44^Cb	8.90^Ba	0.11	0.005
12 h	8.62^Ca	8.39^Cab	7.51^DEc	8.20^Cb	0.13	0.001
24 h	8.17^Da	7.26^Eb	6.46^Fd	6.77^Dc	0.20	<0.001
36 h	7.60^Ec	9.55^Ba	7.69^Dc	8.82^Bb	0.25	<0.001
48 h	9.73^Ba	9.40^Ba	7.30^Eb	6.56^Dc	0.41	<0.001
72 h	14.97^Aa	13.10^Ab	10.33^Ac	13.44^Ab	0.51	<0.001
UCG_005
0 h	8.64^Db	7.73^Ec	6.44^Dd	9.36^Ba	0.34	<0.001	<0.001		<0.001
3 h	5.70^Eb	3.99^GHd	5.21^Ec	6.47^Ea	0.28	<0.001
6 h	3.49^Gab	3.75^Ha	2.01^Hc	3.23^Gb	0.20	<0.001
9 h	2.35^Hd	4.30^Ga	3.71^Fc	4.00^Fb	0.23	<0.001
12 h	4.09^Fb	5.39^Fa	3.21^Gc	2.51^Hd	0.33	<0.001
24 h	12.85^Bb	13.73^Ca	12.80^Bb	7.20^Dc	0.78	<0.001
36 h	15.78^Ab	16.83^Aa	13.17^Ac	13.38^Ac	0.47	<0.001
48 h	11.99^Cb	14.31^Ba	9.33^Cb	8.79^Cd	0.67	<0.001
72 h	5.97^Ec	9.56^Da	6.14^Dc	7.18^Db	0.43	<0.001
瘤胃球菌属 Ruminococcus
0 h	7.07^Cb	5.63^Dc	7.33^Cb	9.97^Ba	0.48	<0.001	<0.001		<0.001
3 h	12.44^Aa	11.46^Ab	11.14^Ab	8.47^Dc	0.45	<0.001
6 h	4.25^Dc	3.87^Ed	8.97^Ba	5.23^Eb	0.61	<0.001
9 h	7.17^Cb	6.63^Cc	6.87^Dbc	9.56^Ca	0.36	<0.001
12 h	10.00^Bb	7.92^Bd	8.84^Bc	12.30^Aa	0.50	<0.001
24 h	3.68^Eab	3.42^Fb	3.40^Fb	3.85^Fa	0.08	0.074
36 h	3.25^Fb	2.86^Gc	3.83^Ea	3.38^Gb	0.11	<0.001
48 h	3.56^Ea	2.82^Gb	2.10^Gc	1.96^Hc	0.20	<0.001
72 h	2.20^Gc	2.66^Gb	1.28^Hd	3.23^Ga	0.22	<0.001
未培养瘤胃细菌 Uncultured rumen bacterium
0 h	4.44^Ca	4.57^Ba	3.94^Cb	3.83^Bb	0.10	<0.001	<0.001		<0.001
3 h	2.47^Ec	3.57^Da	3.08^Eb	2.53^Dc	0.14	<0.001
6 h	2.47^Ec	2.18^Gd	3.59^Da	2.83^CDb	0.16	<0.001
9 h	3.47^Da	2.69^Fb	2.98^EFb	2.98^Cb	0.09	0.002
12 h	3.74^Da	3.04^Eb	3.45^Da	3.83^Ba	0.11	0.007
24 h	4.79^Bb	5.49^Aa	5.51^Aa	4.51^Ab	0.14	<0.001
36 h	3.54^Dc	4.18^Cb	4.61^Ba	4.70^Aa	0.15	<0.001
48 h	4.86^ABa	4.82^Ba	2.69^Fb	2.90^Cb	0.31	<0.001
72 h	5.15^Aa	4.77^Bb	5.31^Aa	4.10^Bc	0.15	<0.001
UCG_001
0 h	6.79^Aa	4.03^Ec	5.38^Cb	6.88^Aa	0.35	<0.001	<0.001		<0.001
3 h	5.76^Ca	5.63^Ba	5.64^Ba	4.70^Cb	0.14	<0.001
6 h	2.40^Fc	2.21^Gc	5.17^CDa	2.64^Fb	0.36	<0.001
9 h	2.94^Fc	2.85^Fc	3.18^Fb	3.75^Ea	0.11	<0.001
12 h	4.25^Da	3.83^Eb	3.42^Fc	4.02^Dab	0.10	0.001
24 h	4.45^Dc	4.31^Dc	5.06^Db	5.37^Ba	0.14	<0.001
36 h	6.61^Aa	5.21^Cc	6.18^Ab	4.64^Cd	0.24	<0.001
48 h	6.31^Ba	5.88^Ab	4.18^Ec	3.75^Ed	0.33	<0.001
72 h	3.90^Ec	5.08^Cb	3.34^Fd	6.77^Aa	0.39	<0.001
短波单胞菌属 Brevundimonas
0 h	3.51^Dc	4.99^Bb	5.38^Aa	3.28^Cc	0.28	<0.001	<0.001	<0.001
3 h	3.86^Cc	6.65^Aa	4.42^Bb	3.19^CDd	0.39	<0.001
6 h	1.30^Gc	1.84^Fb	3.53^Ca	2.00^Fb	0.25	<0.001
9 h	3.09^Ea	2.82^Ea	2.36^Db	3.00^Da	0.09	0.002
12 h	5.77^Aa	3.61^Cb	3.68^Cb	6.10^Aa	0.35	<0.001
24 h	4.45^Ba	3.30^Db	3.48^Cb	4.28^Ba	0.16	<0.001
36 h	1.71^Fb	1.77^Fb	2.44^Da	2.30^Ea	0.10	<0.001
48 h	3.59^Da	2.00^Fb	1.91^Eb	1.49^Gc	0.24	<0.001
72 h	0.80^Hc	1.24^Gb	1.72^Ea	1.71^Ga	0.12	<0.001
琥珀酸弧菌科UCG_002 Succinivibrionaceae_UCG_002
0 h	3.83^Bb	3.28^Dd	3.52^Ec	5.90^Ba	0.31	<0.001	<0.001	<0.001
3 h	3.56^Cc	3.29^Dd	4.00^Db	4.79^Ea	0.17	<0.001
6 h	3.69^BCc	4.21^Bb	2.06^Gd	5.50^Ca	0.37	<0.001
9 h	3.38^Cb	5.72^Aa	5.86^Ba	2.19^Hc	0.47	<0.001
12 h	2.38^Ec	4.34^Ba	2.72^Fb	4.11^Fa	0.26	<0.001
24 h	6.02^Aa	3.63^Cc	5.49^Cb	6.15^Aa	0.31	<0.001
36 h	2.97^Da	1.78^Fb	2.01^Gb	3.09^Ga	0.18	<0.001
48 h	1.78^Fc	2.80^Ea	1.91^Gc	2.10^Hb	0.12	<0.001
72 h	2.43^Ed	3.35^Dc	7.46^Aa	5.13^Db	0.58	<0.001
UCG_002
0 h	2.55^Ea	1.73^Fb	2.34^Da	2.41^Ea	0.10	<0.001	<0.001	<0.001
3 h	1.16^Fb	1.14^Hb	1.35^FGab	1.40^Ga	0.04	0.038
6 h	1.09^Fb	1.40^Gab	1.13^Gb	1.69^FGa	0.08	0.005
9 h	1.23^Fb	1.61^FGa	1.68^Ea	1.58^Ga	0.07	0.049
12 h	1.22^Fb	1.98^Ea	1.38^Fb	1.84^Fa	0.10	<0.001
24 h	5.82^Ba	5.00^Cc	4.09^Bd	5.57^Cb	0.20	<0.001
36 h	6.80^Ab	5.46^Bc	8.44^Aa	6.68^Bb	0.32	<0.001
48 h	5.01^Ca	4.75^Da	3.94^Bb	3.92^Db	0.15	<0.001
72 h	3.76^Dc	5.85^Ab	2.90^Cd	7.86^Aa	0.58	<0.001
未分类的F082 Unclassified_F082
0 h	1.32^Fa	1.37^Fa	1.15^Gb	1.05^Fb	0.04	0.006	<0.001	<0.001
3 h	0.72^Gc	1.36^Fa	1.07^Gb	0.64^Gc	0.09	<0.001
6 h	2.51^Eb	1.84^Ec	2.97^Da	1.97^Ec	0.14	<0.001
9 h	2.80^Da	2.53^Dab	2.32^Fb	2.61^Cab	0.07	0.039
12 h	3.30^Ca	2.69^Db	2.75^Eb	2.25^Dc	0.12	<0.001
24 h	4.30^Bb	5.15^Ba	3.70^Cc	4.16^Ab	0.16	<0.001
36 h	4.48^B	4.40^C	4.49^B	4.27^A	0.04	0.300
48 h	4.44^Bb	5.24^Ba	3.03^Dc	3.19^Bc	0.29	<0.001
72 h	7.66^Aa	5.70^Ab	5.06^Ac	4.11^Ad	0.39	<0.001
未分类的克里斯滕森菌科 Unclassified Christensenellaceae
0 h	2.19^Ca	1.24^Cd	1.47^Cc	1.85^Cb	0.11	<0.001	<0.001	<0.001
3 h	0.40^Eab	0.44^Eab	0.49^Da	0.34^Fb	0.02	0.125
6 h	0.39^Ea	0.21^Fc	0.38^DEa	0.32^Fa	0.03	0.009
9 h	0.48^Eb	0.79^Da	0.30^Eb	0.56^Eab	0.06	0.015
12 h	0.53^Ea	0.35^EFb	0.38^DEab	0.49^EFab	0.03	0.070
24 h	2.49^Ba	2.61^Ba	1.99^Bb	2.67^Aa	0.09	0.001
36 h	3.71^Aa	3.13^Ab	2.78^Ac	2.19^Bd	0.18	<0.001
48 h	2.50^Ba	2.66^Ba	1.68^Bb	1.44^Dc	0.16	<0.001
72 h	1.75^Dc	2.49^Bb	0.43^DEd	2.74^Aa	0.27	<0.001

3 讨论

3.1 不同比例混合青贮对体外发酵产气量与产气参数的影响

产气量是反映瘤胃发酵程度的重要指标,同时也体现出饲料中可利用的营养成分的含量,饲料中的可利用成分越多,发酵就越强,微生物的活性就越高^[14-15]。在本研究中,Ⅳ组的产气量在各时期均为最高,且慢速产气部分与潜在产气量均显著高于其他3组,这可能是由于Ⅳ组的混合青贮中残次香梨的比例较高,可溶性碳水化合物的含量较高,为瘤胃体外发酵提供了充足的底物,这与魏学盛等^[16]研究结果一致。

3.2 不同比例混合青贮对体外发酵参数的影响

pH是瘤胃发酵过程中的重要指标,影响瘤胃微生物的功能和生长繁殖,瘤胃液的pH在6.0~6.8,有利于维持瘤胃内环境的稳定^[17-18]。在本试验中,除0 h各组的pH略高之外其余各组均在范围内,这可能是由于体内和体外瘤胃发酵存在一些差异。

瘤胃NH₃-N含量是反映瘤胃发酵的重要指标,主要由饲料中的蛋白质降解产生,可作为瘤胃微生物的主要氮源,是反映微生物蛋白合成能力的指标^[19]。微生物生长最适宜的NH₃-N含量为6.30~27.50 mg/dL^[20]。本试验中,随着发酵时间的延长,各组NH₃-N含量逐渐增加,但都在适宜的范围内,且从24 h起,Ⅰ组的NH₃-N含量显著高于其他3组,这可能是由于Ⅰ组的粗蛋白质含量较高,能够为微生物提供较多的氮源,使Ⅰ组的NH₃-N含量高于其他3组。

VFA是瘤胃微生物发酵过程中产生的主要代谢产物,反刍动物进行生命活动所需70%~80%的能量由VFA提供,它不仅能反映瘤胃发酵的强弱,也是引起瘤胃pH变化的主要因素之一^[21]。其中乙酸、丙酸和丁酸约占VFA总量的95%左右,乙酸是反刍动物机体合成乳脂的主要成分,丙酸是合成葡萄糖的前体物质^[22-23]。本试验中,随着混合青贮中残次香梨的比例增加,除0 h外各时间点乙酸含量和乙酸/丙酸显著减少,总挥发性脂肪酸和丙酸含量差异显著。这可能与混合青贮的营养成分、可溶性碳水化合物以及纤维结构有关。

3.3 不同比例混合青贮体外发酵对营养物质降解率的影响

营养物质降解率是评定饲料营养价值的关键指标。干物质降解率与反刍动物采食量呈正相关^[24]。本试验中,随着混合青贮中残次香梨比例的增加,其干物质降解率逐渐升高,与72 h体外产气试验结果一致。中性洗涤纤维降解率和酸性洗涤纤维降解率反映了饲料中的纤维物质在瘤胃中消化的难易程度^[25]。在本试验中,随着混合青贮中残次香梨比例的增加,其中性洗涤纤维降解率和酸性洗涤纤维降解率逐渐升高,这可能与随着混合青贮中残次香梨比例的增加、可溶性碳水化合物含量增加有关。这与任澎等^[26]的研究结果一致。

3.4 不同比例混合青贮体外发酵瘤胃微生物组成的影响

饲粮是影响瘤胃微生物多样性的主要因素之一,其组成成分越复杂,微生物多样性就越高^[27]。本试验中,发酵72 h后,各组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数差异显著,Simpson指数差异不显著,且Ⅳ组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数显著低于其他3组,这可能与Ⅳ组混合青贮的可溶性碳水化合物的含量较高有关。有研究表明,提供易发酵的碳水化合物能够降低瘤胃细菌的丰富度和多样性^[28]。在本研究中,各组的优势菌门是厚壁菌门和拟杆菌门,这已被许多研究^[29⇓-31]所证实。并且,混合青贮比例与体外发酵时间都对厚壁菌门和拟杆菌门有显著的影响。

在本研究中,普雷沃氏菌属是瘤胃微生物中相对丰度最高的属。这与前人研究结果^[32]一致。普雷沃氏菌属属于拟杆菌门,可以利用非纤维性碳水化合物并降解蛋白质,并且在挥发性脂肪酸的合成中起到重要作用^[33-34]。本试验中,各组普雷沃氏菌属在6 h时相对丰度达到最高,然后开始逐渐降低,到72 h时相对丰度达到最低,且发酵72 h后,随着混合青贮中残次香梨比例的升高,普雷沃氏菌属的相对丰度逐渐降低。这可能与瘤胃液的pH有关。有研究表明,瘤胃中的普雷沃氏菌属相对丰度与pH呈负相关^[35]。

4 结论

混合青贮比例、体外发酵时间及其交互作用显著影响绵羊瘤胃体外发酵产气量、pH及NH₃-N、乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸含量与乙酸/丙酸。随着发酵时间的延长,pH逐渐降低,但均在正常范围内,没有酸中毒的风险。混合青贮中芦苇秸秆与残次香梨比例为40∶60时显著影响绵羊瘤胃体外发酵效果及微生物多样性的比例,但MFAEI在比例为60∶40时差异不显著。同时,瘤胃微生物组成也受到混合青贮比例与发酵时间的显著影响,在门水平上,优势菌群地位没有发生改变,但其相对丰度受混合青贮比例与发酵时间的显著影响;在属水平上,普雷沃氏菌属受混合青贮比例与发酵时间差异显著。在本试验条件下,混合青贮中芦苇秸秆与残次香梨比例为40∶60时其饲用价值较好。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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