在养猪生产中,外界环境刺激(细菌、毒素等)易使仔猪产生应激,造成仔猪腹泻或死亡,给养猪生产带来很大的经济损失。产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要致病菌之一。其中,ETEC K88是引起仔猪腹泻最主要的病原菌,它主要通过黏附于仔猪肠道上皮,释放毒素,造成仔猪肠道损伤[1]。研究表明,给断奶仔猪灌喂ETEC K88会导致其生长性能下降,肠道形态以及肠道屏障功能受损[2]。此外,Wen等[3]的研究表明,ETEC K88会导致仔猪肠道内抗氧化稳态失衡,并诱发炎症反应。
肠道损伤与细胞死亡关系密切。细胞凋亡和细胞焦亡都是典型的程序性细胞死亡方式。细胞凋亡主要有2条途径,即死亡受体途径和线粒体途径[4]。死亡受体途径起始于FasL与Fas受体结合,激活的受体通过适配蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)相互作用,导致Caspase的活化,活化的Caspase-8进一步激活其他Caspase,特别是Caspase-3,形成Caspase联级反应,最终导致细胞凋亡[5]。线粒体途径则是由于细胞内部发生信号导致线粒体膜通透性改变,线粒体上的孔道开放,细胞色素C释放,促进Caspase-9形成并被激活其他Caspase,最终导致细胞凋亡[6]。线粒体上孔道的开放与关闭受到B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma,Bcl)蛋白家族的调控,促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)等可以通过与线粒体内膜腺苷转位因子(adenine nucleotide translocator,ANT)或外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)的结合促进孔道的开放,而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合或直接阻止Bax与ANT、VDAC结合来抑制孔道的开放[4]。研究表明,镉可诱导小鼠肠道细胞凋亡,引起肠道损伤[7];敌草快可诱导猪小肠上皮细胞发生凋亡,提高肠道的通透性,破坏肠道紧密连接蛋白,从而引起肠道损伤[8]。细胞焦亡起始于炎性小体的组装,炎性小体通过消皮素D(gasdermin D,GSDMD)的切割以及白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)等细胞因子的激活引起细胞炎症性死亡[9]。细胞焦亡有Caspase-1依赖性的经典途径和Caspase-4/5/11依赖性的非经典途径[10]。研究表明,细胞焦亡与肠道损伤有密切关系,如肠伤寒沙门菌可活化Caspase-4/11,诱导感染肠伤寒沙门菌的肠道上皮细胞发生焦亡,并从肠道脱落[11];阪崎肠杆菌可通过调节含pyrin结构域NOD样受体家族3(NOD-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3)活化、上调Caspase-1、释放IL-1β和裂解GSDMD等复杂过程诱发细胞焦亡,进而引起肠道损伤[12]。
槲皮素(quercetin,Que)是一种广泛存在于植物体中具有多种生物活性的黄酮醇类化合物。Que具有多种药理作用和生物学功能,如抗炎、抗菌、抗癌、抗肿瘤、抗氧化以及降低血糖、血压等[13]。研究表明,饲粮中添加Que可提高仔猪的平均日增重和营养物质表观消化率[14];灌喂Que可有效缓解猪流行性腹泻病毒感染导致的仔猪肠道损伤,提高仔猪肠道抗氧化能力[15]。然而,目前关于Que对仔猪肠上皮细胞凋亡和焦亡信号通路影响的研究还非常有限。因此,本试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,探究Que对ETEC K88诱导的细胞损伤、细胞凋亡和焦亡信号通路的影响,以期为Que作为功能性饲料添加剂应用于仔猪生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
IPEC-1细胞,德克萨斯农工大学馈赠;槲皮素,购于Sigma-Aldrich公司;ETEC K88,购于中国兽医药品监察所,血清型为 O149:K91:K88ac;乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒,购于南京建成生物工程研究所;CCK8试剂盒,购于武汉丁香园科技有限公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、IL-18 ELISA试剂盒,购于北京四正柏生物科技有限公司;DMEM/F-12培养基,购于HyClone公司;RNAiso Plus裂解液、PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM RT-PCR试剂盒、无酶水,购于日本TaKaRa公司;氯仿、异丙醇和乙醇,购于国药集团;DEPC水,购于Biosharp公司;磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS),购于HyClone公司;谷氨酰胺(Gln)溶液(200 mmol/L)、青链霉素混合液(PSF)、胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)(100×)、表皮生长因子(EGF)和胰酶(0.25%,0.9 mmol EDTA),购于Gibco公司;75 cm2细胞培养瓶、100 mm培养皿、60 mm培养皿、6孔细胞培养板、12孔细胞培养板、96孔细胞培养板、15 mL无菌离心管、50 mL无菌离心管、10 mL无菌移液管、细胞刮、2.0外旋冻存管,购于Corning公司;无菌EP管(200 μL、1.5 mL、2 mL),购于KIRGEN公司。
1.2 细菌培养
从-80 ℃中取出冻存的细菌置于37 ℃水浴复苏,吸取10 μL浓度为5×106 CFU/mL的ETEC K88菌液,加入到含有10 mL LB液体培养基的细菌瓶中,放入37 ℃恒温摇床,培养12 h。将复壮菌液用接种环于培养皿上划线,于37 ℃恒温培养箱培养30 min,倒置过夜。取长有单菌落的培养皿,挑选单菌落加入含有10 mL LB液体培养基的细菌瓶中,混匀,放入37 ℃恒温摇床,120 r/min培养12 h用以后续试验。
取1 mL培养好的菌液加入到1.5 mL无菌EP管中,6 124×g离心5 min,弃上清,加入1 mL PBS,涡旋离心,重复3次后,再加入1 mL PBS,吹打均匀,取300 μL悬浊液加入无菌96孔细胞培养板,使用酶标仪测量600 nm处的吸光度(OD)值,对比生长曲线,确定细菌个数。
1.3 细胞培养
将冻存的IPEC-1细胞置于37 ℃恒温水浴锅解冻,吸取1 mL细胞液于无菌EP管,加入1 mL 10%细胞完全培养基,离心,接着将细胞加入含有2 mL细胞完全培养基的25 cm2培养瓶中,摇晃均匀,置于5% CO2、37 ℃的培养箱中,每天更换1次培养基。当细胞贴壁覆盖率达到70%~80%后,对细胞进行传代培养,直至2~3代细胞状态稳定后用于正式试验。
1.4 细胞活力的测定
将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板,分为4组:对照组(细胞先用PBS处理24 h,再用含PBS的无抗培养液处理2 h)、Que组(细胞先用Que处理24 h,再用含PBS的无抗培养液处理2 h)、ETEC K88组(细胞先用PBS处理24 h,再用含ETEC K88的无抗培养液处理2 h)、Que+ETEC K88组(细胞先用Que处理24 h,再用含ETEC K88的无抗培养液处理2 h),每组8个重复。用细胞完全培养基培养细胞至覆盖底部70%~80%后,先用PBS或10 μmol/L Que处理细胞24 h,再加入含PBS或5×106 CFU/mL ETEC K88的无抗培养液处理2 h,然后用PBS清洗2遍,接着加入100 μL完全培养基(含10% CCK8),避光孵育1.5 h后,取出,使用自动酶标仪在450 nm波长下读取OD值。
1.5 细胞上清液中LDH活性的测定
将细胞以1×105个/mL的密度接种于12孔细胞培养板,分为4个组,每组4个重复,分组处理同1.4。处理结束后收集上清液,根据LDH试剂盒说明书检测LDH活性。
1.6 细胞中炎性因子含量的测定
将细胞以1×105个/mL的密度接种于6孔细胞培养板,分为4个组,每组4个重复,分组处理同1.4。处理结束后收集细胞,按照ELISA试剂盒说明书步骤检测IL-1β、IL-18和TNF-α含量。
1.7 细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因mRNA表达水平的测定
将细胞以1×105个/mL的密度接种于12孔细胞培养板,分为4个组,每组4个重复,分组处理同1.4。处理结束后弃培养液,用PBS清洗细胞2次,每孔加入500 μL RNAiso Plus裂解液,室温静置3 min,然后吹打吸取细胞裂解液于1.5 mL无菌EP管中,放入-80 ℃冰箱保存待测。按照RNAiso Plus说明书提取细胞总RNA,使用PCR仪将总RNA反转录成cDNA,并在-20 ℃保存备用。以β-肌动蛋白(β-actin)为参比基因,使用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因FasL、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-xL、NLRP3、Caspase-1、IL-18、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、GSDMD、NLR家族CARD结构域4(NLRC4)的mRNA表达水平。PCR引物序列见表1。
表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR |
| 基因 Genes | 引物序列 Primer sequences (5'—3') | 登录号 Accession number | 产物大小 Product size/bp |
|---|---|---|---|
| 凋亡相关因子配体 FasL | F:TCCTCTTCCTCTTGCCATAGA R:CGAAGCCATTCCGAGTCTG | BH168716.1 | 148 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 Caspase-3 | F:ACCCAAACTTTTCATAATTCA R:ACCAGGTGCTGTAGAATATGC | NM_214131.1 | 145 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 Caspase-9 | F:AACCAGTAGACAAGCAACAA R:TGAATCCTCCAGAACCAATG | XM_013998997.2 | 209 |
| B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白 Bax | F:CTACCAAGAAGTTGAGCGAGTG R:CCAGTTGAAGTTGCCGTCAG | XM_003127290.5 | 158 |
| B细胞淋巴瘤-xL Bcl-xL | F:GCAACCCATCCTGGCACCT R:TCAAACTCATCGCCCGCCT | XM_021077302.1 | 136 |
| 含pyrin结构域NOD样受体家族3 NLRP3 | F:TCCACACTTCTGACTTCTARAC R:CCTGCTTCCACCACTACT | NM_001256770.2 | 241 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 Caspase-1 | F:GAAGGAGAAGAGGAGGCTGTT R:AGATTGTGAACCTGTGGAGAGT | NM-214162.1 | 263 |
| 白细胞介素-18 IL-18 | F:AGTAACCATCTCTGTGCAGTGT R:TCTTATCATCATGTCCAGGAAC | AF191088.1 | 155 |
| 凋亡相关斑点样蛋白 ASC | F:CTTGTGCTGCGTGACATC R:TGCCTGGTACTGCTCTTC | AB873106.1 | 237 |
| 消皮素D GSDMD | F:GTGTTGACCTGTCCATCTG R:TGACCTCCACCTCCTTCT | XM_021090506.1 | 351 |
| NLR家族CARD结构域4 NLRC4 | F:GTCCAATGGGAGGGACATGAA R:GAATCCCGCTCGACCTTCTC | XM_021088408.1 | 162 |
| β-肌动蛋白 β-actin | F:TGCGGGACATCAAGGAGAAG R:AGTTGAAGGTGGTCTCGTGG | AF017079.1 | 194 |
1.8 统计方法
试验数据采用SPSS 23.0软件进行2×2因子分析,模型主效应包括Que和ETEC K88以及两者互作效应。当Que与ETEC K88有互作效应时,采用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05时认为有显著性差异。
2 结果
2.1 Que对ETEC K88刺激细胞损伤的影响
由图1-A可知,ETEC K88刺激显著降低了细胞活力(P<0.05)。Que与ETEC K88对细胞活力的影响无互作效应(P>0.05)。与对照组相比,Que可显著提高细胞活力(P<0.05);与ETEC K88组相比,Que可显著提高ETEC K88刺激细胞活力(P<0.05)。由图1-B可知,与对照组相比,ETEC K88刺激显著提高了细胞上清液中LDH活性(P<0.05)。Que与ETEC K88对细胞上清液中LDH活性的影响存在互作效应(P<0.05)。与对照组相比,Que对细胞上清液中LDH活性无显著影响(P>0.05);而与ETEC K88组相比,Que可显著降低ETEC K88刺激细胞上清液中LDH活性(P<0.05)。
图1 Que对ETEC K88刺激细胞活力和细胞上清液中LDH活性的影响CON:对照;Que:槲皮素;ETEC K88:产肠毒素大肠杆菌K88 。数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。 Fig.1 Effects of Que on cell viability and LDH activity in supernatants of cells stimulated by ETEC K88 CON: control; Que: quercetin; ETEC K88: enterotoxigenic Escherichia coli K88. Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below. |
2.2 Que对ETEC K88刺激细胞中炎性因子含量的影响
由图2可知,与对照组相比,ETEC K88刺激显著提高了细胞中炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α的含量(P<0.05)。Que与ETEC K88对细胞中IL-1β、IL-18和TNF-α含量的影响存在互作效应(P<0.05)。与对照组相比,Que可显著降低细胞中IL-1β的含量(P<0.05),对IL-18和TNF-α的含量无显著影响(P>0.05);而与ETEC K88组相比,Que可显著降低ETEC K88刺激细胞中IL-1β、IL-18和TNF-α的含量(P<0.05)。
2.3 Que对ETEC K88刺激细胞中细胞凋亡信号通路相关基因表达的影响
由图3可知,与对照组相比,ETEC K88刺激显著提高了细胞中细胞凋亡信号通路相关基因FasL、Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA表达水平(P<0.05),显著降低了Bcl-xL的mRNA表达水平(P<0.05)。Que与ETEC K88对细胞中FasL、Caspase-9、Bax和Bcl-xL的mRNA表达水平的影响存在互作效应(P<0.05)。与对照组相比,Que对细胞中FasL、Caspase-9、Bax和Bcl-xL的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05);而与ETEC K88组相比,Que显著降低了ETEC K88刺激细胞中FasL、Caspase-9和Bax的mRNA表达水平(P<0.05),显著提高了Bcl-xL的mRNA表达水平(P<0.05)。
2.4 Que对ETEC K88刺激细胞中细胞焦亡信号通路相关基因表达的影响
由图4可知,与对照组相比,ETEC K88刺激显著提高了细胞中细胞焦亡信号通路相关基因NLRP3、IL-18、GSDMD、NLRC4的mRNA表达水平(P<0.05),显著降低了Caspase-1的mRNA表达水平(P<0.05)。Que与ETEC K88对细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-18、GSDMD、NLRC4的mRNA表达水平的影响存在互作效应(P<0.05)。与对照组相比,Que显著降低了细胞中Caspase-1的mRNA表达水平(P<0.05),对NLRP3、IL-18、GSDMD和NLRC4的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05);而与ETEC K88组相比,Que显著提高了ETEC K88刺激细胞中Caspase-1的mRNA表达水平(P<0.05),显著降低了NLRP3、IL-18、GSDMD、NLRC4的mRNA表达水平(P<0.05)。
3 讨论
3.1 Que对ETEC K88诱导的细胞损伤的影响
3.2 Que对ETEC K88诱导的细胞炎症反应的影响
3.3 Que对ETEC K88诱导的细胞凋亡信号通路的影响
细胞凋亡主要有细胞膜上的死亡受体途径和胞质内的线粒体途径[4]。细胞膜上的死亡受体途径起始于Fas受体与FasL的结合,随后形成死亡诱导信号复合体(death-inducing signaling complex,DISC),激活Caspase,发生Caspase联级反应,最终导致细胞凋亡[5]。胞质内的线粒体途径则依赖于线粒体膜通透性转换孔的开放与关闭,其中,促凋亡蛋白Bax可通过促进线粒体膜通透性转换孔的开放诱导细胞凋亡的发生,而抗凋亡蛋白Bcl-xL则可以通过抑制线粒体膜通透性转换孔的开放抑制细胞凋亡[4]。本试验结果显示,Que可显著缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞促凋亡因子的mRNA表达水平的上升和抗凋亡因子的mRNA表达水平的下降。Que已被证明与细胞凋亡存在密切的关系,例如,Que可降低LPS和玉米赤霉烯酮诱导的IPEC-J2细胞Bax基因的表达水平,抑制细胞凋亡[22]。这与本试验结果一致。总之,Que可缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞凋亡信号通路的激活。
3.4 Que对ETEC K88诱导的细胞焦亡信号通路的影响
细胞焦亡有依赖炎性小体激活的经典通路和不依赖炎性小体激活的非经典通路[10]。其中,经典途径依赖于ASC募集pro-Caspase-1,组装炎性小体,NLRC4激活Caspase-1,活化的Caspase-1剪切炎性因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18,促进IL-1β和IL-18的成熟与释放,招募更多的炎症细胞聚集,最终诱导细胞焦亡。本课题组前期的一篇文章报道了Que与ETEC K88诱导的细胞焦亡的关系[23]。由本试验结果可知,Que可缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞中IL-1β和IL-18含量的升高,而Que可显著抑制ETEC K88诱导的IPEC-1细胞中焦亡信号通路相关基因的表达。因此,本研究证明了Que可缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞焦亡信号通路的激活。
4 结论
Que可缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞损伤和炎症反应,抑制细胞凋亡和焦亡信号通路的激活。
京公网安备 11010802041926号
