动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 10: 6732 - 6743

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.573

研究论文

白术对肉种鸡肝脏的保护作用

  • 何家玉 ,
  • 李冰心 ,
  • 曹楠 ,
  • 潘诗柔 ,
  • 陈天琪 ,
  • 谢凌峰 ,
  • 付新亮 ,
  • 田允波 ,
  • 许丹宁 ,
  • 李婉雁 , *
展开
  • 仲恺农业工程学院动物科技学院,广州 510225
*李婉雁,副教授,硕士生导师,E-mail:

何家玉(1999—),女,安徽六安人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2024-04-30

  网络出版日期: 2024-10-14

基金资助

国家自然科学基金(32102747)

广东省自然科学基金面上项目(2022A1515010677)

仲恺农业工程学院大学生创新创业训练计划项目(X202311347024)

收起

Protective Effects of Atractylodes macrocephala on Liver of Broiler Breeders

  • HE Jiayu ,
  • LI Bingxin ,
  • CAO Nan ,
  • PAN Shirou ,
  • CHEN Tianqi ,
  • XIE Lingfeng ,
  • FU Xinliang ,
  • TIAN Yunbo ,
  • XU Danning ,
  • LI Wanyan , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2024-04-30

  Online published: 2024-10-14

Fold

摘要

本试验旨在探究饲粮中添加白术对高强度产蛋肉种鸡肝脏氧化应激损伤和细胞凋亡的影响,阐明白术对肉种鸡产蛋高峰后肝脏损伤的保护作用,为开发绿色饲料添加剂提供依据。选用360只健康状况良好、体重相近的31周龄天露清远麻鸡2号肉种鸡,随机分为3组,每组10个重复,每个重复12只鸡。对照组(CON组)饲喂基础饲粮,饮水为蒸馏水;白术组(AMK组)饲喂在基础饲粮的基础上添加15 g/kg白术粉的饲粮,饮水为蒸馏水,白术添加时长为21 d;抗生素组(AB组)饲喂基础饲粮,饲养到第16天,于饮水中添加3 g/L的盐酸大观霉素和盐酸林可霉素可溶性粉,连用5 d。AMK组和AB组停药7 d(期间各组均饲喂基础饲粮,饮水为蒸馏水),采集肝脏组织。结果表明:1)肝脏组织超微结构观察结果显示,CON组和AMK组肝脏组织细胞结构正常、完整,形态良好;而AB组肝细胞发生皱缩,出现凋亡小体。2)与CON组相比,AB组血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性显著提高(P<0.05);与AB组相比,AMK组血清ALT活性显著降低(P<0.05)。3)与CON组和AB组相比,AMK组肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著提高(P<0.05)。4)与CON组相比,AB组肝细胞凋亡率显著提高(P<0.05);与AB组相比,AMK组肝细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。5)与CON组相比,AB组肝脏胱天蛋白酶8(Caspase8)、胱天蛋白酶9(Caspase9)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2同源拮抗剂抗体(Bak)和B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量以及Bax的蛋白相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏胱天蛋白酶3(Caspase3)、Caspase8和Caspase9的蛋白相对表达量显著降低(P<0.05);AMK组肝脏Caspase8、Bak和Bax的mRNA相对表达量和Bcl-2的蛋白相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏Caspase8、Caspase9和Bak蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加15 g/kg白术粉可通过增强肉种鸡机体抗氧化能力和减少肝细胞凋亡,从而缓解肉种鸡因高强度产蛋诱导的肝脏损伤。

关键词： 肉种鸡; 白术; 肝脏; 抗氧化; 细胞凋亡

本文引用格式

何家玉 , 李冰心 , 曹楠 , 潘诗柔 , 陈天琪 , 谢凌峰 , 付新亮 , 田允波 , 许丹宁 , 李婉雁 . 白术对肉种鸡肝脏的保护作用[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(10) : 6732 -6743 . DOI: 10.12418/CJAN2024.573

Abstract

The aim of this study was to investigate the effects of dietary Atractylodes macrocephala on oxidative stress injury and apoptosis in liver of high-intensity laying broiler breeders, to clarify the protective effects of Atractylodes macrocephala on liver injury of broiler breeders after laying peak, and to provide evidence for the development of green feed additives. A total of 360 healthy 31-week-old Tianlu Qingyuan partridge No.2 broiler breeders with similar body weight were randomly divided into 3 groups with 10 replicates per group and 12 chickens per replicate. Chickens in the control group (CON group) were fed a basal diet and the drinking water was distilled water; those in Atractylodes macrocephala group (AMK group) were fed the basal diet supplemented with 15 g/kg of Atractylodes macrocephala powder for 21 days, and the drinking water was distilled water; and those in antibiotic group (AB group) were fed the basal diet and 3 g/L of daguanomycin hydrochloride and lincomycin hydrochloride soluble powder was added to drinking water from the 16th day for 5 days. After a 7-day withdrawal period (all groups were fed the basal diet and the drinking water was distilled water) in AMK group and AB group, the liver tissues were collected. The results showed as follows: 1) the ultrastructure of liver tissues showed that the liver cells in CON group and AMK group were normal, complete and well-formed, and those in AB group were wrinkled and apoptotic bodies appeared. 2) Compared with CON group, the activities of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in AB group were significantly increased (P<0.05); compared with AB group, the serum ALT activity in AMK group was significantly decreased (P<0.05). 3) Compared with CON group and AB group, the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in liver in AMK group were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with CON group, the apoptosis rate of hepatocytes in AB group was significantly increased (P<0.05); compared with AB group, the apoptosis rate of hepatocytes in AMK group was significantly decreased (P<0.05). 5) Compared with CON group, the mRNA relative expression levels of Caspase 8, Caspase 9, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 homologous antagonist antibody (Bak), B-cell lymphoma-2-associated X protein (Bax) and the protein relative expression level of Bax in liver in AB group were significantly increased (P<0.05), and the protein relative expression levels of Caspase 3, Caspase 8 and Caspase 9 in liver were significantly decreased (P<0.05); the mRNA relative expression levels of Caspase 8, Bak and Bax and the protein relative expression level of Bcl-2 in liver in AMK group were significantly increased (P<0.05), and the protein relative expression levels of Caspase 8, Caspase 9 and Bak in liver were significantly decreased (P<0.05). In conclusion, dietary 15 g/kg Atractylodes macrocephala powder can enhance antioxidant capacity and reduce hepatocyte apoptosis of broiler breeders, thereby alleviating liver injury induced by high-intensity laying.

Key words： broiler breeders; Atractylodes macrocephala; liver; antioxidant; apoptosis

一般而言,肉种鸡的饲养周期相对较长,在经过高负荷、高强度代谢的产蛋高峰期后,体内代谢和生理功能逐渐退化、衰老,对各种应激敏感,免疫功能和生产性能大大降低[1],这也增加了肉种鸡炎症损伤的风险,而肝脏作为肉种鸡的重要代谢器官,脂质代谢旺盛,极易发生代谢性氧化损伤,导致脂肪肝等病症发生。研究发现,长期产蛋所积累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)是导致产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质下降的主要原因[2];同时,在养殖过程中,养殖场和生产企业为了提高生产效率,都会选择集约化饲养模式,这使鸡的生理和环境压力大大提高[3],易导致各种疾病发生。因此,在畜牧业中,抗生素作为饲料添加剂,广泛用于疾病预防、营养增效以及养殖优化等诸多领域[4]。然而,抗生素的不规范使用会导致严重后果,全球各国因此强化对抗生素使用的监控,限制其使用范围及剂量。2020年,我国宣布全面禁止在饲料中添加抗生素,此举旨在减少养殖业对抗生素的滥用。在此背景下,研发既安全高效、又符合绿色环保理念的创新型饲料添加剂成为养殖业发展的必然趋势。
中草药中含有丰富的多糖和其他活性成分,可以改善机体新陈代谢和预防动物疾病[5]。研究表明,在饲粮中添加中草药类成分,能够显著提高蛋鸡生产性能、蛋品质、养分利用率和免疫力[6]。白术是一种重要的中药材,目前有不少学者对白术进行了研究,发现其有多种药物优势和药理活性,对白术的开发和利用有着重要的意义。据报道,白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗和安胎的功效,主要用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗及胎动不安[7]。历史上也常使用白术来预防或者治疗瘟疫。现代研究表明,白术主要化学成分为挥发油、白术内酯类及白术多糖类等,具有调节胃肠功能、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、提高免疫力、保肝以及改善和治疗糖尿病的作用[8]。白术多糖作为白术发挥其生物活性的主要成分,药理研究证实其具有促生长、抗氧化、抗肿瘤、抗应激以及增强免疫力等作用[9⇓-11]。因此,本研究通过进一步探究白术对肉种鸡产蛋高峰后肝脏损伤的保护作用,为指导肉种鸡的高效生产提供解决方法,也为白术作为绿色饲料添加剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用浙白术,将其晒干,经高速粉碎机粉碎,过60目筛,得白术粉末。浙白术主要营养成分含量如下:水分8.00%,粗蛋白质9.42%,钙0.67%,总磷0.27%,粗多糖14.85%,葡萄糖0.30%,果糖4.80%,蔗糖2.80%。

1.2 试验设计和基础饲粮

选用360只健康状况良好、体重相近的31周龄天露清远麻鸡2号肉种鸡(由温氏集团高村温氏鸡场提供),随机分为3组,每组10个重复,每个重复12只鸡。对照组(CON组)肉种鸡饲喂基础饲粮,饮水为蒸馏水;白术组(AMK组)饲喂在基础饲粮的基础上添加15 g/kg白术粉(根据中药白术的禽用剂量[12]以及禽类每日采食量而拟方确定)的饲粮,饮水为蒸馏水,白术添加时长为21 d;抗生素组(AB组)饲喂基础饲粮,饲养到第16天,于饮水中添加3 g/L的盐酸大观霉素和盐酸林可霉素可溶性粉(购自鹏迪兽药饲料公司),现配现用,连用5 d。AMK组和AB组停药7 d,采集肝脏组织。停药期间各组肉种鸡饲喂基础饲粮,饮水为蒸馏水。
本试验选用玉米-豆粕型颗粒状配合饲粮,基础饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和《中国饲料成分及营养价值表(2019年第30版)》配制,其组成及营养水平见表1。饲粮中粗蛋白质含量参照《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)测定,粗脂肪含量参照《饲料中粗脂肪的测定》(GB/T 6433—2006)测定,钙含量参照《饲料中钙的测定》(GB/T 6436—2018)测定,总磷含量参照《饲料中总磷的测定 分光光度法》(GB/T 6437—2018)测定,赖氨酸含量参照《饲料有效赖氨酸测定方法》(GB/T 15398—1994)测定;饲粮代谢能参考《中国饲料成分及营养价值表(2019年第30版)》,根据原料组成计算所得。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
原料 Ingredients
玉米 Corn 60.55
豆粕 Soybean meal 23.90
玉米蛋白粉 Corn gluten meal 2.60
石粉 Limestone 8.00
大豆油 Soybean oil 2.35
磷酸氢钙 CaHPO4 1.60
预混料 Premix1) 1.00
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels2)
代谢能 ME/(MJ/kg) 11.77
粗蛋白质 CP 17.04
粗脂肪 EE 5.11
钙 Ca 3.45
总磷 TP 0.71
赖氨酸 Lys 0.82

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:VA 12 000 IU,VD3 5 000 IU,VB1 3.0 mg,VB2 5.0 mg,VK 2.0 mg,VE 30.0 mg,VB12 1.0 mg,烟酸 nicotinicacid 30.0 mg,泛酸 pantothenic acid 80.0 mg,叶酸 folic acid 50.0 mg,生物素 biotin 0.2 mg,胆碱 choline 500.0 mg,Fe (as ferrous sulfate) 100.0 mg,Cu (as copper sulfate) 80.0 mg,Mn (as manganese sulfate) 100.0 mg,I (as potassium iodide) 0.42 mg,Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)代谢能为计算值,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 饲养管理

饲养试验在仲恺农业工程学院钟村教育科学研究基地进行,采用笼养方式,所有试验鸡饲养于同一舍内,饲粮现拌现用,鸡只自由采食和饮水,光照充足。

1.4 样品采集和指标测定

1.4.1 样品采集及处理

停药7 d后,每个重复选取1只鸡进行屠宰取样,心脏采血,于37 ℃放置30 min后,1 000×g离心5 min,收集血清,于-80 ℃冰箱保存备用;采集肝脏组织,液氮保存。

1.4.2 肝脏组织超微结构观察

将用于超微结构观察的肉种鸡肝脏组织固定在2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)中,后固定于1%四氧化三锇中2 h,经过脱水、浸透、包埋、固化后制备切片,采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅分别进行染色,在透射电镜下观察肉种鸡肝脏组织超微结构。

1.4.3 肝脏功能相关指标测定

采用生化法测定肉种鸡血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性。

1.4.4 肝脏抗氧化指标测定

采用南京建成生物工程研究所试剂盒,利用多功能酶标仪测定肉种鸡肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 肝细胞凋亡率测定

采用Tunel法测定肝细胞凋亡率,取石蜡切片脱蜡水化,滴加蛋白酶K,室温孵育20 min,PBS(pH 7.4)洗涤3次,滴加反应液,37 ℃恒温箱孵育1 h,PBS洗涤3次后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞核,封片后立即于荧光显微镜下观察并采集图像。DAPI染出来的细胞核在紫外线的激发下为蓝色,试剂盒为异硫氰酸荧光素(FITC)标记,阳性凋亡细胞核为绿色,采用ImageJ 1.5.2软件计算肝细胞凋亡率。

1.4.6 肝脏凋亡相关基因mRNA相对表达量测定

采用Trizol RNA提取试剂盒(美国Glpbio公司)提取肉种鸡肝脏组织中的总RNA,用超微量分光光度计来检测其质量和浓度,选择质量和纯度较好的RNA,按照StarScript Ⅲ一管化去基因组反转录预混液试剂盒(深圳荧光生物科技有限公司)的操作步骤进行操作,将RNA反转录为cDNA后放入-20 ℃冰箱中保存备用,剩余部分于-80 ℃冰箱保存。
在国家生物技术信息中心(NCBI)网站查找所需要的基因序列,并设计合成引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,本试验的基因引物序列见表2。以cDNA为模板,使用qPCR预混液(深圳荧光生物科技有限公司)和QuantStudio 7荧光定量PCR仪进行检测,反应条件设定为:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,40个循环。实时荧光定量PCR反应体系见表3。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,应用2-ΔΔCt法计算胱天蛋白酶3(Caspase3)、胱天蛋白酶8(Caspase8)、胱天蛋白酶9(Caspase9)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2同源拮抗剂抗体(Bak)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量。其中,ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值;ΔΔCt=试验组ΔCt值-对照组ΔCt值。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequences

引物名称
Primer names		 登录号
Accession No.		 引物序列
Primer sequences (5'—3')
β-肌动蛋白
β-actin		 NM_205518.2 F:CTGACTGACCGCGTTACTCC
R:CATACCAACCATCACACCCTGA
胱天蛋白酶3
Caspase3		 XM_046915477.1 F:TAGCGGGGAAACCCAAACTC
R:AGGAGTAGTAGCCTGGAGCA
胱天蛋白酶8
Caspase8		 AY057939.2 F:GGGTGTCTCCGTTCAGGTAT
R:TCTCAATGAAAACGTCCGGC
胱天蛋白酶9
Caspase9		 XM_046931415.1 F:GCCTGTGGAGGAGAACAAAAG
R:GTCTGGCTCGTCCTCATTCC
B淋巴细胞瘤-2
Bcl-2		 XM_046910476.1 F:GATCGTCGCCTTCTTCGAGT
R:ATTCCACAAAGGCATCCGGT
Bcl-2同源拮抗剂抗体
Bak		 XM_046932962.1 F:TTAGTGGTACGACGCTTCTTCAGG
R:CCCGTGATGCCTTGCTGGTAG
B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白
Bax		 XM_040693907.2 F:GAGTGGGGAGCGTTCGAG
R:GGTGGAGGCTGAGATATGGG
表3 实时荧光定量PCR反应体系

Table 3 RT-qPCR reaction system

项目
Items		 体积
Volume
cDNA 1 μL
2×PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 10 μL
上游引物 Forward primer (10 μmol/L) 1 μL
下游引物 Reverse primer (10 μmol/L) 1 μL
ddH2O 补足至20 μL

1.4.7 肝脏凋亡相关基因蛋白相对表达量测定

称取0.1 g肉种鸡肝脏组织于2 mL EP管中,以50∶1∶1∶1的比例将增强型放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液与蛋白酶抑制剂(碧云天)、磷酸酶抑制剂和乙二胺四乙酸(EDTA)混合后取1 mL预混液加入EP管,同时加入2颗小钢珠,充分研磨,4 ℃、13 800×g离心15 min,离心完成后抽取上清液并转移至新的离心管;随后根据二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,根据测得的蛋白浓度调整样品的上样量,使蛋白的上样量为20 μg;上样电泳,转膜封闭,4 ℃条件下分别用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和对应的一抗过夜孵育,用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)充分洗膜,进行二抗孵育1 h后加入配制好的增强化学发光(ECL)显色液并使用化学发光成像系统对蛋白条带进行曝光拍照,采用ImageJ 1.5.2软件进行量化分析。Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Bak、Bax和GAPDH抗体以及二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Tukey法进行组间多重比较,采用GraphPad Prism 9.0软件对试验数据进行作图,结果数据以“平均值±标准差”形式表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 白术对肉种鸡肝脏组织超微结构的影响

如图1所示,CON组肉种鸡肝脏组织细胞结构正常、完整,形态良好,细胞器内含量丰富,核膜清晰;AB组肝脏组织较CON组发生了明显的病理变化,线粒体肿胀、空泡化,肝细胞染色质开始边集,细胞轮廓不规则,发生皱缩,是细胞凋亡的早期表现;AMK组肝细胞状态良好,细胞浆内含有较多糖原和脂滴,未观察到明显的超微结构改变。结果表明,在饲粮中添加白术没有对肉种鸡肝脏造成损伤。
图1 白术对肉种鸡肝脏组织超微结构的影响

红色箭头表示正常的肝细胞,蓝色箭头表示皱缩的肝细胞,黄色箭头表示线粒体。

Fig.1 Effects of Atractylodes macrocephala on ultrastructure of liver tissues of broiler breeders

Red arrows mean normal liver cells, blue arrows mean shrunken liver cells, and yellow arrows mean mitochondria.

2.2 白术对肉种鸡肝脏功能相关指标的影响

AST和ALT是血清中肝脏功能的标志性酶,如图2所示,CON组肉种鸡血清ALT和AST活性显著低于AB组(P<0.05),与AMK组无显著差异(P>0.05);与AB组相比,AMK组血清ALT活性显著降低(P<0.05),血清AST活性无显著差异(P>0.05)。结果表明,饲粮中添加白术不会对肉种鸡肝脏功能产生负面影响。
图2 白术对肉种鸡肝脏功能相关指标的影响

数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05),无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。

Fig.2 Effects of Atractylodes macrocephala on liver function related indeices of broiler breeders

Data columns with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 白术对肉种鸡肝脏抗氧化指标的影响

如图3所示,与CON组相比,AB组肉种鸡肝脏CAT活性显著降低(P<0.05),肝脏MDA含量以及GSH-Px和SOD活性无显著差异(P>0.05);AMK组肝脏CAT、GSH-Px和SOD活性显著提高(P<0.05),肝脏MDA含量无显著差异(P>0.05)。与AB组相比,AMK组肝脏CAT、GSH-Px和SOD活性显著提高(P<0.05)。结果表明,饲粮中添加白术能在一定程度上提高肉种鸡肝脏抗氧化能力。
图3 白术对肉种鸡肝脏抗氧化指标的影响

Fig.3 Effects of Atractylodes macrocephala on liver antioxidant indeices of broiler breeders

2.4 白术对肉种鸡肝细胞凋亡率的影响

如图4所示,CON组和AMK组肉种鸡肝脏组织中凋亡细胞较少,几乎不可见,而AB组肝脏组织中阳性细胞数量明显增多,肝细胞凋亡率显著提高(P<0.05);并且与AB组相比,AMK组肝脏组织中阳性细胞数量明显减少,肝细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结果表明,饲粮中添加白术不会促使肉种鸡肝细胞发生凋亡。
图4 白术对肉种鸡肝细胞凋亡率的影响

Fig.4 Effects of Atractylodes macrocephala on hepatocyte apoptosis rate of broiler breeders

2.5 白术对肉种鸡肝脏凋亡相关基因mRNA相对表达量的影响

如图5所示,与CON组相比,AB组肉种鸡肝脏Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Bak和Bax的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏Caspase3的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05);AMK组肝脏Caspase8、Bak和Bax的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏Caspase3、Caspase9和Bcl-2的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。与AB组相比,AMK组肉种鸡肝脏Caspase9、Bcl-2和Bak的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),肝脏Caspase3、Caspase8和Bax的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。
图5 白术对肉种鸡肝脏凋亡相关基因mRNA相对表达量的影响

Fig.5 Effects of Atractylodes macrocephala on mRNA relative expression levels of apoptosis related genes in liver of broiler breeders

2.6 白术对肉种鸡肝脏凋亡相关基因蛋白相对表达量的影响

如图6所示,与CON组相比,AB组肉种鸡肝脏Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),肝脏Bax蛋白相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏Bcl-2和Bak蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05);AMK组肝脏Caspase8、Caspase9和Bak蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),肝脏Bcl-2蛋白相对表达量显著提高(P<0.05),肝脏Caspase3和Bax蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05)。与AB组相比,AMK组肉种鸡肝脏Bax蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),肝脏Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bak和Bcl-2蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05)。
图6 白术对肉种鸡肝脏凋亡相关基因蛋白相对表达量的影响

Fig.6 Effects of Atractylodes macrocephala on protein relative expression levels of apoptosis related genes in liver of broiler breeders

3 讨论

3.1 饲粮中添加白术对肉种鸡肝脏功能的影响

产蛋高峰期的蛋鸡,肝脏本身就处于高负荷运转状态,此时肝脏要长期工作消化脂肪,各种毒素类蓄积会导致肝细胞受损、肝脏功能减退等病理现象。AST和ALT是血清中的肝脏功能标志性酶,被认为是早期肝脏损害的有效指标[13]。ALT是一种胞浆酶,主要存在于细胞质中,AST则在线粒体内,机体在正常生理状态下血清中的ALT和AST活性较低,只有当肝细胞严重受损时,血清AST活性才会显著升高[14-15]。为了评估白术对肉种鸡肝脏的保护效果,本研究测定了肉种鸡血清中的AST和ALT活性,结果表明,AB组肉种鸡血清AST和ALT活性显著高于CON组,AMK组血清AST和ALT活性与CON组没有显著差异,表明在饲粮中添加白术不会对肉种鸡肝脏功能产生负面影响。

3.2 饲粮中添加白术对肉种鸡肝脏氧化损伤的影响

肉种鸡在产蛋后期,随着日龄的增长,机体对营养物质的消化吸收能力逐渐减弱,体内的物质合成与转运速率也逐渐减缓,导致生产性能下降。肝脏是产蛋期鸡体内最主要的脂质分解代谢场所[16],在ROS过量生成并积聚的条件下容易受到损伤,导致抗氧化物质水平逐渐下降,ROS生成和抗氧化系统之间的平衡可能会被破坏,肝脏的代谢功能和抗氧化水平表现出与年龄负相关性[17]。通常而言,生物体内的氧化与抗氧化机制维持相对平衡,当各种因素导致这种平衡紊乱,即产生氧化应激[18]。氧化应激参与肝脏损伤的过程,被认为是多种肝病的病理生理基础,并与肝癌的发生密切相关[19]。MDA是在脂质过氧化反应中产生的重要化合物,其含量的高低反映了脂质氧化的程度[20]。SOD和GSH-Px构成了生物体内至关重要的抗氧化防御体系,广泛存在于人体各组织中,包括血液、肝脏、线粒体和细胞质,能有效降解氧自由基,降低细胞内的过氧化氢含量,从而遏制自由基及其引发的过氧化物积累[21]。近年来,很多研究探究了植物提取物缓解由ROS引起的肝脏损伤的作用机制。Zhu等[22]研究发现,桦木酸通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)-p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路减弱了地塞米松诱导的氧化损伤,提高了机体的总抗氧化能力、SOD活性以及抑制自由基的能力,并且提高了肝脏、胸腺和脾脏中CAT的活性。张莉[23]研究发现,芪归补血颗粒通过提高小鼠体内SOD、CAT和GSH-Px活性,并降低MDA含量,同时通过激活诱导型一氧化氮合酶与减少一氧化氮的生成,充分展现了其抗氧化益处。陈浩祥等[24]研究发现,饲喂岭南黄鸡白术多糖,能显著提高其血清SOD和GSH-Px活性,减少体内MDA含量,从而缓解环磷酰胺引起的机体氧化应激与肝细胞凋亡现象。徐丽珊等[25]研究发现,给小鼠灌服白术及白术多糖,能够显著提高其大脑和肝脏中的SOD活性,显著降低MDA以及大脑中的脂褐素(LPF)含量,表明白术及白术多糖均能提高小鼠学习记忆和抗氧化能力,而发挥抗氧化作用的主要成分是白术多糖。本试验结果表明,在肉种鸡饲粮中添加15 g/kg的白术粉能够提高其肝脏SOD、GSH-Px和CAT活性,而SOD、CAT和GSH-Px是机体重要的抗氧化酶类,这表明白术可以减缓肉种鸡高强度产蛋造成的机体氧化应激反应,增强肉种鸡肝脏的抗氧化能力。

3.3 饲粮中添加白术对肉种鸡肝细胞凋亡的影响

细胞凋亡,又称为细胞程序性死亡,是由基因调控的细胞程序性死亡途径;当细胞发生凋亡时,会表现出细胞皱缩、凋亡小体生成及染色质在核内聚集等典型形态特征[26]。Bcl-2家族分子参与调控细胞凋亡信号途径,通过促凋亡和抑凋亡分子相互作用来控制细胞的凋亡和存活,是细胞凋亡研究中最深入广泛的一类分子[27]。Bcl-2家族分子中具有代表性的抗凋亡蛋白Bcl-2可通过抑制促凋亡蛋白来保证细胞存活。Bax和Bak作为促凋亡蛋白,不仅能够促进凋亡,也可以激活下游的胱天蛋白酶(Caspase)家族,进而导致细胞凋亡[28]。同时,Bcl-2家族也可以通过内质网途径来介导细胞凋亡[29]。已有研究表明,多种植物提取物如香樟多糖、云芝多糖和米糠酚都会通过抑制Caspase家族成员的表达,从而抑制细胞发生凋亡[30⇓-32]。陈丽君等[33]研究发现,饲粮中添加400 mg/kg的白术多糖可能通过抑制线粒体及死亡受体途径关键基因的表达,缓解脂多糖(LPS)诱导的细胞凋亡。付晶等[34]研究发现,饲粮中添加400 mg/kg的白术多糖可通过调节线粒体通路关键基因及蛋白表达抵抗环磷酰胺诱导的雏鸡肝细胞凋亡。
本研究通过对肉种鸡肝脏组织进行超微结构观察发现,CON组和AMK组肝脏组织在透射电镜下的肝细胞状态良好,无皱缩现象,也没有发现凋亡小体的存在;而AB组肝细胞出现了明显的皱缩现象,并可见凋亡小体。之后采用Tunel法进一步检测肝细胞的凋亡水平,结果显示AB组肝细胞凋亡率显著高于其他2组。在后续的凋亡相关基因mRNA和蛋白相对表达量的测定结果中,白术显著抑制了促凋亡基因Caspase9、Bak和Bax的mRNA和蛋白的表达,同时显著促进了抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达,这表明白术在一定程度上缓解了肉种鸡因产蛋高峰引起的肝细胞凋亡。

4 结论

饲粮中添加15 g/kg白术粉可通过增强肉种鸡机体抗氧化能力和减少肝细胞凋亡,从而缓解肉种鸡因高强度产蛋诱导的肝脏损伤。

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