动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 11: 7028 - 7039

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.599

研究论文

维生素和益生菌复合添加剂对种公鸡精液品质和睾丸机能重塑的影响

  • 贺月华 ,
  • 梁文杰 ,
  • 祝廷奇 ,
  • 张宾宾 ,
  • 郭海山 ,
  • 刘双星 ,
  • 刘平泉 ,
  • 李文婷 ,
  • 李东华 ,
  • 孙桂荣 , *
展开
  • 河南农业大学神农种业实验室,郑州 450046
* 孙桂荣,教授,博士生导师,E-mail:

贺月华(1999—),女,河南焦作人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-04-30

  网络出版日期: 2024-11-09

基金资助

神农种业实验室一流课题项目(SN01-2022-05)

河南省中原学者工作站项目(234400510023)

收起

Effects of Vitamin and Probiotic Composite Additive on Semen Quality and Testicular Function Remodeling of Breeding Roosters

  • HE Yuehua ,
  • LIANG Wenjie ,
  • ZHU Tingqi ,
  • ZHANG Binbin ,
  • GUO Haishan ,
  • LIU Shuangxing ,
  • LIU Pingquan ,
  • LI Wenting ,
  • LI Donghua ,
  • SUN Guirong , *
Expand
  • Shennong Seed Industry Laboratory, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-04-30

  Online published: 2024-11-09

Fold

摘要

本试验旨在探究维生素和益生菌复合添加剂对种公鸡精液品质及睾丸机能重塑的影响。选取50只体重[(1.49±0.24) kg]相近、健康的350日龄贵妃种公鸡,禁食15 d后随机分为2组,每组25只。对照组在恢复期饲喂基础饲粮,试验组在恢复期饲喂基础饲粮+200 mg/kg维生素和益生菌复合添加剂。试验分为预试期7 d、禁食期15 d和恢复期32 d,共计54 d。记录2组禁食前1天(F0)、禁食第15天(F15)和恢复饲喂第32天(R32)时公鸡的体重以及R32时的睾丸重、精子密度和精子活力,并对R32时的睾丸组织进行高通量转录组测序(RNA-seq)。结果显示: 1)在R32时,试验组公鸡体重高于对照组(P>0.05);试验组公鸡精子活力显著高于对照组(P<0.05),睾丸重和精子密度差异不显著(P>0.05)。2)对2组公鸡睾丸组织进行RNA-seq分析,共获得57个差异基因,其中9个基因上调,48个基因下调,差异基因主要被注释到跨膜受体蛋白酪氨酸激酶激活剂活性、JAK信号转导接头活性等功能以及精囊形态发生和肌动蛋白丝束组件等过程;主要富集在甲型流感、碱基切除修复、MAPK信号通路和产生免疫球蛋白A的肠道免疫网络通路中。综上可知,维生素和益生菌复合添加剂可以通过加快种公鸡体重恢复、提高精子活力改善精液品质;通过对睾丸组织进行RNA-seq分析,筛选出T细胞急性淋巴细胞白血病1(TAL1)、类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)、晚疫病抗性基因(BLB1)、血管生成素4(ANGPT4)、Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白3(NEIL3)等基因可作为研究种公鸡精液品质和睾丸机能的候选基因。

关键词： 维生素和益生菌复合添加剂; 睾丸; 转录组; 差异基因

本文引用格式

贺月华 , 梁文杰 , 祝廷奇 , 张宾宾 , 郭海山 , 刘双星 , 刘平泉 , 李文婷 , 李东华 , 孙桂荣 . 维生素和益生菌复合添加剂对种公鸡精液品质和睾丸机能重塑的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(11) : 7028 -7039 . DOI: 10.12418/CJAN2024.599

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of vitamin and probiotic composite additive on the semen quality and testicular function remodeling of breeding roosters. Fifty healthy 350-day-old female Guifei breeding roosters with similar body weight [(1.49±0.24) kg] were selected and randomly divided into two groups after fasting for 15 days, and each group had 25 roosters. Roosters in control group were fed a basal diet during the recovery period, and roosters in experimental group were fed the basal diet 200 mg/kg vitamin and probiotic composite additive during the recovery period. The experiment was divided into pre-feeding period for 7 days, fasting period for 15 days and recovery period for 32 days, for a total of 54 days. The body weight of the two groups at the day before fasting (F0), 15 days after fasting (F15) and 32 days after resuming feeding (R32), as well as testicular weight, sperm density and sperm motile at R32 were recorded, and high throughput transcriptomic sequencing (RNA-seq) was performed on the testicular tissue at R32. The results showed as follows: 1) at the R32, the body weight of experimental group was significantly higher than that of control group (P>0.05); the sperm motility of experimental group was significantly higher than that of control group (P<0.05), but the testicular weight and sperm density were not significantly different between experimental group and control group (P>0.05). 2) RNA-seq analysis was performed on the testis tissues of the two groups, and 57 differential genes were obtained, of which 9 genes were up-regulated and 48 genes were down-regulated. The differential genes were mainly annotated to transmembrane receptor protein tyrosine kinase activator activity, JAK pathway signal transduction adaptor activity, seminal vesicle development, actin filament bundle assembly, and so on. It is mainly concentrated in influenza A, base excision repair, MAPK signaling pathway and intestinal immune network for immunoglobulin A production pathways. In conclusion, the vitamin and probiotic composite additive can improve semen quality by accelerating weight recovery and enhancing sperm motility. Through RNA-seq analysis of testicular tissue, T-cell acute lymphocytic leukemia (TAL1), steroidogenic acute regulatory protein (STAR), late blight resistance gene (BLB1), angiopoietin 4 (ANGPT4), Nei endonuclease Ⅷ-like protein 3 (NEIL3) and other genes are selected as candidate genes for the study of semen quality and testicular function of breeding roosters.

Key words： vitamin and probiotic composite additive; testis; transcriptome; differential gene

随着现代蛋鸡养殖的发展,种公鸡的繁殖性能对养禽业有着至关重要的作用。种公鸡的精液品质是评价其繁殖能力的重要指标之一,也是影响母鸡孵化性能的关键因素,保证种蛋受精率的重要前提基础。然而,公鸡的繁殖性能受年龄制约,在饲养后期其精液品质会急剧降低,前期本课题组借鉴母鸡饥饿诱导换羽模型对老龄贵妃种公鸡进行了禁食再饲喂试验,发现老龄贵妃种公鸡在恢复饲喂32 d时精子活力显著高于禁食前[1],此方法使公鸡睾丸机能得到了重塑,并提高了公鸡的繁殖性能,延长了公鸡使用年限。
影响精液品质的因素还有很多,营养是其中重要因素之一。维生素和益生菌作为动物饲粮中的营养性和功能性添加剂,对动物的机体健康、生长特性、免疫功能、生育繁殖等均具有极其重要的作用。张磊等[2]研究表明,饲粮中适量添加维生素A和维生素E可提高种公鸡的繁殖性能;何祖富等[3]研究表明,饲粮中添加维生素C和维生素E可显著提高略阳乌鸡种公鸡的采精量、精子密度、精子活率和有效精子数;李丹等[4]研究表明,饲粮中添加益生菌提高了种公鸡的精液品质,并增强了睾丸的抗氧化能力,对提高种公鸡的繁殖能力有一定的改善作用。
根据上述研究结果,我们猜想在饥饿诱导换羽模型的基础上添加由维生素和益生菌等组成的复合添加剂可能会使种公鸡精液品质恢复得更好。因此,本试验以贵妃种公鸡为研究对象,探究禁食恢复采食后饲粮中添加维生素和益生菌复合添加剂对贵妃种公鸡体重、睾丸重和精液品质的影响,并对睾丸组织进行转录组测序(RNA-seq),以期寻找维生素和益生菌复合添加剂促进睾丸发育的特异性相关通路及特异性基因,该研究可为深入了解维生素和益生菌复合添加剂对禁食再饲喂种公鸡精液品质和睾丸机能重塑的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和试验饲粮

本试验采用单因子设计方案,选择50只体重[(1.49±0.24) kg]相近且健康的350日龄贵妃种公鸡,按照表1饥饿诱导换羽程序管理,在禁食15 d后随机分为2组,每组25只,2组间体重差异不显著(P>0.05)。对照组(D组)恢复期饲喂基础饲粮,试验组(H组)恢复期饲喂基础饲粮+200 mg/kg维生素和益生菌复合添加剂。试验鸡在同一鸡舍单笼饲喂,试验分为预试期(7 d)、禁食期(15 d)和恢复期(32 d)3个阶段,共54 d。重要时间节点是通过参考前人对母鸡强制换羽的研究[5]并结合公鸡的射精量、精液颜色和失重率确定的。记录2组在禁食前1天(F0)、禁食第15天(F15)和恢复饲喂第32天(R32)时贵妃种公鸡的体重,并记录R32时睾丸重、精子密度和精子活力。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,其为参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制的配合饲料,具体组成及营养水平见表2。维生素和益生菌复合添加剂主要包括维生素A乙酸酯、维生素D3、DL-α-生育酚、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌等,具体成分见表3。
表1 饥饿诱导换羽程序

Table 1 Starvation induced moulting procedures

分期
By stages		 处理阶段
Processing phase		 饲粮
Diet		 饮水
Drinking water		 光照
Light/(h/d)
预试期
Preliminary trial period		 适应期 第1~7天 自由采食 自由饮水 16
正试期
Probationary period		 禁食期 第8~10天 停料 停水 8
第11~22天 停料 自由饮水 8
恢复期 第23~24天 30 g/只 自由饮水 每天增加0.5
第25~26天 60 g/只 自由饮水 每天增加0.5
第27~28天 90 g/只 自由饮水 每天增加0.5
第29~30天 120 g/只 自由饮水 每天增加0.5
第31~38天 自由采食 自由饮水 每天增加0.5,直至16
第39~54天 自由采食 自由饮水 16
表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 65.00
豆粕Soybean meal 23.00
石粉Limestone 7.00
预混料Premix1) 5.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
代谢能ME/(MJ/kg) 10.87
粗蛋白质CP 15.50
钙Ca 3.50
总磷TP 0.60
有效磷AP 0.32
蛋氨酸Met 0.32
赖氨酸Lys 0.70
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.56
苏氨酸Thr 0.50

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 10 000 IU,VD3 2 000 IU,VE 90 IU,VK3 5 mg,VB1 3 mg,VB2 15 mg,VB6 5.5 mg,VB12 0.03 mg,D-生物素 D-biotin 0.3 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 16 mg,叶酸 folic acid 1 mg,烟酰胺niacinamide 55 mg,氯化胆碱 choline chloride 500 mg,Fe (as ferrous sulfate) 60 mg,Cu (as copper sulfate) 9 mg,Mn (as manganese sulfate) 100 mg,Zn (as zinc sulfate) 100 mg,Se (as sodium selenite) 0.3 mg。

2)代谢能、有效磷和氨基酸为计算值,参考《中国饲料成分及营养价值表(2023年第34版)》进行计算,粗蛋白质、钙和总磷为实测值,测定方法分别依据GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018。The calculated values of ME, AP and amino acids were calculated with reference to the Table of Feed Composition and Nutritional Value in China (34th edition, 2023), while CP, Ca and TP were measured values based on GB/T 6432—2018, GB/T 6436—2018 and GB/T 6437—2018, respectively.

表3 维生素和益生菌复合添加剂组成

Table 3 Composition of vitamin and probiotic composite additive

项目Items 含量Content
维生素A Vitamin A ≥500 000 IU/kg
维生素D3 Vitamin D3 ≥80 000 IU/kg
维生素E Vitamin E ≥1 000 mg/kg
功能菌总数
Total number of functional bacteria		 ≥2.4×108 CFU/g
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ≥1.0×107 CFU/g
嗜酸乳杆菌
Lactobacillus acidophilus		 ≥2.3×108 CFU/g
水分Moisture ≤10%

1.2 睾丸组织样品采集

种公鸡在R32时每组选择6只屠宰并立即收集睾丸组织,液氮冷冻,-80 ℃冰箱中保存,后续每组挑选3个睾丸组织样由南京派森诺基因科技公司进行转录组测序。

1.3 精液采集与精液品质测定

运用背腹式按摩法对公鸡进行采精,人员固定,一人采集精液,另一人对公鸡进行保定。供试鸡每3 d采精1次,在R32时每组随机抽取15只种公鸡采精,每只公鸡采集0.20 mL精液,用于后续精子活力、精子密度的测定。
依据前人的方法[6],将收集的精液用0.9%的氯化钠溶液以1∶500进行稀释,取10 μL混合液,滴在汤麦式血细胞计数板上,盖上盖玻片。在40×显微镜下进行观察计数,取计数室4个角和最中心的正方形中的精子数(对于压在正方形界限上的精子应当计相邻两边及其夹角上的精子)作为该正方形的精子总数,再以此方法统计呈前进运动精子数,从而计算出精子密度、精子活力,以上计数工作全部由同一个人完成。
精子密度(个/mL)=(精子总数/80)×400×稀释倍数×10 000;
精子活力(%)=(呈直线运动精子数/精子总数)×100。

1.4 转录组测序

从R32时D组和H组样品中各选择3个睾丸组织提取总RNA。通过PCR扩增片段制备cDNA文库。采用DESeq软件(1.20.0)对2组之间基因表达进行差异分析,筛选差异基因条件为:|log2(差异倍数)|>1,显著性P值<0.05。使用topGO进行GO富集分析,通过超几何分布方法计算q值(显著富集的标准为q值<0.05)。使用clusterProfiler软件(3.4.4)进行KEGG通路富集分析,重点关注q值<0.05的显著富集通路。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果

为了验证转录组测序数据的准确性,随机选取6个差异基因,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作内参,设计引物用于目的基因的qRT-PCR分析,引物设计见表4。采用ΔΔCt方法将基因表达数据归一化,并对2-ΔΔCt值进行统计学分析。
表4 引物序列

Table 4 Primer sequences

基因名称
Gene names		 引物序列
Primer sequence (5'—3')
单酰甘油磷酸酰
基转移酶3
AGPAT3		 F:ACACTAGTCCTCTGGCCCAT
R:CTGTAGCCTCGTCGGAGAAC
Nei核酸内切酶
Ⅷ样蛋白3
NEIL3		 F:GGAAAACTTGGATGTCTGCTCC
R:GGAGACCCAGTTTTACGGCA
IKAROS家族锌
指蛋白3
IKZF3		 F:AGAGGAAAAGCTCCATGCCC
R:GAGATGGCGTTGTTGATGGC
细胞因子信号
转导抑制因子2
SOCS2		 F:GTACCAGGACGGCAAGTTCA
R:TAGAGGTGGACCGTCCCATT
脑特异性血管
生成抑制剂3
ADGRB3		 F:GCCAGGATCCAATCAATGCG
R:ACGCAATGTCCACGTCCTTT
肌营养不良蛋白
相关蛋白2
DRP2		 F:GCCTGTCCCCTGATGATAGC
R:CCAGTTCCCCCTTGTCATCC
甘油醛-3-磷
酸脱氢酶
GAPDH		 F:GAACATCATCCCAGCGTCCA
R:CGGCAGGTCAGGTCAACAAC

1.6 数据分析

用Excel 2016进行数据统计,应用SPSS 26.0统计软件进行t检验,使用GraphPad Prism 8.0版绘图。数据以平均值±标准误表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加维生素和益生菌复合添加剂对生理重塑公鸡体重、睾丸重、精子密度和精子活力的影响

由图1可知,禁食15 d后2组公鸡体重明显下降,恢复饲喂32 d后2组公鸡体重均恢复到禁食前水平,且H组公鸡体重高于D组,但差异不显著(P>0.05),且在R32时H组公鸡精子活力显著高于D组(P<0.05),2组公鸡睾丸重量和精子密度差异不显著(P>0.05),表明维生素和益生菌复合添加剂对提高精子活力有一定作用。
图1 公鸡体重、睾丸重、精子密度和精子活力比较

*表示差异显著(P<0.05)。

Fig.1 Comparison of body weight, testicular weight, sperm density and sperm motility of cocks

* indicated significant difference (P<0.05).

2.2 睾丸转录组测序数据质控

为鉴定出维生素和益生菌复合添加剂提高精液品质的机制,通过对R32时D组和H组公鸡的睾丸进行转录组测序,通过文库构建和平台测序,原始数据经过质量控制过滤后,6个样本分别获得39 261 158~41 937 918条净读长(clean reads),质量值≥20的碱基百分比(Q20)均大于97%,质量值≥30的碱基百分比(Q30)均大于92%(表5),表明本研究测序质量高,获得的测序数据可靠,可用于后续分析。将在样品间表达量相关性高的mRNA归为一类,聚类结果表明,各组的组内重复序列聚在一起(图2)。
表5 转录组测序质控结果

Table 5 Transcriptome sequencing quality control results

项目
Items		 样品编号
Sample No.		 原始读长
Raw reads		 净读长
Clean reads		 质量值≥20的碱基百分比
Percentage of bases with
quality score≥20 (Q20)/%		 质量值≥30的碱基百分比
Percentage of bases with
quality score≥30 (Q30)/%

D组
D group		 D-1 41 542 392 39 261 158 97.73 93.76
D-2 42 556 110 40 298 350 97.67 93.51
D-3 42 798 076 40 485 520 97.50 93.15

H组
H group		 H-1 42 956 904 40 660 098 97.66 93.48
H-2 44 354 150 41 937 918 97.32 92.73
H-3 42 644 098 40 309 142 97.26 92.55
图2 显著的差异基因mRNA热图

Fig.2 Heat maps of significant differential gene mRNA

2.3 差异基因表达分析

利用DESeq软件(1.20.0)对D组和H组的差异基因表达进行分析,筛选到57个表达差异显著的基因,与D组相比,H组表达上调的基因有9个,下调的基因有48个(图3和图4)。将部分差异基因的功能展示在表6中。
图3 睾丸差异基因火山图

Fig.3 Testicular differential gene volcano map

图4 睾丸差异基因柱状图

Fig.4 Testicular differential gene histogram

表6 部分差异基因表达状态及功能

Table 6 Expression status and function of some differential genes

基因名称
Gene names		 表达状态
Expression state		 基因功能
Gene function
肌动蛋白凝胶蛋白
TAGLN		 下调 是一种肌动蛋白相关蛋白,可影响肌动蛋白丝的动力学,
通常被认为是肿瘤抑制因子[7]
类固醇激素合成急性调节蛋白
STAR		 下调 在小鼠精子发生中发挥重要作用,表达或活性受到影响
可引起睾丸组织内睾酮含量改变[8]
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4
NOX4		 下调 是一种组成型活性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)
氧化酶,可持续产生低水平的过氧化氢(H2O2);通过染色
质重塑促进内皮分化[9]
Fms样酪氨酸激酶3 FLT3 下调 与其配体结合后可调节造血干细胞的生长[10]
胶原十二型α1链
COL12A1		 下调 作为一种新型预后生物标志物,可激活
胰腺癌中的癌症相关成纤维细胞[11]
血管生成素4
ANGPT4		 下调 是一种环境依赖性TEK受体酪氨酸激酶(TIE2)
激动剂或拮抗配体,可在癌症中诱导多种反应[12]
易洛魁人同源框4 IRX4 下调 可识别有助于心室心肌发育的心室特异性细胞群[13]
单酰甘油磷酸酰基转移酶3 AGPAT3 上调 对增殖和减数分裂的启动有影响[14]
16号染色体开放阅读框89 C16orf89 上调 在对犬的研究中,它存在于富含精子部分的蛋白质中[15]
晚疫病抗性基因
BLB1		 下调 是主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)和
分子抗原递呈通路相关的基因[16]
Cas支架蛋白家族成员4
CASS4		 下调 在黏着斑介导的整合素依赖性信号通路中的中间体,并与黏附
斑激酶(FAK)和非受体酪氨酸激酶(SRC)家族激酶结合
以激活调节肌动蛋白细胞骨架的下游效应子[17]
非典型趋化因子受体4
ACKR4		 下调 通过调节趋化因子21(CCL21)的瘤内丰度来抑制肿瘤中
CD103阳性(CD103+)树突状细胞的保留[18]
白细胞介素-13受体A1
IL-13RA1		 下调 为小鼠、大鼠和人脑中的神经元、突触蛋白,参与上调N-甲基-D-
天冬氨酸受体(NMDAR)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸
受体(AMPAR)亚基的磷酸化,进而增加突触活性和环磷酸腺苷反应
元件结合蛋白(CREB)介导的转录[19]
发散性蛋白激酶结构域1
FAM69C		 下调 通过磷酸化真核翻译起始因子2α(eIF2α)
来促进应激颗粒组装[20]
Notch调节锚蛋白
NRARP		 下调 是Notch通路组分中的效应子,在睾丸中转录并在生殖细胞、
支持细胞和间质细胞中表达[21]
DNA结合抑制因子4 ID4 下调 标记小鼠睾丸中的精原干细胞[22]
二重特异性去磷酸化酶26
DUSP26		 下调 神经元中缺失会增加线粒体活性氧(ROS)水平并同时激活
丝裂原活化蛋白激酶/p38(MAPK/p38)信号通路和炎症反应[23]
肌营养不良相关糖蛋白
DRP2		 下调 一种新型人类抗肌萎缩蛋白同源物[24]
Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白3
NEIL3		 下调 通过靶向修复S/G2期端粒的氧化损伤来保护基因组稳定性[25]
ⅩⅥ型胶原蛋白alpha1链
COL16A1		 下调 为心肌梗死后的心肌重塑中的差异基因[26]
T细胞急性淋巴细胞白血病1
TAL1		 下调 在成熟大鼠睾丸中表达上调,可能参与细胞分裂[27]
同源盒B6
HOXB6		 下调 在未成熟和成熟睾丸细胞的附睾和输精管层
产生不同强度的免疫定位[28]
纤溶酶原
PLG		 下调 卵母细胞使用纤溶酶原-纤溶酶系统(PLG-PLA)
去除多余的精子[29]
钾电压门控通道亚家族H成员6
KCNH6		 下调 保护胰岛免受内质网应激和细胞凋亡[30]

2.4 GO富集分析

对57个差异基因进行功能注释,GO富集分析结果(图5)显示,睾丸组织中差异基因主要富集在7个分子功能和13个生物学过程中,在分子功能中多注释到跨膜受体蛋白酪氨酸激酶激活剂活性(transmembrane receptor protein tyrosine kinase activator activity)、蛋白酪氨酸激酶激活剂活性(protein tyrosine kinase activator activity)、JAK通路信号转导接头活性(JAK pathway signal transduction adaptor activity)、赋予弹性的细胞外基质成分(extracellular matrix constituent conferring elasticity)、赋予弹性的结构分子活性(structural molecule activity conferring elasticity)等功能,在生物学过程中注释到膜间脂质转移(intermembrane lipid transfer)、髓质网状形成发展(medullary reticular formation development)、嗜碱性粒细胞分化(basophil differentiation)、精囊形态发生(seminal vesicle development)和肌动蛋白丝束组件(actin filament bundle assembly)等过程。
图5 差异基因GO富集分析

Fig.5 GO term enrichment analysis of differential genes

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果(图6)显示,差异基因显著富集在甲型流感(influenza A)、碱基切除修复(base excision repair)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)和产生免疫球蛋白A的肠道免疫网络(intestinal immune network for IgA production)4条通路中,其中甲型流感和MAPK信号通路上差异基因有2个,碱基切除修复和产生免疫球蛋白A的肠道免疫网络通路上差异基因有1个。
图6 差异基因KEGG通路富集分析

Fig.6 Enrichment analysis of KEGG pathway of differential genes

2.6 差异基因验证

为了进一步验证差异基因的真实性,从差异基因中随机选取6个基因,进行qRT-PCR验证。从图7中可以看出,qRT-PCR结果与转录组测序得到的结果趋势一致,表明测序数据结果准确性较高。
图7 差异基因qRT-PCR验证

Fig.7 Differential gene qRT-PCR verification

3 讨论

饥饿应激会使机体产生活性氧(ROS),但ROS的生成和抗氧化酶活性之间的不平衡会破坏精子的抗氧化能力,引起精子发生过氧化损伤,而维生素E的抗氧化作用对维持睾丸、附睾、副性腺的生理完整性,以及精子的发生和成熟至关重要[31]。维生素A和维生素E能通过改善公鸡睾丸组织和精清的抗氧化能力,促进生殖激素的分泌和精子的形成[32],这与张磊等[2]的研究结果相似。维生素D可以通过精母细胞上的维生素D受体发挥其生理作用,成熟精子颈部存在维生素D受体和代谢酶,这表明维生素D可能与精子发生与成熟存在相关性[33]。维生素D3是维生素D中的一种,在摄入后会被转化为25-羟基维生素D3,25-羟基维生素D3可以促进钙的吸收。维生素D3也可以改善氧化应激,从而防止对DNA等大分子的氧化损害,防止细胞膜的脂肪酸过氧化,维持细胞质膜的稳定性和完整性[34],并可以改善精子活力。有诸多报道表明饲喂枯草芽孢杆菌制剂对家禽的健康养殖起促进作用[35-36],饲粮中添加300 mg/kg的枯草芽孢杆菌可有效增强睾丸的抗氧化能力[37]。嗜酸乳杆菌对小鼠睾丸具有抗氧化作用[38],口服嗜酸乳杆菌可以减少睾丸损伤[39]。Khan等[40]对锌诱导换羽后的种公鸡饲喂添加维生素、益生菌和低于正常蛋白质水平的饲粮后提高了其精子活力和精子密度。本试验结果表明,对生理重塑公鸡饲喂主要成分为维生素、枯草芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌的复合添加剂之后,公鸡体重恢复加快,精子活力显著提高,但公鸡的睾丸重和精子密度没有提高,表明维生素和益生菌共同作用对提高公鸡精子活力有重要作用,可能是各种维生素和益生菌提高了公鸡精子的抗氧化能力并且机体摄入维生素D3的增加可能使精液中25-羟基维生素D3含量增加,从而提高了精子颈部和头部的钙含量[41],提高了精子活力。
本研究对贵妃鸡睾丸组织进行了转录组测序,共获得57个差异基因,其中9个基因上调,48个基因下调。通过对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,发现差异基因主要被注释到跨膜受体蛋白酪氨酸激酶激活剂活性、JAK信号通路转导等功能以及精囊形态发生和肌动蛋白丝束组件等过程;主要富集在甲型流感、碱基切除修复、MAPK信号通路和分泌免疫球蛋白A的肠道免疫网络通路中,参与其中的基因有T细胞急性淋巴细胞白血病1(TAL1)、类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)、晚疫病抗性基因(BLB1)、血管生成素4(ANGPT4)、Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白3(NEIL3)等。
TAL1为T细胞急性淋巴细胞白血病基因,人类TAL1基因在成熟睾丸和骨髓中表达,该基因产物是一种新型的癌症睾丸抗原候选物,并且该基因在成熟大鼠睾丸中上调,可能参与正常大鼠睾丸中的细胞分裂、形态变化和生精细胞的发育[27]。本研究中,该基因在试验组呈显著下调,可能通过影响生精细胞的发育进而影响精液品质。STAR家族的成员已被证明在细胞分化和发育中起着至关重要的作用,包括雄性和雌性配子发生[42];STAR基因在小鼠精子发生中发挥重要作用,其表达或活性受到影响可引起睾丸组织内睾酮含量改变[43]。本研究显示,对禁食再饲喂种公鸡饲粮中添加200 mg/kg维生素和益生菌复合添加剂后精子活力显著提高且STAR基因显著下调,可能是由于此复合添加剂通过影响睾酮含量进而提高种公鸡精液品质。BLB1是与许多疾病的抗性或易感性相关的基因[44],本试验中BLB1基因富集在甲型流感和分泌免疫球蛋白A的肠道免疫网络通路中,可能本试验中饥饿应激导致种公鸡易感染甲型流感,维生素和益生菌复合添加剂通过影响免疫球蛋白A来抵抗疾病的产生,从而维持睾丸机能。ANGPT4是血管生成素基因,是心脏再生的特异性调节因子[45],通过血管生成素受体酪氨酸激酶2-丝裂原活化蛋白激酶(Tie2-MAPK)通路启动从心外膜衍生细胞到心内膜的信号级联反应,并通过信号转导进一步诱导心肌细胞中组织蛋白酶K的激活。本试验中,ANGPT4基因富集在MAPK信号通路中,表明维生素和益生菌复合添加剂可能对睾丸组织重塑有重要作用。NEIL3属于Nei样双功能DNA糖基化酶家族,介导的蛋白酶体降解有助于修复人细胞DNA损伤[46]。本试验中,NEIL3基因富集在碱基切除修复通路中,表明维生素和益生菌复合添加剂可能通过碱基切除修复途径修复细胞DNA,从而提高精液品质。

4 结论

① 维生素和益生菌复合添加剂加快了饥饿再饲喂后种公鸡体重恢复,并显著提高了其精子活力。
② 在禁食15 d并恢复饲喂32 d时,饲粮中添加200 mg/kg维生素和益生菌复合添加剂的试验组与对照组相比,种公鸡睾丸差异基因共有57个,其中9个基因上调,48个基因下调。
③ TAL1、STAR、BLB1、ANGPT4、NEIL3等基因可作为研究种公鸡精液品质和睾丸机能的候选基因。

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