动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 11: 7358 - 7370

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.626

研究论文

油莎豆粕与中药复合物的固态发酵工艺条件优化

  • 薛沾枚 , 1, 2 ,
  • 张艳 1, 2 ,
  • 刘雪松 1, 2 ,
  • 孟维珊 1, 2 ,
  • 王爽 1, 2 ,
  • 杨旭东 1, 2 ,
  • 陈曦 1, 2 ,
  • 张备 2 ,
  • 南景东 2 ,
  • 张建胜 2 ,
  • 张国华 2 ,
  • 陈国旺 2 ,
  • 海龙 2 ,
  • 钟鹏 , 2, *
展开
  • 1 黑龙江省兽用药物重点实验室,齐齐哈尔 161005
  • 2 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,齐齐哈尔 161005
* 钟 鹏,研究员,E-mail:

薛沾枚(1994—),女,辽宁鞍山人,助理研究员,硕士,研究方向为中兽药与饲料添加剂研发。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-04-11

  网络出版日期: 2024-11-09

基金资助

黑龙江省农业科技创新跨越工程农业特色产业科技创新支撑项目(CX23TS27)

黑龙江省省属科研院所科研业务费项目(CZKYF2022-1-C010)

黑龙江省农业科技创新跨越工程农业科技基础创新优青项目(CX22YQ13)

黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院2022年自拟课题(ZNKT-202219)

黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院自拟课题(ZNKT-202206)

收起

Optimization of Solid-State Fermentation Process Conditions of Cyperus esculentus Soybean Meal and Traditional Chinese Medicine Compound

  • XUE Zhanmei , 1, 2 ,
  • ZHANG Yan 1, 2 ,
  • LIU Xuesong 1, 2 ,
  • MENG Weishan 1, 2 ,
  • WANG Shuang 1, 2 ,
  • YANG Xudong 1, 2 ,
  • CHEN Xi 1, 2 ,
  • ZHANG Bei 2 ,
  • NAN Jingdong 2 ,
  • ZHANG Jiansheng 2 ,
  • ZHANG Guohua 2 ,
  • CHEN Guowang 2 ,
  • HAI Long 2 ,
  • ZHONG Peng , 2, *
Expand
  • 1 Animal Husbandry and Veterinary Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Qiqihar 161005, China
  • 2 Stockbreeding and Veterinary Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Qiqihar 161005, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-04-11

  Online published: 2024-11-09

Fold

摘要

本试验旨在优化油莎豆粕与中药复合物固态发酵工艺条件。采用贝莱斯芽孢杆菌对油莎豆粕和中药复合物进行固态发酵,以多糖和蛋白质提取率为指标,通过单因素试验对发酵温度、料液比、接种量、发酵时间、碳酸钙(CaCO3)添加量、油莎豆粕与中药添加比进行初步优化,再通过Plackett-Burman试验筛选出3个显著(P<0.05)影响油莎豆粕与中药复合物中多糖和蛋白质提取率的因素,结合最陡爬坡试验确定最大响应值,运用Box-Behnken试验确定最优工艺条件。结果表明: 最优工艺条件为发酵温度40 ℃、料液比1.0∶2.0 g/mL、接种量2%、发酵时间41 h、CaCO3添加量0.002 g/mL、油莎豆粕与中药添加比1.0∶2.5 g/g;与未发酵前相比,油莎豆粕与中药复合物中多糖和蛋白质提取率分别提高了2.65倍与2.14倍。由此可见,优化后的固态发酵工艺条件可有效提高油莎豆粕与中药复合物中多糖和蛋白质提取率,为油莎豆粕与中药复合物在畜牧业中的开发应用提供理论依据。

关键词： 固态发酵; 工艺优化; 油莎豆粕; 中药

本文引用格式

薛沾枚 , 张艳 , 刘雪松 , 孟维珊 , 王爽 , 杨旭东 , 陈曦 , 张备 , 南景东 , 张建胜 , 张国华 , 陈国旺 , 海龙 , 钟鹏 . 油莎豆粕与中药复合物的固态发酵工艺条件优化[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(11) : 7358 -7370 . DOI: 10.12418/CJAN2024.626

Abstract

The purpose of this experiment was to optimize the solid-state fermentation conditions of the Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound. The Bacillus velezensis was used for solid-state fermentation of Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound, with extraction rates of polysaccharide and protein as indicators, the fermentation temperature, material-liquid ratio, inoculation amount, fermentation time, calcium carbonate (CaCO3) addition and addition ratio of Cyperus esculenta soybean meal to traditional Chinese medicine were preliminarily optimized by single factor experiment. Then, three significant (P<0.05) factors affecting extraction rates of polysaccharide and protein in Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound were screened out by Plackett-Burman experiment, the maximum was determined by steepest climbing test, and used Box-Behnken experiment to determine the optimal technological conditions. The results showed that the optimal technological conditions were fermentation temperature 40 ℃, material-liquid ratio 1.0∶2.0 g/mL, inoculation amount 2%, fermentation time 41 h, CaCO3 addition 0.002 g/mL and the addition ratio of Cyperus esculenta soybean meal to traditional Chinese medicine 1.0∶2.5 g/g. Compared with before fermentation, the extraction rates of polysaccharide and protein in the Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound were increased by 2.65 times and 2.14 times, respectively. In conclusion, the optimized solid-state fermentation conditions can effectively improve extraction rates of polysaccharide and protein in the Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound, to provide theoretical basis for the development and application of the Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound in animal husbandry.

Key words： solid-state fermentation; process optimization; Cyperus esculentus soybean meal; traditional Chinese medicine

随着我国畜牧业限抗与禁抗令的颁布与实施,积极研究与开发绿色、安全、环保的新型抗生素替代品成为研究热点。固态发酵中药不仅操作简单,且可提高中药资源利用价值,有利于营养物质吸收,提高有效成分物质提取率,降低一定的生产成本;应用到畜牧业中,可促进动物肠道吸收,减少饲料中抗营养因子水平,增加养殖经济效益[1]。
油莎豆又称油莎草、铁荸荠、洋地栗等,也有“地下核桃”、“生命之果”的美称,是莎草属多年生的莎草科植物,油莎豆块茎中富含多种营养物质,如油脂、蛋白质、淀粉等物质。油莎豆茎叶丛生,根茎多且细长,分蘖力极强,具备耐旱、耐温、耐涝、耐盐碱等特性,可适应多种极端环境,其生命力旺盛,除高寒地区均可种植,目前在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和河南等地均有大面积种植[2]。《新华草本纲要》中对油莎豆有记载,其块茎辛、甘温,有疏肝行气与健脾健胃功效,可治疗由脾胃气滞引起的消化不良、食少脾虚、胃痛腹胀等症状[3]。油莎豆粕是经榨油后产生的副产品,可作为优质的饲料。除油莎豆外,菟丝子、五味子与刺五加也收录于《饲料原料目录》中,菟丝子具有补益肝肾、固精缩尿、脾肾虚泻的作用;五味子具有保肝护心、补益精气、提高免疫力的作用;刺五加具有调节肠道、降糖降脂、抗氧化的作用[4⇓⇓-7]。有研究发现,在生长猪基础饲粮中添加5%油莎豆和15%膨化油莎豆均可显著提高肠道健康和机体总抗氧化作用[8];在湖羊基础饲粮中添加2%发酵中药和油莎豆复合物能够提高其抗氧化力、免疫功能和生产性能[9]。
本研究采用从板蓝根中分离出的贝莱斯芽孢杆菌作为发酵菌种,以油莎豆粕与中药(五味子、菟丝子和刺五加)为固态发酵底物,采用固态发酵方式,通过Plackett-Burman和Box-Behnken试验优化发酵工艺条件,考察油莎豆粕与中药复合物中多糖含量和蛋白质含量,为油莎豆粕与中药复合物作为新型饲料添加剂在畜牧业开发应用中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与菌种

油莎豆、五味子、菟丝子和刺五加均采摘于黑龙江省农业科学院畜牧兽医中草药种植基地。油莎豆粕原料经冷榨与低温脱脂处理,中药经鉴定均符合《中华人民共和国兽药典(2020版)》要求。贝莱斯芽孢杆菌(活菌数3.4×109 CFU/g)由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院兽药研究室分离鉴定并保存。

1.1.2 主要仪器和试剂

主要仪器包括电子分析天平(MS104TS/02,上海梅特勒-托利多有限公司)、超声清洗器(KQ-250DE,昆山市超声仪器有限公司)、恒温培养箱(SPH-2102C,上海世平试验设备有限公司)、紫外分光光度计(721G,上海仪电分析仪器有限公司)、分析天平(FA2104G,常州万得天平仪器有限公司)。
主要试剂包括营养琼脂(北京奥博星生物科技有效责任公司)、营养肉汤培养基(青岛高科技工业园海博生物科技有限公司)、碳酸钙(天津市申泰化学试剂有限购公司)、氯化钠(天津市致远化学试剂有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵菌种活化

将实验室冻存的贝莱斯芽孢杆菌活化,解冻后在营养琼脂培养基上划线,放置于37 ℃恒温箱培养24 h,挑单菌落置于营养肉汤培养基中,放置在摇床上150 r/min培养24 h。

1.2.2 固态发酵工艺

将五味子、菟丝子和刺五加干燥处理,与油莎豆粕按2∶2∶1∶1比例混合,粉碎后过60目,添加碳酸钙(CaCO3),接种贝莱斯芽孢杆菌,搅拌均匀,放置于恒温培养箱中培养。

1.2.3 多糖提取率测定

精准称取葡萄糖标准品0.500 0 g,放置于500 mL容量瓶中定容,配制成浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液,分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mL标准品溶液于500 mL容量瓶中定容,再各吸取1 mL。采用硫酸苯酚法,运用紫外分光光度计在490 nm波长下测量吸光度,以浓度(C)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,得到回归方程A=14.108C+0.023 4,决定系数(R2)=0.999 8。取1 mL定容后的油莎豆粕与中药复合物提取液,将吸光度值带入标准曲线,计算油莎豆粕与中药复合物中多糖含量。油莎豆粕与中药复合物多糖提取率计算公式如下:
多糖提取率(%)=100×提取液中多糖含量/样品中总多糖含量。

1.2.4 蛋白质提取率测定

油莎豆粕与中药复合物提取液中蛋白质含量参考GB 5009.5—2016,采用凯氏定氮法测定。油莎豆粕与中药复合物蛋白质提取率按以下公式计算:
蛋白质提取率(%)=100×提取液中蛋白质含量/样品中总蛋白质含量。

1.2.5 发酵条件的单因素试验设计

取贝莱斯芽孢杆菌液以2%接种量,接种至10 g油莎豆粕与中药样品中,均匀搅拌,料液比为1∶1.5 g/mL,CaCO3添加量为0.15 g,于37 ℃恒温培养24 h,为单因素试验的常规量。分别选取发酵温度(28、31、34、37、40 ℃)、料液比(1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5 g/mL)、接种量(1%、2%、3%、4%、5%)、发酵时间(24、30、36、42、48 h),CaCO3添加量(0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 g/mL)、油莎豆粕与中药添加比(1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5 g/g),考察单因素对固态发酵油莎豆粕与中药复合物中多糖和蛋白质提取率的影响,其余条件不变,每组试验重复案例3次。

1.2.6 Plackett-Burman试验设计

结合发酵油莎豆粕与中药复合物单因素试验结果,以油莎豆粕与中药复合物多糖和蛋白质提取率为响应值,对发酵温度、料液比、接种量、发酵时间、CaCO3添加量、油莎豆粕与中药添加比6个因素进行评价,以每个因素最低(-1)和最高(1)2水平进行试验,筛选出主效应因子。Plackett-Burman试验设计的因素水平表和编码见表1。
表1 Plackett-Burman试验设计的因素、水平和编码

Table 1 Factors, levels and coding of Plackett-Burman experimental design

因素
Factors		 低水平(-1)
Low-level (-1)		 高水平(+1)
High-level (+1)
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 30 40
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 1.0∶1.5 1.0∶2.5
接种量Inoculation amount/%(C) 2 4
发酵时间Fermentation time/h(D) 36 48
CaCO3添加量CaCO3 addition/(g/mL)(E) 0.002 0.004
油莎豆粕与中药添加比
Addition ratio of Cyperus esculentus soybean meal to
traditional Chinese medicine/(g/g)(F)		 1.0∶1.5 1.0∶2.5

1.2.7 最陡爬坡试验

最陡爬坡试验设计以响应值的梯度方向确定爬坡方向,根据各显著因素效应值大小确定步长,可快速且高效的接近最大响应值。根据Plackett-Burman试验设计结果,确定3个显著因素分别是发酵温度、料液比和发酵时间,进行最陡爬坡试验。

1.2.8 响应面试验设计

根据最爬坡试验结果,设计3因素3水平Box-Behnken试验,以多糖和蛋白质提取率为响应值,确定最优试验条件,Box-Behnken试验设计的因素、水平和编码见表2。
表2 Box-Behnken试验设计的因素、水平和编码

Table 2 Factors, levels and coding of Box-Behnken experimental design

因素
Factors		 水平Levels
-1 0 1
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 35 40 45
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 1.0∶1.7 1.0∶2.3 1.0∶2.7
发酵时间Fermentation time/h(D) 35 40 45

1.3 数据分析与统计

应用Design Expert 8.0.6进行Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计和数据分析,应用SPSS 26.0软件统计试验数据,采用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 油莎豆粕与中药复合物发酵条件单因素试验结果

油莎豆粕与中药复合物发酵条件单因素试验结果如图1所示。随着发酵时间的增加,多糖和蛋白质提取率不断增加,在42 h时达到最大,随后多糖和蛋白质提取率降低;随着发酵温度的增加,与蛋白质提取率相比,多糖提取率变化受发酵温度影响较大,多糖和蛋白质提取率均在发酵温度为28~37 ℃时不断增加,随后下降;随着接种量的增加,多糖和蛋白质提取率在接种量为1%~3%时呈上升趋势,在接种量为3%~5%时呈下降趋势;随着料液比增加,多糖和蛋白质提取率先增加后降低,在料液比为1.0∶1.5 g/mL时达到最高;随着CaCO3添加量增加,多糖和蛋白质提取率先增加后降低,在CaCO3添加量为0.003 g/mL时达到最高;随着油莎豆粕与中药添加比的增加,多糖和蛋白质提取率先增加后降低,在油莎豆粕与中药添加比为1.0∶2.0 g/mL时达到最高。
图1 油莎豆粕与中药复合物发酵条件单因素试验结果

Fig.1 Single factor test results of fermentation conditions of Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound

2.2 Plackett-Burman试验设计筛选结果

根据单因素试验结果进行Plackett-Burman试验设计,以多糖和蛋白质提取率为响应值,Plackett-Burman试验设计与结果如表3所示,Plackett-Burman试验设计以多糖和蛋白质提取率为相应值进行因素、水平及显著性分析结果如表4和表5所示。对试验设计进行方差分析,6种因素与多糖提取率的回归方程为:多糖提取率=19.65+8.05A+2.9B-3.88C+4.60D+0.37E+2.88F;对蛋白质提取率的回归方程为:蛋白质提取率=45.83+10.58A+8.35B+1.16C+2.49D-2.23E+2.47F。由表4和表5可知,影响因素A、B与D对多糖提取率有正效应显著性影响,为显著因子,其中A与B具有极显著影响(P<0.01),D有显著影响(P<0.05);影响因素A、B与D对蛋白质提取率有正效应显著性影响(P<0.05),为显著因子。
表3 Plackett-Burman试验设计与结果

Table 3 Plackett-Burman test design and results

组别
Groups		 因素Factors 多糖提取率
Polysaccharide
extraction
rate/%		 蛋白质提取率
Protein
extraction
rate/%
A B C D E F
1 1 1 -1 1 -1 -1 29.73 68.27
2 1 1 1 -1 1 1 13.89 35.74
3 -1 1 1 -1 1 1 12.54 32.76
4 -1 -1 1 1 1 1 21.17 51.14
5 1 -1 1 1 -1 -1 19.56 46.51
6 -1 1 1 1 -1 -1 16.04 40.11
7 1 1 -1 1 -1 -1 14.36 39.83
8 -1 1 -1 -1 -1 -1 14.16 37.98
9 -1 -1 -1 -1 -1 -1 11.43 31.24
10 1 -1 -1 -1 1 1 26.89 65.94
11 1 -1 1 -1 -1 -1 25.15 62.41
12 -1 -1 -1 1 1 1 11.54 32.56
表4 Plackett-Burman试验设计以多糖提取率为相应值进行因素、水平及显著性分析

Table 4 Plackett-Burman experimental design takes polysaccharide extraction rate as corresponding value to analyze factors, levels and significance

方差来源
Sources
of variance		 自由度
Freedom		 平方和
Sum of
squares		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
significance
模型Model 10 2 017.760 0 201.780 0 1 800.500 0 0.018 3 显著
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 1 914.900 0 914.900 0 8 163.930 0 0.007 0 极显著
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 1 517.750 0 517.750 0 4 620.000 0 0.009 4 极显著
接种量Inoculation amount/%(C) 1 7.270 0 7.270 0 64.890 0 0.078 6
发酵时间Fermentation time/h(D) 1 61.110 0 61.110 0 545.290 0 0.027 2 显著
CaCO3添加量CaCO3 addition/(g/mL)(E) 1 12.350 0 12.350 0 110.160 0 0.060 5
油莎豆粕与中药添加比
Addition ratio of Cyperus esculentus soybean
meal to traditional Chinese medicine/(g/g)(F)		 1 33.500 0 33.500 0 298.950 0 0.036 8
残差Residual 1 0.110 0 0.110 0
综合Comprehensive 11 2 017.870 0
决定系数R2 0.961 5 拟合优度Pred R2 0.475 8
判定系数R2 adj 0.894 0 信噪比Adeq precision 11.643 0
表5 Plackett-Burman试验设计以蛋白质提取率为相应值进行因素、水平及显著性分析

Table 5 Plackett-Burman experimental design takes protein extraction rate as corresponding value to analyze factors, levels and significance

方差来源
Sources of
variance		 自由度
Freedom		 平方和
Sum of
squares		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
模型Model 9 411.020 45.670 22.750 0.042 8 显著
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 1 123.790 123.790 61.680 0.015 8 显著
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 1 58.850 58.850 29.320 0.032 5 显著
接种量Inoculation amount/%(C) 1 30.100 30.100 15.000 0.060 7
发酵时间Fermentation time/h(D) 1 38.350 38.350 19.110 0.048 6 显著
CaCO3添加量CaCO3 addition/(g/mL)(E) 1 0.073 0.073 0.036 0.866 6
油莎豆粕与中药添加比
Addition ratio of Cyperus esculentus soybean
meal to traditional Chinese medicine/(g/g)(F)		 1 17.16 17.160 8.550 0.099 8
残差Residual 2 4.01 2.010
综合Comprehensive 11 415.04
决定系数R2 0.965 7 拟合优度Pred R2 0.234 1
判定系数R2 adj 0.905 6 信噪比Adeq precision 12.188 0

2.3 最陡爬坡试验结果

由Plackett-Burman试验结果(表4和表5)可知,A、B、D、F对多糖和蛋白质提取率为正效应显著性影响因素(P<0.05),F虽然也具有显著性影响(P<0.05),但与其他3个相应因素相比影响最小,且考虑到实际生产成本,舍去作为下一步优化条件,确定油莎豆粕与中药添加比为1.0∶2.5 g/g。C对多糖提取率有显著性负效应影响(P<0.05),E对蛋白质提取率有负效应影响,舍去作为下一步优化条件,确定接种量为2%,CaCO3添加量为0.002 g/mL。A为最显著因素(P<0.05),因此A为爬坡单位,试验结果见表6、表7。由表6可知,试验编号2组多糖提取率最高,试验条件为发酵温度40 ℃、料液比1.0∶1.9 g/mL、发酵时间42 h。由表7可知,试验编号2组蛋白质提取率最高,试验条件为发酵40 ℃、料液比1.0∶2.3 g/mL、发酵时间38 h。结合这2组的结果,选择发酵40 ℃、料液比1.0∶2.3 g/mL、发酵时间40 h作为Box-Behnken试验设计中心点。
表6 多糖提取率最爬坡试验结果

Table 6 Results of highest climbing test of polysaccharide extraction rate

编号
Numbers		 发酵温度
Fermentation
temperature/℃(A)		 料液比
Material-liquid
ratio/(g/mL)(B)		 发酵时间
Fermentation
time/h(D)		 多糖提取率
Polysaccharide
extraction rate/%
1 35 1.0∶1.7 39 29.91
2 40 1.0∶1.9 42 34.71
3 45 1.0∶2.1 45 24.59
4 50 1.0∶2.3 48 20.31
5 60 1.0∶2.5 51 16.83
6 65 1.0∶2.7 54 13.21
表7 蛋白质提取率最爬坡试验结果

Table 7 Results of highest climbing test of protein extraction rate

编号
Numbers		 发酵温度
Fermentation
temperature/℃(A)		 料液比
Material-liquid
ratio/(g/mL)(B)		 发酵时间
Fermentation
time/h(D)		 蛋白质提取率
Protein extraction
rate/%
1 35 1.0∶1.9 37 50.98
2 40 1.0∶2.3 38 68.11
3 45 1.0∶2.7 39 48.90
4 50 1.0∶3.1 40 43.08
5 60 1.0∶3.5 41 40.98
6 65 1.0∶3.9 42 31.22

2.4 Box-Behnken试验优化结果

通过Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析,试验结果见表8。以多糖提取率为响应值回归模型方差分析结果,见表9;以蛋白质提取率为响应值回归模型方差分析见结果,见表10。根据Box-Behnken试验设计,得出试验结果,并建立多糖提取率回归方程如下:多糖提取率=32.80+0.48A-3.65B+2.24D-1.73AB-0.18AD-2.55BD-2.93A2-5.84B2-3.99D2,P<0.001,具有统计学意义。二次项方差分析结果表示,失拟项P>0.05,模型R2为0.966 2,表明模型失拟性不显著(P>0.05),回归模型拟合度高。A、D、BD与A2对多糖提取率影响达到显著性水平,B、B2与D2差异极显著(P<0.01)。3个因素对多糖提取率影响为D>A>B。
表8 Box-Behnken试验优化结果

Table 8 Optimization results of Box-Behnken test

编号
Numbers		 因素Factors 多糖提取率
Polysaccharide
extraction rate/%		 蛋白质提取率
Protein extraction
rate/%
发酵温度
Fermentation
temperature/℃(A)		 料液比
Material-liquid
ratio/(g/mL)(B)		 发酵时间
Fermentation
time/h(D)
1 0 1 -1 19.51 40.09
2 0 0 0 32.09 66.13
3 1 1 0 18.11 39.02
4 0 -1 -1 20.83 42.32
5 1 -1 0 29.75 50.13
6 -1 0 1 26.67 50.11
7 0 0 0 32.72 65.32
8 0 -1 1 31.54 48.43
9 -1 0 -1 22.96 42.76
10 -1 -1 0 26.49 45.12
11 -1 1 0 21.78 42.08
12 1 0 1 28.45 51.90
13 0 0 0 32.51 66.76
14 1 0 -1 25.45 47.99
15 0 0 0 31.81 67.11
16 0 0 0 30.89 65.99
17 0 1 1 20.01 39.54
表9 多糖提取率为响应值回归模型方差分析

Table 9 Variance analysis of regression model with polysaccharide extraction rate as response value

方差来源
Sources of variance		 平方和
Sum of
squares		 自由度
Freedom		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value
模型Model 459.62 9 51.07 22.310 0.000 1
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 1.86 1 1.86 0.810 0.039 7
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 106.58 1 106.58 46.560 0.000 2
发酵时间Fermentation time/h(D) 40.14 1 40.14 17.540 0.004 1
AB 12.01 1 12.01 5.250 0.055 8
AD 0.13 1 0.13 0.055 0.821 2
BD 26.06 1 26.06 11.390 0.011 9
A2 36.17 1 36.17 15.800 0.005 4
B2 143.64 1 143.64 62.750 <0.000 1
D2 67.06 1 67.06 29.300 0.001 0
残差Residual 16.02 7 2.29
失拟项Misfitting term 6.80 3 2.27 0.980 0.584 8
纯误差Pure error 9.22 4 2.31
总离差Total deviation 475.64 16
表10 以蛋白质提取率为响应值回归模型方差分析

Table 10 Variance analysis of regression model with protein content as response value

方差来源
Sources of variance		 平方和
Sum of
squares		 自由度
Freedom		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value
模型Model 1 885.38 9 209.49 112.46 <0.000 1
发酵温度Fermentation temperature/℃(A) 10.06 1 10.06 5.40 0.033 1
料液比Material-liquid ratio/(g/mL)(B) 79.82 1 79.82 42.85 0.000 3
发酵时间Fermentation time/h(D) 35.36 1 35.36 18.98 0.003 3
AB 16.28 1 16.28 8.74 0.021 2
AD 2.96 1 2.96 1.59 0.248 0
BD 11.09 1 11.09 5.95 0.044 8
A2 303.48 1 303.48 162.91 <0.000 1
B2 835.28 1 835.28 448.39 <0.000 1
D2 419.56 1 419.56 225.23 <0.000 1
残差Residual 13.04 7 1.86
失拟项Misfitting term 8.42 3 2.81 2.43 0.505 2
纯误差Pure error 4.62 4 1.15
总离差Total deviation 1 898.42 16
根据Box-Behnken试验设计,得出试验结果,并建立蛋白质提取率回归方程如下:蛋白质提取率=66.66+1.12A-3.16B+2.10D-2.02AB-0.86AD-1.67BD-8.49A2-14.08B2-9.98D2,P<0.001,具有统计学意义。二次项方差分析结果表示,失拟项P>0.05,模型R2为0.9931,表明模型失拟性不显著(P>0.05),回归模型拟合度高。A、AB与BD对蛋白质提取率影响达到显著性水平(P<0.05),B、D、A2、B2与D2差异极显著(P<0.01)。3个因素对蛋白质提取率影响为D>A>B。

2.5 双因素交互作用与最优条件预测

等高线图与三维立体图能够直观的反映出各因素之间交互的强弱,由图2和图3可以看出,随着发酵温度、料液比与发酵时间的增加,多糖与蛋白质提取率先上升后下降。预测最佳提取条件为发酵温度40.53 ℃、料液比1∶2.08 g/mL、发酵时间41.08 h,多糖提取率33.823 7%、蛋白质提取率66.753 3%。在发酵温度40 ℃、料液比1∶2 g/mL、发酵时间41 h、CaCO3添加量0.002 g/mL与油莎豆粕粕中药比1.0∶2.5 g/g的条件下进行发酵,验证试验3次,多糖和蛋白质提取率分别是(32.17±0.61)%、(65.98±0.83)%,与预测结果基本一致,表明优化条件有效。
图2 各因素交互作用对油莎豆粕与中药复合物多糖提取率的影响

Fig.2 Effects of interaction of various factors on polysaccharide extraction rate of Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound

图3 各因素交互作用对油莎豆粕与中药复合物蛋白质提取率的影响

Fig.3 Effects of interaction of various factors on protein extraction rate of Cyperus esculentus soybean meal and traditional Chinese medicine compound

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌作为一种性质稳定、安全性高和具有多种酶活性的新型益生菌,在畜牧饲料行业具有很大的开发潜质,其分泌的几种纤维素酶和半纤维素酶能够降解植物外细胞壁,在固态发酵中可产生丰富的次级代谢产物,可起到抑菌作用[10-11]。陈龙等[12]研究发现,从杜仲树皮中分离出内生贝莱斯芽孢杆菌的内切纤维素酶具有良好耐酸性与耐热性,该酶的最适温度为60 ℃,最适pH为5.0。叶淼[13]研究发现,在蛋鸡饲粮中添加1.0×1010和2.0×1010 CFU/kg贝莱斯芽孢杆菌,可提高鸡血清中孕酮和胃动素含量,降低血清中胰液素和胆囊收缩素含量,一定程度上起到替代抗生素的作用。刘韶娜等[14]研究发现,在育肥猪饲粮中添加1.0×1010 CFU/kg贝莱斯芽孢杆菌能够提高日增重,降低猪粪中厚璧菌门/拟杆菌门比例,降低链球菌等致病菌的相对丰度,具有促进育肥猪生长和抗病的作用。瞿子惠等[15]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌CL-4发酵豆粕24 h后,具有抗菌性,粗蛋白质含量提升了4.5%,显著提高了豆粕营养品质和代谢产物含量,降低粗纤维素含量,且豆粕中的大分子抗原蛋白降解成小分子肽。彭英杰等[16]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌py-3发酵中草药后酶类物质释放,中药中总黄酮含量提高了68.99%,能够提高有效物质含量。本研究采用贝莱斯芽孢杆菌发酵油莎豆粕与中药,具有进一步研究开发的潜力。
油莎豆粕是油莎豆加工的主要副产品,是一种优质饲用原料,富含蛋白质、可溶性糖、淀粉、脂肪和微量元素等,且带有浓郁香醇气味[17]。师煌伟等[18]研究发现,采用油莎豆粕替代10%玉米饲喂杜×大三元杂交健康公猪,消化能和代谢能可达到14.61和13.54 MJ/kg,能够提高猪饲粮中的纤维水平,进而提高猪肠道中菌群多样性,并提高全肠道消化率。在油莎豆粕与中药复合物固态发酵中,油莎豆粕的蛋白质能够提供氮源,中药中富含的多种植物多糖能够提供碳源,因此不需要额外添加氮源与碳源,除此之外,贝莱芽孢杆菌发酵中药还能够更好的将中药中有效成分释放,并显著提高有效成分含量。张艳等[19]在研究中采用贝莱斯芽孢杆菌固态发酵清肺颗粒,筛选出最佳固态培养基组成及条件,分别是中药粉30%、黄豆粉10%、CaCO3添加量0.2%、水分含量59.8%,在37 ℃发酵时间24 h,清肺颗粒中有效成分告依春含量与水提方式相比提高了22.36%。本研究中,贝莱斯芽孢杆菌发酵油莎豆粕和中药复合物,经固态发酵后,与未发酵前相比油莎豆粕和中药复合物中多糖和蛋白质提取率分别提高了2.65与2.14倍。分析其原因可能是由于贝莱斯芽孢杆菌产酶量大,且具有催化作用,油莎豆粕与中药作为固态发酵底物提供了营养物质,增加了贝莱斯芽孢杆菌活菌数量,产生了协同作用。
固态发酵条件对发酵饲料工业化生产有着重要意义,发酵生产水平不仅取决于菌种自身特性,还受外界如发酵时间、发酵温度、料液比、接种量等因素影响。李杨等[20]采用贝莱斯芽孢杆菌发酵水豆豉,对发酵时间、发酵温度与接种量3个因素进行单因素试验,并结合响应面分析得出在发酵时间5 d、发酵温度35 ℃与接种量0.01%条件下,水豆豉纤溶酶活性升高约400倍。彭英杰等[16]采用从微腐中药中分离出的贝莱斯芽孢杆菌发酵复方中药,通过单因素试验与响应面试验对发酵条件进行优化,得出接种量15%、料液比1∶1 g/mL、发酵温度34 ℃、发酵6 d为最适发酵条件,经最适发酵条件下,复方中药中黄酮含量提高了68.99%。在本研究中,发酵时间、发酵温度和料液比是油莎豆粕与中药复合物中多糖和蛋白质含量显著因素。吉栗漫等[21]在研究灵芝固态发酵三七渣中发现,随着发酵时间增加产漆酶的活性先增加后降低。本试验结果与之一致,说明贝莱斯芽孢杆菌固态发酵油莎豆粕与中药的发酵时间不宜过长。丛珊滋等[22]研究发现,乳酸菌发酵玉米蛋白,随着发酵温度升高对水解物1,1-二苯基-2-三硝基苯肼清除能力与总酸含量呈先增高后下降的趋势,说明在发酵过程中温度高低会影响乳酸菌的生长速度,温度过高会降低细胞内酶的催化能力,甚至丧失酶活性。詹湉湉等[23]采用混合菌种发酵豆粕并确定发酵工艺条件,研究发现固态发酵料液比需要经不同菌种与其他发酵条件试验后所确定,当固态基质中含水量过高则降低基质多孔性,抑制有效营养成分含量;当固态基质中含水量过低则菌体生长受到抑制,影响发酵效果。

4 结论

本研究优化了贝莱斯芽孢杆菌固态发酵油莎豆粕与中药的工艺条件,最佳工艺条件为:发酵温度40 ℃、料液比1.0∶2.0 g/mL、接种量2%、发酵时间41 h、CaCO3添加量0.002 g/mL、油莎豆与中药添加比1.0∶2.5 g/g,有效成分多糖和蛋白质提取率分别可达到(32.17±0.61)%和(65.98±0.83)%,分别是优化前的2.65和2.14倍。

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