动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 11: 7454 - 7466

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.634

研究论文

免疫磁珠高通量全自动净化结合高效液相色谱快速测定饲料中玉米赤霉烯酮含量

  • 莫凡 , 1 ,
  • 姚婷 2 ,
  • 胡深 3 ,
  • 索德成 1 ,
  • 赵新雪 1 ,
  • 邹宇飞 4 ,
  • 王紫豪 1, 5 ,
  • 肖志明 , 1, *
展开
  • 1 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京 100081
  • 2 北京市兽药饲料监测中心,北京 102200
  • 3 湖北省饲料监测所,武汉 430048
  • 4 苏州海狸生物医学工程有限公司,苏州 215123
  • 5 河北伊莱莎生物技术有限公司,保定 072750
* 肖志明,副研究员,E-mail:

莫 凡(2000—),男,江苏泰兴人,研究实习员,学士,从事饲料质量安全检测技术研究。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-05-06

  网络出版日期: 2024-11-09

基金资助

国家重点研发计划(2023YFD1301001)

中国农业科学院基本科研业务费(1610072023005)

中国农业科学院基本科研业务费(1610072024009)

中国饲料工业协会团体标准制定项目

收起

Determination of Feed Zearalenone Content Using High-Throughput Automatic Immunomagnetic Beads Purification Combined with High-Performance Liquid Chromatography

  • MO Fan , 1 ,
  • YAO Ting 2 ,
  • HU Shen 3 ,
  • SUO Decheng 1 ,
  • ZHAO Xinxue 1 ,
  • ZOU Yufei 4 ,
  • WANG Zihao 1, 5 ,
  • XIAO Zhiming , 1, *
Expand
  • 1 Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
  • 2 Beijing Veterinary Drug and Feed Monitoring Center, Beijing 102200, China
  • 3 Hubei Province Feed Monitoring Institute, Wuhan 430048, China
  • 4 Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co., Ltd., Suzhou 215123, China
  • 5 Hebei Elisa Biotechnology Co., Ltd., Baoding 072750, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2024-05-06

  Online published: 2024-11-09

Fold

摘要

本研究旨在建立利用免疫磁珠高通量全自动净化结合高效液相色谱快速测定饲料中玉米赤霉烯酮含量的方法。饲料样品用80%乙腈水提取,经全自动免疫磁珠净化、富集后,采用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)测定,外标法定量。结果表明: 玉米赤霉烯酮在0.01~1.00 μg/mL范围内线性关系良好(相关系数≥0.999 9),方法检出限为2 μg/kg,定量限为10 μg/kg;玉米赤霉烯酮在0.01、0.02、0.10和1.00 mg/kg添加水平下的平均回收率为86.90%~100.27%,批内相对标准偏差(RSD)为3.18%~9.88%,批间RSD为4.94%~9.40%。由此可见,与传统固相萃取、免疫亲和柱净化法相比,免疫磁珠净化集提取、分离、净化、浓缩于一体,可实现完全自动化处理,提高工作效率和检测通量,避免因人为操作导致的结果偏差,适用于大批量饲料样本中玉米赤霉烯酮含量的测定。

关键词： 免疫磁珠净化; 玉米赤霉烯酮; 真菌毒素; 饲料; 高效液相色谱

本文引用格式

莫凡 , 姚婷 , 胡深 , 索德成 , 赵新雪 , 邹宇飞 , 王紫豪 , 肖志明 . 免疫磁珠高通量全自动净化结合高效液相色谱快速测定饲料中玉米赤霉烯酮含量[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(11) : 7454 -7466 . DOI: 10.12418/CJAN2024.634

Abstract

This experiment was to study the method for determination of feed zearalenone content using high-throughput automatic immunomagnetic beads purification combined with high-performance liquid chromatography. Feed samples were extracted with 80% acetonitrile water, purified and enriched by automatic immunomagnetic beads, and determined by high-performance liquid chromatography-fluorescence detector (HPLC-FLD), with external standard method for quantification. The results indicated that good linearity was obtained for zearalenone in the ranges of 0.01 to 1.00 μg/mL with the corresponding correlation coefficient≥ 0.999 9. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the method were 2 and 10 μg/kg, respectively. The average recoveries of zearalenone at supplemental levels of 0.01, 0.02, 0.10 and 1.00 mg/kg were 86.90% to 100.27%, with the intra-day relative standard deviations (RSD) were 3.18% to 9.88%, and inter-day RSD were 4.94% to 9.40%. In conclusion, compared with the traditional solid-phase extraction and immunoaffinity column clean-up methods, immunomagnetic beads technique integrates the extraction, separation and purification in a single run, it can achieve fully automated processing, which improve the work efficiency and avoiding result deviations caused by manual operation, it is much more suitable for the determination of zearalenone content in a large-scale number of feed samples.

Key words： immunomagnetic beads clean-up; zearalenone; mycotoxins; feeds; high-performance liquid chromatography

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)俗称F-2毒素,主要由禾谷镰刀菌产生,可广泛污染玉米、大豆、小麦等农作物,是食品和饲料中最常见的真菌毒素之一。ZEN对人体和动物具有慢性毒性、免疫毒性、生殖毒性以及“三致”(致癌、致畸、致突变)等毒性作用,是世界卫生组织国际癌症研究中心公布的3类致癌物[1]。此外,由于ZEN与雌二醇具有类似的化学结构,能够与机体雌激素受体相结合,从而产生拟雌激素样作用,具有明显的内分泌干扰活性,也是世界自然基金会公布的环境内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals,EDCs)[2]。ZEN在饲料中的污染范围广,Hao等[3]对我国2017—2021年间的9 392份饲料和饲料原料样品进行了分析,发现1/2以上饲料样品检出ZEN(检出率为56.29%),平均检出含量为183.81 μg/kg,且大部分为2种以上真菌毒素的复合污染。曾睿等[4]对我国华南地区的232份家禽配合饲料进行了ZEN、赭曲霉毒素A、柄曲霉素3种真菌毒素的监测分析,发现所有饲料样品中均检出ZEN(检出率为100%),检出含量为1.00~53.61 μg/kg(平均检出含量为8.59 μg/kg)。此外,隐蔽型毒素如ZEN-14-葡萄糖苷(zearalenone-14-glucoside,ZEN-14G)、ZEN-14-磺酸(zearalenone-14-sulfate,ZEN-14S)等的发现,亦增加了其暴露风险[5-6]。鉴于ZEN对养殖动物的毒性作用以及在饲料中广泛的污染性,建立饲料中ZEN含量的准确、快速、高通量的定量分析方法,对于饲料中真菌毒素的暴露评估和风险防控具有重要意义。
目前,饲料中ZEN含量常用检测方法主要包括胶体金试纸卡[7]、酶联免疫吸附测定(ELISA)[8]、免疫侧流层析[9]等快速检测法,以及气相色谱(GC)[10]、气相色谱-质谱(GC-MS)[11]、高效液相色谱(HPLC)[12⇓-14]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[15-16]等仪器确证分析方法。ELISA、胶体金试纸卡、免疫测流层析等快速检测法容易因抗体的交叉反应出现假阳性;GC、GC-MS等方法往往需要衍生化,前处理繁杂,衍生化产物的稳定性也较差。HPLC法因具有操作简便、稳定可靠、重现性好等优点,是最为常用的真菌毒素定量分析技术[17]。此外,LC-MS/MS法正越来越广泛的用于饲料中真菌毒素的定性和定量检测,但由于其仪器价格昂贵、操作复杂,且电喷雾电离源(ESI)固有的基质效应也易影响定量结果的准确性,从而限制了其在饲料行业的大规模应用。在HPLC、LC-MS/MS定量分析之前需要对样品进行净化处理,毒素分析常用的净化技术有固相萃取柱(solid-phase extraction,SPE)[18-19]、QuEChERS[20]、免疫亲和柱净化(immunoaffinity column,IAC)[21-22]等方法。我国饲料行业现行有效的国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》(GB/T 28716—2012)即采用IAC法进行样品净化。尽管IAC法相较于传统SPE、QuEChERS法具有更好的选择性和净化效果,被各类不同样品基质干扰的影响也较小,但受抗体影响稳定性较差,价格昂贵、检测成本高,且纯手动操作的处理过程耗时也较长。
免疫磁珠(immunomagnetic beads,IMBs)是20世纪70年代后期发展起来的一种磁载体分离技术,同时具备了免疫学的高度特异性以及磁性纳米材料的超顺磁性、尺寸小、可进行多样化修饰等显著特点,可在外加磁场的作用下快速捕捉、分离目标化合物,避免了繁琐的过滤或离心等固-液分离过程,从而有望实现集提取、净化、浓缩于一体的快速样品前处理技术[23]。免疫磁珠最初主要应用于核酸、蛋白质、微生物等生物大分子的分离纯化[24-25],近几年因其操作简便、耗时短、可批量自动化处理等优势受到了广泛关注,并逐渐应用于真菌毒素、兽药残留等小分子检测[26-27]。Chen等[28]采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米材料与黄曲霉毒素M1(AFM1)单抗偶联制备免疫磁珠,结合LC-MS/MS建立了牛奶中AFM1残留的确证检测方法,实现了13 min内24个牛奶样品的快速处理。Wang等[29]采用溴化氢活化琼脂糖凝胶(CNBr)与黄曲霉毒素、伏马毒素、T-2毒素和环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)的混合单抗进行偶联,成功构建了黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、伏马菌素B1(FB1)、T-2毒素和CPA等7种真菌毒素的免疫磁珠净化超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同步确证分析方法。总体而言,与IAC法相比,免疫磁珠净化成本更低,可实现全自动化处理,解放了试验人员双手,可显著提高工作效率和检测通量。
尽管近年来免疫磁珠分离技术已在食品安全研究领域得到了诸多应用,但其在饲料质量安全分析中的相关研究仍然较少。因此,本研究利用免疫磁珠高通量全自动净化结合高效液相色谱仪,建立一种快速便捷、可批量自动化处理饲料和饲料原料样品中ZEN的方法,并在此基础上研究制定了我国首个关于免疫磁珠净化技术的饲料工业协会团体标准,以期为基层检测实验室和饲料企业防控真菌毒素污染提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

主要仪器设备包括1100型高效液相色谱仪(配备荧光检测器,美国安捷伦科技有限公司)、真菌毒素全自动净化仪(苏州海狸生物医学工程有限公司)、ZEN免疫亲和柱(北京华安麦科生物技术有限公司)、氮气发生器(上海安谱实验科技股份有限公司)、N-EVAP 112氮吹仪(美国Organomation公司)、Crest Ultrasonics CP 2600D超声波清洗器(北京天林恒泰科技有限公司)、Milli-plus超纯水仪(美国Millipore公司)、BS 210S分析天平(德国Sartorius公司)、MS1旋涡混合器(德国IKA公司)、3K15低温高速离心机(德国Sigma公司)。

1.2 试剂材料

ZEN免疫磁珠试剂盒购自苏州海狸生物医学工程有限公司;ZEN标准溶液(100 μg/mL)购自青岛普瑞邦生物工程有限公司;乙腈、甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司;试验用水为经Milli-Q纯化后的一级水(≥18.2 MΩ);氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钾(KCl)、吐温-20等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;尼龙滤膜(0.45 μm)购自上海泰坦科技股份有限公司。
磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.0):称取8.0 g NaCl、1.2 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4和0.2 g KCl,加水溶解并定容至1 000 mL;含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST):取1 mL吐温-20,用PBS稀释至1 000 mL。
饲料、饲料原料和宠物饲料样品由国家饲料质量检验检测中心(北京)提供。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取

参考国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》(GB/T 28716—2012)进行:称取10 g饲料样品(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,准确加入20 mL 80%乙腈水溶液,涡旋混匀30 s,置于超声波清洗器中超声提取20 min,期间取出摇匀2~3次,置于低温高速离心机中11 180×g离心5 min,取上清液备用。

1.3.2 免疫磁珠全自动净化

移取1.0~2.0 mL上清液,加入ZEN免疫磁珠净化试剂盒的样品孔A中,启动真菌毒素全自动净化仪,运行ZEN净化程序,真菌毒素全自动净化仪和ZEN免疫磁珠净化试剂盒示意图见图1。ZEN免疫磁珠全自动净化程序如下:1)磁棒将免疫磁珠从B孔转移到样品孔A,磁棒混合12 min,磁吸60 s;2)磁棒将免疫磁珠转移至清洗孔C,清洗60 s,磁吸60 s;3)磁珠转移到清洗孔D,清洗60 s,磁吸60 s;4)磁珠转移到孔E进行洗脱,洗脱60 s,磁吸60 s后将磁珠转移到磁珠回收孔B,净化程序结束。净化结束后,移取孔E洗脱液于50 ℃氮吹至近干,0.5 mL 50%乙腈/水溶液复溶,涡旋混匀,过0.45 μm滤膜后上HPLC仪器测定。单条试剂盒中ZEN的自动净化时间约为20 min,可同时进行10个样品的同步在线处理。
图1 真菌毒素全自动净化仪和玉米赤霉烯酮免疫磁珠净化试剂盒示意图

A:PBST稀释液 PBST diluent;B:免疫磁珠溶液 immunomagnetic beads solution;C:PBS清洗液 PBS cleaning solution;D:水清洗液 water cleaning solution;E:甲醇洗脱液 methanol eluent。

Fig.1 Schematic diagram of mycotoxin automatic purification device and ZEN IMBs kit

1.3.3 HPLC仪器条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:40 ℃;进样量:50 μL;流动相:乙腈/水=55/45(体积比),等度洗脱;流速:0.8 mL/min;荧光检测器:激发波长274 nm,发射波长440 nm。

1.4 免疫磁珠净化方法优化及方法学考察

免疫磁珠粒径的大小对于其性能指标有着较大影响,因此对2种不同粒径大小[纳米级磁珠(粒径约10 nm)和微米级磁珠(粒径约2 μm)]的免疫磁珠进行了比较研究。此外,为对反应时间进行优化,进一步将免疫磁珠与1.0 μg/mL的ZEN标准溶液进行反应,分别考察不同反应时间(1、3、5、8、10、15和20 min)的结合效率。
为考察方法的线性,将ZEN标准溶液(100 μg/mL)逐级稀释配制成6个不同梯度(0.01、0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 μg/mL)的系列标准工作液,以ZEN标准溶液的含量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
为考察方法的准确度与精密度,选取具有代表性的空白样品,包括玉米粉、干酒糟及其可溶物(DDGS)、豆粕、花生粕、小麦粉等饲料原料,猪、鸡、鱼配合饲料、浓缩饲料和牛羊精料补充料,以及犬、猫粮等宠物饲料进行了添加回收试验。综合考虑美国食品药品监督管理局对检测方法的相关要求[30]以及《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)对ZEN在饲料和饲料原料中的限量规定,设置定量限(LOQ)、2 LOQ、10 LOQ和100 LOQ 4个添加水平,每个添加水平设6个平行,按上述方法进行样品处理和测定。
进一步将免疫磁珠与传统IAC净化进行了比较研究,参考国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》(GB/T 28716—2012),对从英国分析实验室能力验证(food analysis performance assessment scheme,FAPAS)购买的玉米粉、小麦粉、动物饲料、宠物犬粮4份有证标准物质(certified reference material,CRM)以及由国家饲料质量检验检测中心(北京)提供的6份饲料、饲料原料和宠物饲料样品,分别采用免疫亲和柱净化法和本研究建立的免疫磁珠净化法进行分析检测。
此外,为考察方法的实际样品检测能力,本研究收集了送检饲料和饲料原料样品,包括配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和宠物饲料以及玉米粉、豆粕、DDGS、花生粕、棕榈仁粕、米糠粕、小麦粉等饲料原料样品合计223份,采用本研究所建立的全自动免疫磁珠净化结合HPLC测定ZEN含量。

1.5 数据处理与分析

采用Excel 2021进行试验数据处理和统计分析,使用Origin 9.0进行线性回归分析和相关图形绘制,组间差异通过SPSS 26.0软件对所得试验数据进行双尾t检验,P<0.05为差异显著[31]。

2 结果与分析

2.1 免疫磁珠粒径大小的选择

粒径的大小对于免疫磁珠的性能指标有着较大影响,如表1所示,ZEN的微米级磁珠比纳米级磁珠有着更高的抗体载量和回收率,分析原因可能是由于单克隆抗体通常为几个纳米,其与纳米级磁珠的耦合量较小,同时耦合后的纳米级磁珠的分散性也较差,不利于后续的免疫亲和反应,从而导致回收率偏低。相对而言,微米级磁珠具有更高的抗体载量和流散性,因此选择微米级磁珠作进行后续试验。
表1 不同粒径免疫磁珠性能比较

Table 1 Comparison of performance of IMBs with different particle sizes (n=6)

项目
Items		 ZEN含量
ZEN content/
(mg/kg)		 测定含量
Detected
content/(mg/kg)		 回收率
Recovery/%		 平均回收率
Mean
recovery/%		 相对标
准偏差
RSD/%
纳米级磁珠(粒径约10 nm)
Nanoscale beads
(particle size about 10 nm)		 1.0 0.707 70.7
71.90
4.52
0.674 67.4
0.739 73.9
0.745 74.5
0.693 69.3
0.756 75.6
微米级磁珠(粒径约2 μm)
Micron beads
(particle size about 2 μm)		 1.0 0.973 97.3
99.27
1.09
0.988 98.8
0.996 99.6
1.003 100.3
0.999 99.9
0.997 99.7

2.2 免疫磁珠反应时间优化

免疫磁珠需要与样品中的目标化合物进行充分结合,以达到最佳分离效果,其与样品提取液的反应时间是磁珠净化的关键。如图2所示,当反应时间在10 min以上时,免疫磁珠对ZEN的吸附趋于稳定,回收率在99.1%~100.1%,表明10 min的反应时间能够满足免疫磁珠与目标物作用的要求。考虑到实际检测过程中不同样品基质的影响,本试验将反应时间适当延长至12 min,以确保免疫磁珠对不同样品基质均能取得良好的分离富集效果。
图2 不同反应时间对免疫磁珠富集玉米赤霉烯酮的影响

Fig.2 Effects of different reaction time on enrichment of ZEN by IMBs (n=6)

2.3 ZEN含量标准曲线、检出限(LOD)和LOQ

如表2所示,ZEN含量在0.01~1.00 μg/mL线性关系良好,相关系数(R2)为0.999 9,能够满足检测分析的要求。以3倍信噪比(S/N)为LOD,10倍S/N为LOQ,方法的LOD、LOQ分别为2和10 μg/kg,方法的LOQ能够满足强制性国家标准《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)对于ZEN在饲料和饲料原料中限量规定(≤0.1~1.5 mg/kg)的检测需求。
表2 ZEN含量标准曲线、检出限和定量限

Table 2 Standard curve, LOD and LOQ of ZEN content

项目
Item		 线性范围
Linear range/(μg/mL)		 回归方程
Regression equation		 相关系数
R2		 检出限
LOD/(μg/kg)		 定量限
LOQ/(μg/kg)
玉米赤霉烯酮含量
ZEN content		 0.01~1.00 y=0.131 1x+3.992 6 0.999 9 2 10

2.4 方法的准确度和精密度

方法的准确度和精密度结果见表3,代表性的HPLC色谱图见图3,在0.01、0.02、0.10和1.00 mg/kg添加水平下,方法的批内平均回收率为86.90%~100.27%,批内RSD为3.18%~9.88%;批间平均回收率为88.70~99.59%,批间RSD为4.94%~9.40%,表明该方法的准确度、精密度良好,适用于饲料中ZEN含量的准确快速测定。
表3 方法的准确度和精密度结果

Table 3 Accuracy and precision results of method %

样品
Samples		 含量
Content/
(mg/kg)		 批内平均回收率
Intra-day recovery/%
(n=6)		 批内相对标准偏差
Intra-day RSD
(n=6)		 批间平均回收率
Inter-day recovery/%
(n=18)		 批间相对标准偏差
Inter-day RSD
(n=18)
玉米粉
Corn flour		 0.01 94.38 3.18 96.72 4.94
0.02 96.23 8.33 97.83 7.49
0.10 99.87 7.63 98.22 5.92
1.00 86.90 7.71 89.47 6.92
干酒糟及其可溶物
DDGS		 0.01 99.22 8.95 97.10 7.16
0.02 99.95 8.37 98.17 8.26
0.10 99.47 9.00 96.91 7.63
1.00 87.05 5.66 95.16 9.40
豆粕
Soybean meal		 0.01 97.23 7.92 98.33 7.68
0.02 100.27 9.76 98.77 8.73
0.10 94.71 8.16 95.83 6.65
1.00 87.97 6.50 92.44 7.92
花生粕
Peanut meal		 0.01 98.75 7.45 98.84 7.23
0.02 89.53 4.73 91.19 5.86
0.10 99.42 8.68 96.52 8.34
1.00 97.73 8.15 98.25 7.16
小麦粉
Wheat flour		 0.01 96.54 6.98 98.23 6.77
0.02 98.05 5.08 97.84 7.67
0.10 98.39 9.88 98.56 9.12
1.00 99.21 8.58 97.84 8.20
生长肥育猪配合饲料
Growing pig
formula feed		 0.01 89.05 8.52 96.41 9.19
0.02 99.38 6.17 98.84 6.28
0.10 98.01 8.84 98.43 7.67
1.00 92.73 4.61 96.67 7.14
蛋鸡配合饲料
Laying hen
formula feed		 0.01 97.77 5.63 99.30 6.25
0.02 94.17 9.24 97.27 7.06
0.10 98.38 9.22 97.30 8.89
1.00 99.39 9.43 98.03 7.39
草鱼配合饲料
Grass carp
formula feed		 0.01 98.06 5.10 98.29 8.13
0.02 97.20 7.42 98.13 7.34
0.10 90.62 7.81 95.12 8.06
1.00 98.09 8.72 98.07 7.45
仔猪浓缩饲料
Piglet concentrated
feed		 0.01 99.73 5.45 98.02 6.11
0.02 98.79 6.04 98.13 6.38
0.10 95.25 9.80 97.74 8.16
1.00 88.12 4.30 88.70 6.32
牛精料补充料
Cow concentrate
supplement		 0.01 99.16 8.74 98.15 6.67
0.02 100.33 6.10 99.59 6.82
0.10 98.38 5.27 96.03 7.67
1.00 97.71 5.57 96.44 5.71
羊精料补充料
Sheep concentrate
supplement		 0.01 95.22 3.43 95.55 8.36
0.02 96.66 9.31 96.12 7.43
0.10 100.04 6.82 97.10 6.88
1.00 95.86 8.42 97.34 8.02
训练犬全价料
Training dog full feed		 0.01 94.14 7.74 96.49 7.58
0.02 98.12 8.36 95.23 8.18
0.10 98.37 4.30 98.64 5.83
1.00 98.69 7.39 93.98 9.31
猫全价料
Cat full feed		 0.01 95.21 7.01 96.84 6.90
0.02 97.88 7.90 97.57 8.79
0.10 95.46 4.08 95.23 6.19
1.00 89.63 4.36 88.92 5.98
图3 空白玉米(a)和玉米添加0.01 mg/kg(b)以及豆粕添加0.10 mg/kg(c)色谱图

Fig.3 Chromatograms of blank corn (a), 0.01 mg/kg corn addition (b) and 0.10 mg/kg soybean meal addition (c)

2.5 与传统IAC和其他已报道免疫磁珠方法的比较

传统IAC净化与本研究建立的免疫磁珠净化方法比较结果如表4所示,可见2组测定结果之间无显著差异(P>0.05),表明本研究建立的免疫磁珠净化方法与现行有效国家标准规定的免疫亲和柱净化法吻合度良好。此外,采用免疫磁珠技术对食品和饲料原料中的ZEN含量进行分析,国内外已有相关研究报道[33⇓⇓⇓-37],本研究与已报道方法的对比见表5。
表4 免疫磁珠和免疫亲和柱净化结果比较

Table 4 Comparison of immunomagnetic beads and immunoaffinity columns results (n=6) μg/kg

序号
No.		 样品名称
Sample name		 免疫亲和柱测定结果
IAC measurement
result		 免疫磁珠测定结果
IMBs measurement
result		 标示ZEN含量
Labeled ZEN
content
1 玉米粉标准物质Corn flour standard substance 108.6±24.0 110.1±14.2 94.3±41.5
2 小麦粉质控样Wheat flour quality control sample 78.8±11.3 76.7±9.3 69.9±30.7
3 动物饲料标准物质Animal feed standard substance 157.3±21.5 158.0±10.6 147±35
4 宠物犬料质控样Pet dog feed quality control sample 124.5±16.9 126.0±7.8 116±22
5 猪配合饲料Pig formula feed 820.0±24.4 827.0±16.7
6 蛋鸡配合饲料Laying hens formula feed 229.0±19.9 225.7±10.3
7 泌乳牛精料补充料Lactating cow concentrate supplement 159.0±16.5 151.6±9.7
8 干酒糟及其可溶物DDGS 4 472.0±130.0 4 288.0±97.2
9 种犬全价料Breeding dog full feed 41.5±6.7 45.6±3.3
10 训练犬全价料Training dog full feed 44.0±8.1 39.2±4.9

同行数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05)。

In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表5 与其他已报道免疫磁珠检测ZEN含量方法的比较

Table 5 Comparison with the previously published IMBs methods for ZEN content detection

样品基质
Sample matrix		 净化技术
Clean-up technique		 检测方法
Detection method		 检出限
LOD/
(μg/kg)		 定量限
LOQ/
(μg/kg)		 参考文献
Reference
鸡和猪饲料
Chicken and pig feeds		 自动免疫磁珠 超高效液相色谱-荧光检测 4.5 15.0 [32]
粮食(玉米、全麦、糙米和小麦粉)
Foods (corn, whole wheat, brown
rice and wheat powder)		 自动免疫磁珠 超高效液相色谱-荧光检测 3.5 12.0 [33]
小麦Wheat 手动免疫磁珠 超高效液相色谱-串联质谱 1.0 [34]
玉米油Corn oils 免疫磁珠分散液-液微萃取 超高效液相色谱-
荧光检测		 3.3 10.0 [35]
饲料和谷物
Feeds and grains		 自动免疫磁珠 高效液相色谱-荧光检测 1.78 [36]
食品Foods 手动免疫磁珠 高效液相色谱-串联质谱 0.1 0.3 [37]
饲料和饲料原料、宠物饲料
Feed and feed raw materials,
pet feeds		 自动免疫磁珠 高效液相色谱-荧光检测 2 10 本研究

2.6 实际样品测定

实际样品测定结果如表6所示,饲料原料中ZEN的检出率、检出含量均较高,其中玉米粉检出率达93.8%,最高检出含量达4 380 μg/kg,按照《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)限量(≤0.5 mg/kg)判定超标率为9.4%。值得注意的是,配合饲料中ZEN的检出含量、检出率和超标率均较高,提示需要加强对于饲料产品中真菌毒素的防控。
表6 饲料样品中玉米赤霉烯酮的检测含量

Table 6 Detected contents of ZEN in feed samples

样品
Samples		 样品数量
Sample number		 检出含量
Detection content/
(μg/kg)		 平均含量
Mean content/
(μg/kg)		 检出率
Detection
rate/%		 超标率
Over rate/%
配合饲料Formula feed 51 27.9~924.0 343.2 49.0 39.2
浓缩饲料Concentrate Feed 13 11.7~29.4 20.6 38.5 0
精料补充料Concentrate supplement 34 59.9~1 280.0 464.3 20.6 5.9
玉米粉Corn flour 32 12.8~4 380.0 454.5 93.8 9.4
豆粕Soybean meal 14 11.9~35.8 22.6 28.6 0
干酒糟及其可溶物DDGS 31 13.1~68.0 30.5 38.7 0
花生粕Peanut meal 7 27.3~39.3 33.3 71.4 0
棕榈仁粕Palm kernel meal 5 12.1~22.6 18.6 80.0 0
米糠粕Rice bran meal 4 20.0~44.7 32.3 75.0 0
小麦粉Wheat flour 9 19.0~439.0 21.0 77.8 0
宠物饲料Pet feed 23 30.9~43.6 38.2 21.7 0

3 讨论

3.1 免疫磁珠净化方法建立

传统SPE、IAC净化技术往往是固体吸附材料保持不动,带有目标化合物的提取溶液相对移动,而免疫磁珠恰恰相反,其借助于免疫学原理快速识别、捕获目标化合物,然后通过磁珠在磁场中的运动使得目标物与基质溶液相分离(固体移动)[23,26]。具体过程是将包被有特异性抗体的免疫磁珠加入到提取溶液中,提取液中的抗原(目标物)即与免疫磁珠上的抗体进行特异性结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物,这种复合物具有较强的磁响应性,可在外加磁场的作用下进行定向移动,从而达到快速分离特定目标物的目的[27-28]。此外,由于免疫磁珠实现了目标物与基质溶液的特异性分离,结合HPLC或LC-MS/MS可显著降低本底值,改善S/N,从而提升方法的灵敏度和准确度,达到了既快速简便又定量准确的要求[25]。本研究建立了基于免疫磁珠快速分离、富集饲料中ZEN的方法,并在此基础上研究制定了我国饲料行业首个关于免疫磁珠技术的中国饲料工业协会团体标准,为基层质检机构和饲料企业提供了一个快速高通量且成本相对较低的饲料中ZEN含量定量分析方法。需要说明的是,本研究与国家标准《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》(GB/T 28716—2012)相比,主要区别在于免疫磁珠、IAC净化技术的不同,其余提取方法、HPLC分析条件并无二致,可互相替代使用。

3.2 免疫磁珠与传统IAC净化方法的比较

饲料样品成分复杂,基质效应能够极大地干扰目标化合物的检测分析,因此需要在仪器分析前对样品进行净化处理,IAC净化是真菌毒素检测最常使用的净化技术[12]。因此,本研究将免疫磁珠与传统IAC净化进行了比较,经双尾t检验分析,免疫磁珠与传统IAC净化检测结果具有良好的一致性,可以进行相互替代使用,与陈金男等[26]、Chen等[28]、Wang等[29]和Liu等[38]的研究结果一致。然而,免疫磁珠净化方法配套使用的真菌毒素全自动净化仪一次可同时处理10份样品,单次净化程序约20 min,平均每个样品处理时间仅约为2 min;传统IAC净化手动操作对于流速有较高的要求,IAC柱滤过流速往往较为缓慢,导致全程需要2~3 h,可见相较于IAC净化,免疫磁珠在净化时间上具有绝对优势,可实现饲料中ZEN含量的快速高通量检测分析。因此,在处理大批量饲料样本时,全自动免疫磁珠净化可显著提高工作效率,降低检测偏差。

3.3 与其他已报道免疫磁珠方法的对比

真菌毒素检测中,样品前处理是关键步骤,免疫磁珠净化技术因其快速、简便,目前国内外已有将其运用于真菌毒素分析的相关研究报道[32⇓⇓⇓⇓-37]。王蒙等[32]建立了自动免疫磁珠净化超高效液相色谱-荧光检测器(UPLC-FLD)测定饲料中ZEN含量的方法,该方法的LOD为4.5 μg/kg,LOQ为15.0 μg/kg,加标回收率良好(92.6%~112.9%),但仅对鸡饲料、猪饲料2种基质进行了准确度和精密度验证。陈金男等[33]建立了粮食中ZEN含量的免疫磁珠自动净化UPLC-FLD方法,LOD和LOQ分别为3.5、12.0 μg/kg,也仅对玉米全粉、全麦粉、糙米粉、小麦粉4种粮食基质进行了准确度和精密度考察。Ni等[35]所建立的基于免疫磁珠技术的分散液-液微萃取方法,同样采用UPLC-FLD方法测定,LOD、LOQ分别为3.3 μg/kg和10 μg/kg,该方法准确度(回收率为85.7%~89.0%)、精密度(RSD≤2.9%)均较好,但仅适用于玉米油中ZEN含量的定量分析。本研究采用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)方法进行测定,方法的LOD、LOQ分别为2、10 μg/kg,略优于上述已报道的方法。此外,本文是中国饲料工业协会团体标准制定项目的研究成果,鉴于标准制定的严谨性,我们通过国家饲料质量检验检测中心(北京)进行样品采集,采用玉米粉、DDGS、豆粕、花生粕、小麦粉等饲料原料,猪、鸡、鱼配合饲料和浓缩饲料、牛羊精料补充料,犬、猫粮等宠物饲料,以及有证标准物质进行了系统性的方法学考察,并对200多种实际饲料样本进行了分析,充分验证了方法性能,表明本研究建立的方法适用于各类饲料基质中ZEN含量的测定。

4 结论

本研究建立了全自动免疫磁珠净化结合高效液相色谱仪测定饲料中ZEN含量的方法。ZEN在0.01~1.00 μg/mL范围内线性关系良好,方法LOD为2 μg/kg,LOQ为10 μg/kg;ZEN在4个添加水平(0.01、0.02、0.10和1.00 mg/kg)的平均回收率为86.90%~100.27%,RSD为3.18%~9.88%。该方法操作简便,可批量自动化处理样品,显著提高工作效率,适用于大批量饲料样本中ZEN含量的定量分析。

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