动物营养学报 >

2024 , Vol. 36 >Issue 12: 8014 - 8024

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.684

研究论文

枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉鸡肠道养分转运载体基因表达的影响

  • 任志雄 ,
  • 杨敏敏 ,
  • 李金录 ,
  • 唐德富 ,
  • 秦士贞 , * ,
  • 史兆国 , *
展开
  • 甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州 730070
*秦士贞,副教授,硕士生导师,E-mail: ;
史兆国,教授,硕士生导师,E-mail:

任志雄(2000—),男,河北张家口人,硕士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-06-25

  网络出版日期: 2024-12-12

基金资助

国家自然科学基金项目(32360848)

兰州市青年科技人才创新项目(2023-QN-139)

收起

Effects of Bacillus subtilis on Intestinal Nutrient Transporter Gene Expression of Lipopolysaccharide in Broilers

  • REN Zhixiong ,
  • YANG Minmin ,
  • LI Jinlu ,
  • TANG Defu ,
  • QIN Shizhen , * ,
  • SHI Zhaoguo , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
*QIN Shizhen, associate professor, E-mail: ;
SHI Zhaoguo, professor, E-mail:

Received date: 2024-06-25

  Online published: 2024-12-12

Fold

摘要

本试验以枯草芽孢杆菌(BS)为饲料添加剂,对脂多糖(LPS)应激下肉鸡肠道养分转运载体基因的表达情况进行研究。采用2×2双因素设计,因素1为枯草芽孢杆菌添加与否(0和200 g/t),因素2为LPS应激与否(0和500 μg/kg BW)。选取体重相近、健康的1日龄爱拔益加肉鸡(公雏)192只,随机分为4组,每组设6个重复,每个重复8只鸡。对照组饲喂基础饲粮以及口服生理盐水;试验Ⅰ组饲喂基础饲粮以及口服LPS;试验Ⅱ组饲喂添加了枯草芽孢杆菌的基础饲粮以及口服生理盐水;试验Ⅲ组饲喂添加了枯草芽孢杆菌的基础饲粮以及口服LPS。试验分为应激前期(第1~14天)、LPS应激期(第15~21天)和应激后恢复期(第22~28天)3个阶段,共28 d。在使用第21天和第28天采集十二指肠、空肠和回肠样品,随后从样品中提取相关基因mRNA并进行反转录,然后通过荧光定量PCR进行基因表达的检测。结果显示:LPS应激使试验第21天时肉鸡整个肠道中B0系统中性氨基酸转运载体(B0AT1)、钠依赖性葡萄糖转运载体1(SGLT1)、脂肪酸转运载体4(FATP4)mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);饲粮中添加枯草芽孢杆菌和LPS应激对肉鸡十二指肠中B0AT1 mRNA相对表达量有显著的交互作用(P<0.05);饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉鸡空肠中SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量(P<0.05)。饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高了试验第28天时肉鸡回肠中B0AT1 mRNA相对表达量(P<0.05)。综上可知,LPS应激会使肉鸡肠道中养分转运载体基因表达下调,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以上调肉鸡肠道中养分转运载体基因的表达,说明枯草芽孢杆菌能够缓解LPS应激对肉鸡肠道养分转运造成的负面影响,使肉鸡肠道养分转运载体基因正常表达。

关键词： 枯草芽孢杆菌; 肉鸡; 脂多糖应激; 养分转运载体基因

本文引用格式

任志雄 , 杨敏敏 , 李金录 , 唐德富 , 秦士贞 , 史兆国 . 枯草芽孢杆菌对脂多糖应激肉鸡肠道养分转运载体基因表达的影响[J]. 动物营养学报, 2024 , 36(12) : 8014 -8024 . DOI: 10.12418/CJAN2024.684

Abstract

The aim of this experiment was to study the gene expression of intestinal nutrient transporter of broilers under lipopolysaccharide (LPS) stress using Bacillus subtilis as feed additive. A 2×2 two-factor design was adopted, factor 1 was whether Bacillus subtilis was added or not (0 and 200 g/t), and factor 2 was whether LPS was stressed or not (0 and 500 μg/kg BW). A total of 192 healthy 1-day-old Arbor Acres broilers (male) with similar body weight were selected. They were randomly divided into 4 groups with 6 replicates per group and 8 chickens in per replicate. Broilers in control group were fed a basal diet and given normal saline through oral administration. Broilers in experimental group Ⅰ were fed the basal diet and given LPS through oral administration. Broilers in experimental group Ⅱ were fed the basal diet supplemented with Bacillus subtilis and given normal saline through oral administration. Broilers in experimental group Ⅲ were fed the basal diet supplemented with Bacillus subtilis and given LPS through oral administration. The experiment was divided into three stages of pre-stress (days 1 to 14), LPS stress (days 15 to 21) and stress recovery (days 22 to 28), with a total of 28 days. Duodenum, jejunum and ileum samples were collected. Subsequently, the relevant mRNA was extracted from the samples and reverse-transcribed, and the expression of genes detected by fluorescent quantitative PCR. The results showed as follows: on day 21 of the experiment, LPS stress significantly reduced the mRNA relative expression levels of B0 system neutral amino acid transporter 1 (B0AT1 ), sodium-dependent glucose transporter 1 (SGLT1) and fatty acid transporter 4 (FATP4) in the whole intestine of broilers (P<0.05); there was a significant interaction between dietary supplementation of Bacillus subtilis and LPS stress on B0AT1 mRNA relative expression level in duodenum of broilers (P<0.05); dietary supplementation of Bacillus subtilis significantly increased the mRNA relative expression levels of SGLT1 and FATP4 in jejunum of broilers (P<0.05). On day 28 of the experiment, dietary supplementation of Bacillus subtilis significantly increased the mRNA relative expression level of B0AT1 in ileum of broilers (P<0.05). In conclusion, LPS stress can down-regulate the expression of intestinal nutrient transporter genes in broilers, and dietary supplementation of BS can up-regulate the expression of intestinal nutrient transporter genes in broilers, those results indicate that Bacillus subtilis can alleviate the negative effect of LPS stress on intestinal nutrient transport in broilers, and enable normal expression of intestinal nutrient transporter genes in broilers.

Key words： Bacillus subtilis; broilers; lipopolysaccharide stress; nutrient transporter gene

随着人们生活水平的提高,市场对于鸡肉的需求量不断地加大,使得肉鸡养殖场逐渐规模化集约化,而肉鸡的肠道健康问题又是集约化规模化养殖的重点和难点。肠道的关键功能是消化和吸收营养物质[1]。肠道疾病的出现会对肉鸡的生长发育产生负面影响。饲粮在动物肠道消化吸收过程中,养分转运载体起运输作用,能够促进营养物质进入肠上皮细胞。氨基酸、短肽、脂肪酸、维生素和矿物质转运载体是养分转运载体的主要类别[2-3]。Habashy等[4]研究发现,在热应激条件下,参与摄取的果糖和葡萄糖向门静脉毛细血管转移的钠依赖性葡萄糖转运蛋白(SGLT)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)基因在肉鸡肠道中的表达均下调。为了能够更好地研究家禽的免疫应激,利用免疫应激源创建免疫应激模型是一种常用的方法。Li等[5]和Zhang等[6]在试验中通过注射脂多糖(LPS)建立了肉鸡免疫应激模型。LPS可诱导氧化应激[7],它可被Toll样受体4(TLR4)识别,激活下游核因子-κB(NF-κB)信号通路,最终导致促炎细胞因子和活性氧(ROS)的释放,进而加剧氧化应激[8]。枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性的优良营养细菌,具有高抗逆性的特点,其内生孢子和抗菌剂可以在恶劣环境中产生[9-10]。研究表明,枯草芽孢杆菌改善了肠道的形态和结构,增强动物机体抵抗疾病和产生抗氧化剂的能力,保持畜禽肠道健康[11]。本课题组在前期研究中发现,饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够提高血清抗氧化性能和降低炎性细胞因子的含量,可以缓解由LPS应激所引起的肠促炎细胞因子的表达上调,使得紧密连接蛋白[封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)]和黏蛋白2(MUC2)mRNA的表达量下调,肠绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值有所提高,有效缓解免疫应激造成的肠道功能损伤,促进肠道组织生长发育,提高肠道的消化吸收,从而改善肉鸡的生长性能[12-13]。本课题组在前期试验的基础上,以肉鸡为研究对象,在饲粮中添加枯草芽孢杆菌,将LPS作为免疫应激源建立肉鸡免疫应激模型,研究枯草芽孢杆菌对免疫应激肉鸡肠道养分转运载体基因表达的影响,以期为肉鸡养殖中改善肠道健康提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌(活菌数≥5.0×109 CFU/g)购自福建中基生物工程有限公司。LPS(血清型为 O55:B5)购自武汉塞维尔生物科技有限公司。1日龄爱拔益加(AA)肉鸡购自北京爱拔益加家禽育种有限公司。

1.2 试验设计

本试验将饲粮(饲喂基础饲粮或基础饲粮+200 g/t枯草芽孢杆菌)和LPS应激(口服LPS或生理盐水)2个因素结合起来,采用2×2双因素设计,将体重相近、体况良好的192只1日龄AA肉鸡(公雏)随机分为4组,每组设6个重复,每个重复8只鸡。对照组饲喂基础饲粮以及口服生理盐水;试验Ⅰ组饲喂基础饲粮以及口服LPS;试验Ⅱ组饲喂基础饲粮+200 g/t枯草芽孢杆菌以及口服生理盐水;试验Ⅲ组饲喂基础饲粮+200 g/t枯草芽孢杆菌以及口服LPS。试验分为应激前期(第1~14天)、LPS应激期(第15~21天)和应激后恢复期(第22~28天)3个阶段,共28 d。

1.3 基础饲粮

根据NRC(1994)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制基础饲粮,其组成及营养水平同文献[12]。

1.4 饲养管理

动物试验在甘肃农业大学动物实训中心开展,试验开展符合相关动物福利标准,试验伦理审查申请编号:GSAU-Eth-AST-2020-003。试验采用3层笼养,试验前对鸡舍及其所有相关设备使用石灰石进行消毒。在雏鸡进舍之前,维持鸡舍温度在一定范围。整个试验过程中,鸡可以自由采食和饮水,维持全天持续光照。按照鸡的免疫要求定期注射疫苗。

1.5 LPS免疫应激处理

LPS溶液制备:取5 mg LPS粉,加入到10 mL经过高压灭菌的生理盐水中,搅拌均匀,配制成0.5 mg/mL的LPS溶液。在试验第14、16、18、20天同一时间分别给试验Ⅰ组和试验Ⅲ组肉鸡口腔灌服配制好的LPS溶液(500 μg/kg BW)(LPS灌服剂量参照李悦等[14]的报道,免疫应激模型建立方式参照Iqbal等[15]和申佳佳[16]的报道)。对照组以及试验Ⅱ组同步灌服等量生理盐水,以避免试验误差。

1.6 样品采集

肉鸡在养殖到第21天和第28天时,从每个重复中选取1只接近平均体重的体况良好的试验鸡,屠宰后取出肠道,在每个肠道结节处分别将十二指肠、空肠和回肠分开,迅速分割、切除各肠段的中心部分。然后用生理盐水冲洗肠道食糜。为了测量养分转运载体基因mRNA的相对表达量,用灭菌后的刮板从肠道上刮取肠黏膜,放入2 mL无菌无RNA酶的冻存管中,在液氮中暂时保存后,按不同肠段将样品储存在-80 ℃的冰箱中。

1.7 肠道养分转运载体基因表达的测定

采用常规RNA提取试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)提取十二指肠、空肠和回肠的总RNA。采用微量核酸蛋白浓度测定仪(NanoDrop-2000,Thermo,美国)测定所选择养分转运载体RNA的浓度和纯度。使用含去基因组DNA的定量反转录试剂盒(R223,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)去除基因组DNA,在42 ℃下反应2 min,然后在50 ℃下反应15 min,最后在85 ℃下反应15 min。将反转录产生的cDNA保存在-20 ℃。
采用SYBR-Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒,按照20 μL的反应体系,使用Roche 480 Light Cycler荧光定量仪进行PCR反应。反应程序为:95 ℃预变性5 min,然后95 ℃变性15 s,退火温度60 ℃ 1 min,共40个循环。目的基因用双内参法[β-肌动蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)]校正,目的基因mRNA相对表达量使用2-△△Ct法计算。目的基因为小肽转运体1(PepT1)、B0系统中性氨基酸转运载体1(B0AT1)、酸性氨基酸转运体3(EATT3)、钠依赖性葡萄糖转运载体1(SGLT1)、脂肪酸转运载体4(FATP4),鉴定特异性后,由擎科生物科技有限公司合成引物。目的基因和内参基因的引物序列见表1。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名称
Gene names		 GenBank登录号
GenBank accession
number		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 产物长度
Product size/bp
β-肌动蛋白
β-actin		 NM_205518.1 F:ACCTGAGCGCAAGTACTCTGTCT
R:CATCGTACTCCTGCTTGCTGAT		 95
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GADPH		 NM_204305.1 F:AGAACATCATCCCAGCGT
R:AGCCTTCACTACCCTCTTG		 182
小肽转运体1
PepT1		 NM_204365 F:ACACGTTTGTTGCTCTGTGC
R:GACTGCCTGCCCAATTGTAT		 122
碱性氨基酸转运载体1
CAT1		 NM_060243 F:ATTTGGTGCTCGTGTTCCT
R:TTGTAAATGTCCCGTTCAGTC		 420
B0系统中性氨基酸转运载体1
B0AT1		 XM_419056 F:TATCCTGGCTGGGTCTATGC
R:AGGCCTGTACGATCCCTTCT		 125
酸性氨基酸转运体3
EATT3		 XM_424930 F:ACCCTTTTGCCYYGGAAACT
R:TTGAGATGTTTGCGTGAAG		 122
钠依赖性葡萄糖转运载体1
SGLT1		 XM_415247 F:GCTTCACTCTTTGCCAGTAACA
R:CATTCCATTCATACCCTCCAAT		 100
脂肪酸转运载体4
FATP4		 XM_415504 F:ATACCTCTGGCACTACGGGAAT
R:CATACATCACATCATCGGGTCT		 117

1.8 数据处理与分析

试验结果先通过Excel 2010进行排列统计以及简单的分析,然后在SPSS 26.0统计软件中采用一般线性模型进行双因素方差分析。每个重复作为1个试验单元。主效应包括饲粮中添加枯草芽孢杆菌和对试验动物的脂多糖应激处理以及它们之间的交互作用。当方差分析出现显著差异时,使用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示,P>0.10表示差异不显著,0.05≤P<0.10表示差异有显著趋势,P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 不同处理对肉鸡十二指肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

由表2可知,试验第21天,饲粮中添加枯草芽孢杆菌与LPS应激对肉鸡十二指肠中B0AT1 mRNA的相对表达量存在显著的交互作用(P<0.05)。LPS应激下,饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉鸡十二指肠中B0AT1 mRNA相对表达量(P<0.05)。LPS应激显著下调了肉鸡十二指肠中PepT1、B0AT1、SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量(P<0.05)。由表3可知,试验第28天,饲粮中添加枯草芽孢杆菌有提高肉鸡十二指肠中CAT1(P=0.066)、B0AT1(P=0.099)、EATT3(P=0.072)和SGLT1(P=0.062)mRNA相对表达量的趋势。在LPS应激下,肉鸡十二指肠中EATT3 mRNA相对表达量呈下降趋势(P=0.067)。
表2 不同处理对21日龄肉鸡十二指肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 2 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in duodenum of broilers at 21 days of age

项目
Items		 小肽转运载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡萄
糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸
转运载体4
FATP4
处理Treatments

LPS(-)		 BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00a 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.11±0.14 1.04±0.26 1.01±0.09a 0.96±0.03 0.97±0.08 1.03±0.30

LPS(+)		 BS(-) 0.77±0.12 0.82±0.16 0.63±0.12b 0.80±0.09 0.74±0.07 0.64±0.14
BS(+) 0.94±0.29 0.91±0.20 0.95±0.08a 0.93±0.29 0.91±0.08 0.89±0.29
主效应Main effects

BS		 BS(-) 0.89±0.15 0.91±0.14 0.82±0.21 0.90±0.12 0.87±0.14 0.82±0.22
BS(+) 1.02±0.23 0.97±0.23 0.98±0.09 0.94±0.19 0.94±0.13 0.96±0.28

LPS		 LPS(-) 1.06±0.11 1.02±0.17 1.00±0.06 0.98±0.03 0.99±0.06 1.01±0.20
LPS(+) 0.86±0.22 0.87±0.19 0.79±0.19 0.86±0.21 0.82±0.15 0.77±0.25
P值P-value
BS 0.140 0.519 0.002 0.583 0.225 0.220
LPS 0.039 0.121 <0.001 0.152 0.009 0.044
BS×LPS 0.789 0.801 0.003 0.267 0.096 0.313

BS:枯草芽孢杆菌;BS(-):不添加枯草芽孢杆菌;BS(+):添加枯草芽孢杆菌;LPS:脂多糖;LPS(-):不进行脂多糖应激;LPS(+):进行脂多糖应激;BS×LPS:枯草芽孢杆菌与脂多糖的交互作用。4个处理之间,同列数据上标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05),上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

BS: Bacillus subtilis; BS (-): no Bacillus subtilis; BS (+): added Bacillus subtilis; LPS: lipopolysaccharide; LPS (-): no lipopolysaccharide stress; LPS (+): lipopolysaccharide stress; BS×LPS: the interaction between Bacillus subtilis and lipopolysaccharide. Among the 4 treatments, data in the same column with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 不同处理对28日龄肉鸡十二指肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 3 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in duodenum of broilers at 28 days of age

项目
Items		 小肽转
运载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡
萄糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸转
运载体4
FATP4
处理Treatments
LPS(-) BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00a 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.21±0.40 1.24±0.22 1.17±0.20a 1.16±0.17 1.22±0.03 1.14±0.15
LPS(+) BS(-) 0.86±0.26 0.97±0.12 0.95±0.19b 0.93±0.10 0.97±0.14 0.93±0.09
BS(+) 1.07±0.28 1.04±0.16 1.08±0.22 1.00±0.12 1.03±0.23 1.00±0.17
主效应Main effects
BS BS(-) 0.91±0.19 0.99±0.08 0.97±0.13 0.96±0.08 0.99±0.09 0.97±0.07
BS(+) 1.14±0.33 1.14±0.21 1.13±0.20 1.08±0.16 1.12±0.18 1.07±0.17
LPS LPS(-) 1.09±0.30 1.12±0.19 1.09±0.16 1.08±0.14 1.11±0.12 1.07±0.12
LPS(+) 0.97±0.28 1.00±0.14 1.01±0.20 0.96±0.11 1.00±0.18 0.97±0.13
P值P-value
BS 0.124 0.066 0.099 0.072 0.062 0.116
LPS 0.415 0.145 0.419 0.067 0.125 0.123
BS×LPS 0.888 0.268 0.843 0.441 0.240 0.608

2.2 不同处理对肉鸡空肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

从表4和表5可以看出,在整个试验期内,饲粮中添加枯草芽孢杆菌和LPS应激对肉鸡空肠中PepT1、CAT1、B0AT1、EATT3、SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量均无显著交互作用(P>0.05)。试验第21天,饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉鸡空肠中SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量(P<0.05),LPS应激显著降低了肉鸡空肠中B0AT1、EATT3、SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量(P<0.05)。试验第28天,LPS应激有降低肉鸡空肠中PepT1(P=0.082)、SGLT1(P=0.098)和FATP4(P=0.081)mRNA相对表达量的趋势。
表4 不同处理对21日龄肉鸡空肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 4 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in jejunum of broilers at 21 days of age

项目
Items		 小肽转
运载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡
萄糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸转
运载体4
FATP4
处理Treatments

LPS(-)		 BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.01±0.29 1.07±0.15 1.04±0.15 1.02±0.15 1.10±0.10 1.10±0.07

LPS(+)		 BS(-) 0.73±0.14 0.91±0.15 0.86±0.11 0.79±0.06 0.60±0.20 0.76±0.10
BS(+) 0.94±0.63 0.96±0.13 0.91±0.13 0.86±0.17 0.93±0.14 0.88±0.15
主效应Main effects

BS		 BS(-) 0.86±0.17 0.95±0.11 0.93±0.10 0.89±0.12 0.80±0.25 0.88±0.14
BS(+) 0.98±0.46 1.01±0.14 0.97±0.15 0.97±0.17 1.01±0.15 0.99±0.16

LPS		 LPS(-) 1.00±0.19 1.03±0.10 1.02±0.10 1.01±0.10 1.05±0.09 1.05±0.07
LPS(+) 0.83±0.44 0.93±0.13 0.89±0.12 0.82±0.12 0.76±0.24 0.82±0.13
P值P-value
BS 0.538 0.361 0.470 0.459 0.008 0.038
LPS 0.357 0.128 0.038 0.007 0.001 0.001
BS×LPS 0.571 0.890 0.932 0.679 0.121 0.883
表5 不同处理对28日龄肉鸡空肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 5 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in jejunum of broilers at 28 days of age

项目
Items		 小肽转运
载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡萄
糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸转
运载体4
FATP4
处理Treatments

LPS(-)		 BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.05±0.03 1.17±0.29 1.12±0.36 1.18±0.36 1.21±0.25 1.22±0.19

LPS(+)		 BS(-) 0.94±0.07 0.93±0.11 0.91±0.25 1.01±0.28 0.92±0.19 0.90±0.21
BS(+) 0.98±0.12 1.00±0.31 1.02±0.28 0.98±0.23 0.96±0.19 0.98±0.22
主效应Main effects

BS		 BS(-) 0.97±0.05 0.97±0.08 0.95±0.17 1.01±0.18 0.96±0.13 0.95±0.15
BS(+) 1.01±0.09 1.08±0.29 1.07±0.30 1.08±0.30 1.08±0.24 0.95±0.15

LPS		 LPS(-) 1.02±0.03 1.08±0.21 1.06±0.25 1.09±0.26 1.10±0.20 1.11±0.17
LPS(+) 0.96±0.09 0.96±0.22 0.96±0.25 1.00±0.24 0.94±0.17 0.94±0.20
P值P-value
BS 0.247 0.304 0.399 0.549 0.201 0.113
LPS 0.082 0.292 0.475 0.472 0.098 0.081
BS×LPS 0.859 0.648 0.971 0.426 0.381 0.443

2.3 不同处理对肉鸡回肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

从表6和表7可以看出,在整个试验期间,饲粮中添加枯草芽孢杆菌和LPS应激对肉鸡回肠中PepT1、CAT1、B0AT1、EATT3、SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量均无显著交互作用(P>0.05)。试验第21天,饲粮中添加枯草芽孢杆菌有提高肉鸡回肠中SGLT1 mRNA相对表达量的趋势(P=0.060),LPS应激显著降低了肉鸡回肠中B0AT1、SGLT1和FATP4 mRNA相对表达量(P<0.05)。试验第28天,饲粮中添加枯草芽孢杆菌显著提高了肉鸡回肠中B0AT1 mRNA相对表达量(P<0.05),并有提高SGLT1 mRNA相对表达量的趋势(P=0.071)。
表6 不同处理对21日龄肉鸡回肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 6 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in ileum of broilers at 21 days of age

项目
Items		 小肽转运
载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡萄
糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸转
运载体4
FATP4
处理Treatments

LPS(-)		 BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00a 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.03±0.37 1.01±0.39 1.08±0.18 1.14±0.37 1.10±0.37 1.02±0.12

LPS(+)		 BS(-) 0.70±0.31 0.77±0.11 0.70±0.14 0.83±0.30 0.64±0.15 0.80±0.12
BS(+) 0.91±0.36 0.92±0.21 0.93±0.30 1.00±0.23 0.96±0.03 0.88±0.09
主效应Main effects

BS		 BS(-) 0.85±0.26 0.89±0.14 0.85±0.19 0.91±0.22 0.82±0.21 0.90±0.13
BS(+) 0.97±0.35 0.96±0.29 1.01±0.24 1.07±0.29 1.03±0.25 0.95±0.12

LPS		 LPS(-) 1.01±0.25 1.00±0.25 1.04±0.12 1.07±0.25 1.05±0.25 1.01±0.08
LPS(+) 0.80±0.33 0.85±0.18 0.81±0.25 0.91±0.26 0.80±0.20 0.84±0.10
P值P-value
BS 0.449 0.511 0.117 0.250 0.060 0.289
LPS 0.196 0.194 0.033 0.250 0.029 0.003
BS×LPS 0.552 0.538 0.407 0.903 0.295 0.574
表7 不同处理对28日龄肉鸡回肠中养分转运载体基因mRNA相对表达量的影响

Table 7 Effects of different treatments on mRNA relative expression levels of nutrient transporter genes in ileum of broilers at 28 days of age

项目
Items		 小肽转
运载体1
PepT1		 碱性氨基酸
转运载体1
CAT1		 B0系统中性
氨基酸转
运载体1
B0AT1		 酸性氨基酸
转运载体3
EATT3		 钠依赖性葡萄
糖转运载体1
SGLT1		 脂肪酸转
运载体4
FATP4
处理Treatments

LPS(-)		 BS(-) 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
BS(+) 1.17±0.19 1.14±0.14 1.22±0.13 1.10±0.09 1.16±0.16 1.12±0.23

LPS(+)		 BS(-) 1.08±0.20 1.05±0.06 1.02±0.13 1.01±0.12 0.94±0.09 0.92±0.12
BS(+) 1.12±0.25 1.02±0.05 1.10±0.14 1.06±0.19 1.02±0.16 0.98±0.19
主效应Main effects

BS		 BS(-) 1.04±0.14 1.03±0.05 1.01±0.09 1.00±0.08 0.97±0.07 0.96±0.09
BS(+) 1.14±0.21 1.08±0.11 1.16±0.14 1.08±0.09 1.09±0.17 1.05±0.21

LPS		 LPS(-) 1.08±0.15 1.07±0.12 1.11±0.14 1.05±0.08 1.08±0.13 1.06±0.16
LPS(+) 1.10±0.22 1.04±0.05 1.06±0.13 1.03±0.10 0.98±0.15 0.95±0.15
P值P-value
BS 0.297 0.184 0.027 0.119 0.071 0.278
LPS 0.889 0.417 0.407 0.690 0.133 0.174
BS×LPS 0.524 0.054 0.270 0.571 0.539 0.672

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌对LPS应激肉鸡肠道小肽及氨基酸转运载体基因表达的影响

饲料经动物采食后,蛋白质被动物机体摄入,经过分解主要以小肽和氨基酸的形式被肠道吸收利用。文敏等[17]通过体外细胞摄取和体肠灌流试验考察后,证实PepT1参与并介导了小肠转运过程。位于小肠上皮细胞顶端的小肽转运载体能够将小肠吸收的小肽转运至细胞内,这一过程受氢离子(H+)驱动[18],进入细胞后,细胞质中的肽酶发挥作用,将小肽分解为游离氨基酸或直接运输[19]。本试验中,饲粮中添加枯草芽孢杆菌在一定程度上提高了肉鸡肠道中PepT1的表达。Pavlova等[20]研究表明,恩诺沙星与益生菌的组合上调了组织中PepT1的表达,对胃肠道有益微生物群的稳定、短链脂肪酸含量的增加和病原菌毒性代谢物含量的减少发挥了积极作用,与本试验的结果相似。氨基酸是动物机体所必需的营养物质,其通过细胞膜需要相应的氨基酸转运载体协助转运,相关转运载体在这一过程中发挥关键作用。蛋白质水平的高低受氨基酸转运载体基因表达的影响。Palii等[21]研究发现,在饲粮中缺乏某种氨基酸时,一些肠道氨基酸转运载体的表达会有所提高。当饲粮中相关的必需氨基酸补足后,因氨基酸缺乏所导致上调的肠道氨基酸转运载体基因的表达降低。张宇峰等[22]研究也发现,饲粮中短链氨基酸不足时,会增加断奶仔猪肠道氨基酸转运载体基因的表达。在本试验中,饲粮中添加枯草芽孢杆菌提高了肉鸡回肠中B0AT1和十二指肠中CAT1、B0AT1的表达,进而可以推断出饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以维持肠道小肽和氨基酸转运载体的水平,促进肠道对氨基酸的吸收。

3.2 枯草芽孢杆菌对LPS应激肉鸡肠道葡萄糖转运载体基因表达的影响

葡萄糖是家禽体内关键的燃料和重要的代谢底物,它通过SGLT1被肠道上皮吸收,并由基底外侧膜上表达的GLUT2转运到血液中[23-24]。SGLT1既能够对葡萄糖消耗负责,也能作为葡萄糖感受器。SGLT1的功能为调控肠道中葡萄糖依赖性激素分泌,使得动物机体的血糖水平得到控制[25]。在本试验中,饲粮中添加枯草芽孢杆菌提高了肉鸡空肠和回肠中SGLT1的表达。周笑犁等[26]通过试验证明在饲粮中添加大豆寡糖显著提高了断奶仔猪小肠绒毛高度与隐窝深度的比值以及空肠中SGLT1和GLUT2的表达,与本研究结果相似。由此可见,饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够改善肉鸡的肠道环境,促进碳水化合物在空肠和回肠中的吸收。

3.3 枯草芽孢杆菌对LPS应激肉鸡肠道脂肪酸转运载体基因表达的影响

FATP4是脂肪酸转运载体(FATPs)家族中的一员,主要分布于肠绒毛细胞中,其功能为协助并促进肠道细胞吸收脂肪酸,与肠道细胞中其他调控因子共同作用[27-28],具体为结合长链脂肪酸,将其激活成酰基辅酶A,从而在脂质代谢途径中转运脂肪酸衍生物[29]。在本试验中,饲粮中添加枯草芽孢杆菌提高了回肠中FATP4的表达。赵旭等[30]研究也发现,枯草芽孢杆菌能使肉鸡肝脏中脂肪含量降低,促进肉鸡肝源性脂肪向外周组织的转运及沉积,与本研究结果相似。因此,可以推断出枯草芽孢杆菌能提高肉鸡的生长性能,加快脂肪沉积。
LPS应激会产生大量的ROS,通过破坏DNA、脂质和蛋白质的结构来威胁动物的健康和生存[31]。目前,饲粮中添加枯草芽孢杆菌对肉鸡生长性能、血清指标等方面的研究已经较为广泛,LPS应激模型的建立在畜牧应用较多,但它们对肉鸡肠道养分转运载体基因表达的影响研究较少。本试验通过口服LPS建立肉鸡免疫应激模型,借助检测养分转运载体基因的表达来反映枯草芽孢杆菌缓解免疫应激的程度,发现LPS诱导肉鸡肠道中养分转运载体基因的表达降低。这些发现表明LPS降低了肉鸡胃肠道中氨基酸、糖和脂肪酸的运输水平。然而,在饲粮中添加枯草芽孢杆菌可能会减少这些基因表达的下调,说明枯草芽孢杆菌有缓解LPS应激的作用。

4 结论

LPS应激下调了肉鸡十二指肠、空肠和回肠中B0AT1、SGLT1、FATP4的表达,使中性氨基酸、葡萄糖以及脂肪酸在肠道中的转运受到抑制;饲粮中添加枯草芽孢杆菌上调了肉鸡十二指肠和回肠中B0AT1的表达以及空肠中SGLT1和FATP4的表达。上述结果说明枯草芽孢杆菌可以缓解LPS应激对肉鸡肠道养分转运造成的负面影响,使得肉鸡肠道养分转运载体基因正常表达。

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