黄曲霉毒素(AF)是由产毒寄生曲霉和黄曲霉代谢产生的一类化学结构相似含二呋喃环和香豆素的化合物[1],在腐败霉变的玉米青贮、谷物等畜禽饲料中广泛存在[2]。黄曲霉毒素现已被鉴定出存在多种衍生物,其中黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最强,其污染饲料后对养殖业造成的经济损失远大于有机农药、砷和氰化物[3]。饲料中AFB1造成的动物各器官损伤对畜牧业发展危害极大,改善畜禽AFB1中毒导致的生产性能下降并且防止动物产品中AFB1富集对人类健康造成危害等情况已成为当前急需解决的问题。
研究表明,AFB1具有强毒性,会导致畜禽生长繁殖障碍[4],肺脏、肾脏、肝脏等多种器官出现炎症及氧化损伤[5],降低肠道对营养物质的吸收[6],影响动物肠道微生物群落的组成和丰富度,损伤脾脏等免疫器官,进而引发机体免疫系统功能紊乱[7]。肝脏是AFB1代谢的主要器官,畜禽摄入霉变饲料发生AFB1中毒后,肝脏会发生炎症、过氧化、代谢减弱等应激反应[8]。AFB1可诱导细胞水平上的肝细胞核DNA双链断裂、细胞分裂周期阻滞、脂质过氧化物积累,影响RNA和蛋白质等生物大分子的合成[9]。氧化应激是AFB1对肝脏的多方位毒性作用中的重要作用机制[10]。许多研究发现可以通过调节氧化应激相关的核因子E2相关因子2(Nrf2)/Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)/抗氧化应答元件(ARE)通路来减轻肝脏损伤[11]。
当前通过天然化合物治疗和改善畜禽养殖过程中各种原因导致的肝脏疾病有显著优势和良好效果[12]。天然化合物具有对环境友好、相对成本低、低毒无残留等优点,在畜禽养殖过程中可以作为饲料添加剂广泛应用。棉籽糖(Raf)是从棉籽等油料作物籽仁中提取的天然无毒副作用的非消化性低聚糖,具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗病毒等多种功能,并且已被证明可以减少肝细胞的损伤,在肝脏疾病中起着积极作用[13]。因此,本研究通过检测小鼠生长性能、血清生化指标、肝脏组织结构和氧化与抗氧化相关蛋白表达,探索Raf对AFB1诱导的小鼠肝脏氧化损伤的保护作用,进而为改善养殖过程中畜禽摄入霉变饲料发生AFB1中毒的情况提供新策略,为绿色新型饲料添加剂的研发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
丙二醛(MDA)试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司;谷草转氨酶(AST)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷丙转氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、BCA浓度测定试剂盒、苯甲基磺酰(PMSF)、NP-40裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)均购自碧云天生物技术有限公司;增强型化学发光液(ECL)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国默克密理公司;AFB1(1162-65-8)、Raf(512-69-6)购自成都普菲德生物技术有限公司。
Nrf2抗体(A3577)、细胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)抗体(A13484)、Keap1抗体(A17062)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗体(A0208)、血红素氧合酶-1(HO-1)抗体(A11919)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(A7626)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗体(A11319)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(AC038)均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
1.1.2 主要仪器
酶标仪购自成都斯玛特科技有限公司;ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、电泳槽、转模仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 试验动物与饲粮
选用20只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠作为试验动物,体重在17~21 g,购自于哈尔滨医科大学实验动物学部。基础饲粮为购自北京科澳协力有限公司的大小鼠维持饲粮,由玉米、食盐、豆粕、面粉、鱼粉、酵母粉、植物油、多种维生素和矿物元素等组成,参照GB/T 14924.9—2001测定其营养水平,见表1。
表1 基础饲粮营养水平(风干基础)Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
| 项目Items | 含量Content |
|---|---|
| 粗蛋白质Crude protein | 19.82 |
| 粗脂肪Crude fat | 4.60 |
| 粗纤维Crude fibre | 1.90 |
| 粗灰分Crude ash | 6.60 |
| 钙Calcium | 1.09 |
| 总磷Total phosphorus | 0.80 |
| 水分Moisture | 6.40 |
1.3 试验设计
试验前20只小鼠在12 h明暗交替的温度为23~25 ℃的环境中正常饲养1周,之后随机分为5组,分别为对照组、Raf组(给予50 mg/kg BW Raf)、AFB1组(给予1.5 mg/kg BW AFB1)、低剂量Raf治疗组(给予25 mg/kg BW Raf和1.5 mg/kg BW AFB1)、高剂量Raf治疗组(给予50 mg/kg BW Raf和1.5 mg/kg BW AFB1),每组4只。按小鼠平均体重称取相应剂量的AFB1、Raf或两者的混合物,溶解于0.2 mL二甲基亚砜(DMSO)中,再溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中,配制好的溶液存于4 ℃冰箱中。小鼠每隔1 d灌胃1次,共灌胃15次,30 d的灌胃期结束后对小鼠进行血液采集,之后安乐死处理,采集肝脏组织,一部分肝脏在4%多聚甲醛溶液中固定,剩余部分肝脏保存于-80 ℃冰箱用于检测生化指标。动物试验过程严格遵守黑龙江八一农垦大学实验动物福利与伦理委员会规定(JXY2022037)。
1.4 指标测定
1.4.1 生长性能测定
在每次灌胃后测定小鼠体重,统计小鼠每天的采食量,并计算平均日采食量和平均日增重。
1.4.2 生化指标测定
将血液样本静置在4 ℃冰箱中,在24 h内将血液样品离心(1 172×g)分离血清,检测血清中AST、ALT活性。将肝脏组织称量后置于离心管中,冰浴下匀浆,4 ℃条件下13 780×g离心10 min后取上清液,测定SOD活性以及GSH、MDA含量。以上指标的测定步骤和结果计算严格按照试剂盒说明书进行。
1.4.3 肝脏组织观察
将在4%多聚甲醛溶液中固定的肝脏组织取出,经过洗涤脱水后石蜡包埋,之后切片、脱蜡至水、染色,随后进行脱水、透明、封片,光学显微镜观察。
1.4.4 肝脏组织蛋白提取及蛋白质印迹(Western Blot,WB)检测
从-80 ℃冰箱中取出肝脏组织20 mg,研磨、裂解、离心,取上清液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,使各样品的蛋白浓度相同,混匀后100 ℃煮10 min。使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制凝胶。上样、电泳、转膜后,5%脱脂奶粉室温下封闭2 h,用1×TBST溶液洗膜3次,每次10 min。
按照抗体说明书用TBST稀释一抗,4 ℃冰箱中孵育过夜;次日洗膜3次,每次10 min;二抗室温下孵育1 h,然后洗膜3次;将ECL按说明书比例配制,使用ChemiDoc XRS+化学发光成像系统进行曝光显影观察。目的条带灰度值分析使用ImageJ1.8.0软件系统。
1.5 数据统计分析
采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey’s多重比较,结果表示为平均值±标准差,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 Raf改善AFB1诱导的小鼠生长性能降低
图1 Raf对AFB1诱导小鼠体重的影响与对照组相比,“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01);与AFB1组相比,“#”表示差异显著(P<0.05),“##”表示差异极显著(P<0.01)。图2、图3、图4同。 Fig.1 Effects of Raf on body weight of AFB1-induced mice (n=4) Compared with the control group, “*” indicates significant difference (P<0.05), and “**” indicates extremely significant difference (P<0.0l); compared with the AFB1 group, “#” indicates significant difference (P<0.05), and “##” indicates extremely significant difference (P<0.0l). The same as Fig.2, Fig.3 and Fig.4. |
表2 Raf对AFB1诱导小鼠平均日增重和平均日采食量的影响Table 2 Effects of Raf on ADG and ADFI of AFB1-induced mice (n=4) |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 棉籽糖组 Raf group | 黄曲霉毒素B1组 AFB1 group | 低剂量棉籽糖 治疗组 Low dose Raf treatment group | 高剂量棉籽糖 治疗组 High dose Raf treatment group | P值 P-value |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 平均日增重ADG/(mg/d) | 50.67±6.51 | 18.75±34.74 | 10.33±11.91 | 29.20±3.51 | 17.81±11.41 | 0.115 1 |
| 平均日采食量ADFI/(g/d) | 3.38±0.07 | 3.69±0.18 | 3.07±0.06** | 3.63±0.06## | 3.63±0.06## | <0.000 1 |
“*”表示与对照组相比差异显著(P<0.05),“**”表示与对照组相比差异极显著(P<0.01);“#”表示与AFB1组相比差异显著(P<0.05),“##”表示与AFB1组相比差异极显著(P<0.01)。表3、表4同。 | |
Compared with the control group, “*” indicates significant difference (P<0.05), and “**” indicates extremely significant difference (P<0.0l); compared with the AFB1 group, “#” indicates significant difference (P<0.05), and “##” indicates extremely significant difference (P<0.0l). The same as Table 3 and Table 4. |
2.2 Raf改善AFB1诱导的小鼠肝脏功能损伤
小鼠血清中AST、ALT活性升高提示肝脏功能受损。由表3可知,AFB1组血清中AST和ALT活性极显著高于对照组(P<0.01);与AFB1组相比,低剂量和高剂量Raf治疗组血清中AST和ALT活性极显著降低(P<0.01)。
表3 Raf对AFB1诱导小鼠血清中ALT和AST活性的影响Table 3 Effects of Raf on serum ALT and AST activities of AFB1-induced mice (n=4) U/mL |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 棉籽糖组 Raf group | 黄曲霉毒素B1组 AFB1 group | 低剂量棉籽糖 治疗组 Low dose Raf treatment group | 高剂量棉籽糖 治疗组 High dose Raf treatment group | P值 P-value |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 谷草转氨酶AST | 3.90±0.27 | 3.14±0.79 | 5.98±0.05** | 2.78±0.21## | 2.85±0.18## | <0.000 1 |
| 谷丙转氨酶ALT | 2.23±0.28 | 1.91±0.54 | 3.04±0.31** | 1.80±0.08## | 1.68±0.06## | 0.001 1 |
2.3 Raf改善AFB1诱导的小鼠肝脏组织病理损伤
2.4 Raf抑制AFB1诱导的小鼠肝脏中凋亡相关蛋白表达变化
如图3所示,与对照组相比,AFB1组肝脏中Bax和Caspase-3的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);与AFB1组相比,低剂量Raf治疗组肝脏中Bcl-2的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),Bax的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);与AFB1组相比,高剂量Raf治疗组肝脏中Bax和Caspase-3的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。
图3 Raf对AFB1诱导小鼠肝脏中凋亡相关蛋白表达的影响Raf:棉籽糖 raffinose;AFB1 :黄曲霉毒素B1 aflatoxins B1;Bcl-2:B细胞淋巴瘤-2 B-celllymphoma-2;Bax:Bcl-2相关X蛋白 Bcl-2 associated X protein;Caspase-3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 cysteine-aspartic acid protease-3;β-actin:β-肌动蛋白。 Fig.3 Effects of Raf on expression of apoptosis-related proteins in liver of AFB1-induced mice (n=4) |
2.5 Raf抑制AFB1诱导的小鼠肝脏中氧化损伤相关指标变化
由表4可知,与对照组相比,AFB1组肝脏中GSH含量显著降低(P<0.05),MDA含量极显著升高(P<0.01),SOD活性极显著降低(P<0.01);与AFB1组相比,低剂量Raf治疗组肝脏中MDA含量极显著降低(P<0.01),SOD活性极显著升高(P<0.01);与AFB1组相比,高剂量Raf治疗组肝脏中GSH含量显著升高(P<0.05),MDA含量极显著降低(P<0.05),SOD活性极显著升高(P<0.01)。
表4 Raf对AFB1诱导小鼠肝脏中氧化损伤相关指标的影响Table 4 Effects of Raf on oxidative damage related indexes in liver of AFB1-induced mice (n=4) |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 棉籽糖组 Raf group | 黄曲霉毒素B1组 AFB1 group | 低剂量棉籽糖 治疗组 Low dose Raf treatment group | 高剂量棉籽糖 治疗组 High dose Raf treatment group | P值 P-value |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 谷胱甘肽 GSH/(nmol/mg prot) | 5.99±0.60 | 5.34±0.64 | 4.65±0.16* | 5.32±0.21 | 5.51±0.41# | 0.012 4 |
| 丙二醛MDA/(nmol/g鲜重) | 27.37±1.90 | 26.26±1.35 | 34.76±1.23** | 31.53±0.77## | 27.56±0.91## | <0.000 1 |
| 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) | 123.02±0.75 | 125.88±5.12 | 91.34±1.23** | 100.46±6.46## | 122.76±2.13## | <0.000 1 |
2.6 Raf抑制AFB1诱导的小鼠肝脏中氧化应激相关蛋白表达变化
如图4所示,与对照组相比,AFB1组肝脏中Keap1的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),HO-1的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);与AFB1组相比,低剂量Raf治疗组肝脏中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),Keap1的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);与AFB1组相比,高剂量Raf治疗组肝脏中HO-1的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。
图4 Raf对AFB1诱导小鼠肝脏中氧化应激相关蛋白表达的影响Raf:棉籽糖 raffinose;AFB1 :黄曲霉毒素B1 aflatoxins B1;Nrf2:核因子E2相关因子2 nuclear factor erythroid 2 related factor 2;Keap1:Kelch样ECH相关蛋白1 Kelch-like ECH-associated protein 1; HO-1:血红素氧合酶-1 heme oxygenase-1;β-actin:β-肌动蛋白。 Fig.4 Effects of Raf on expression of oxidative stress-related proteins in liver of AFB1-induced mice (n=4) |
3 讨论
在畜禽养殖过程中,AFB1对动物生长性能、肝脏抗氧化能力、肝脏功能等方面均有不利影响,导致养殖业存在极大经济损失。Raf作为天然化合物,可以提升动物机体的抗氧化能力,增强机体抵抗力,促进肠道菌群丰富多样,有希望成为新的绿色饲料添加剂来预防或治疗各种养殖过程中动物肝脏疾病[14]。
有研究表明,AFB1会导致动物摄食量减少,使体重增长速度降低[15]。本试验结果显示,与对照组相比,AFB1组小鼠平均日采食量减少,体重增长速度降低,经Raf治疗后摄食量减少,体重增长速度降低的趋势被抑制。肝脏作为关键的代谢和解毒器官,对毒素非常敏感。AFB1是一种具有强肝毒性的物质,对肝脏造成损伤,导致肝炎、肝坏死、肝硬化等[16]。当肝细胞受损时,细胞膜完整性丧失,转氨酶从受损的肝细胞中释放,导致机体血清中ALT和AST活性增加,所以血清中ALT和AST活性在临床应用时被认为是反映肝脏损伤的重要参数。而天然化合物可降低血清中ALT和AST活性,进而有效缓解肝脏损伤[17]。本研究发现,AFB1组小鼠血清中ALT和AST活性较对照组极显著升高,表明AFB1组小鼠存在肝脏损伤,而Raf干预后血清ALT和AST活性极显著降低,说明Raf减轻了AFB1造成的小鼠肝脏损伤。
同样,本研究的组织学观察发现,AFB1引起肝组织的形态和结构损伤,如水肿、核膜破裂等,Raf干预后可以改善这些肝脏损伤症状,降低AFB1对机体的毒性作用。AFB1在肝脏中首先被Ⅰ期代谢酶细胞色素P450(CYP450)代谢,代谢结束后AFB1被活化为黄曲霉毒素Q1、AFB1-8,9-环氧化物、黄曲霉毒素M1,之后部分毒素在体内累积,部分被排出体外,而代谢毒素的过程同时伴随着大量活性氧(ROS)生成[18]。CYP3A4是代谢酶CYP450家族中十分关键的药物代谢酶之一,其在肝脏组织代谢药物、环境污染物以及来自机体的内源性物质时扮演重要角色[19]。在本研究中,Raf可以改善AFB1诱导小鼠肝脏中CYP3A4蛋白表达水平降低的情况。有研究对多种霉菌包括黄曲霉毒素感染后的肉兔肝脏组织中药物代谢酶活性进行了测定,发现霉菌毒素使肝脏中药物代谢酶活性降低[20],与本研究结果一致。
细胞凋亡是由基因控制的细胞自发的一种程序性死亡方式,在生理状态下可除去机体内新陈代谢时不需要的异常的细胞,有利于机体健康[21]。研究表明,当氧化应激发生时,过量的ROS可使细胞中蛋白质和核酸受损,诱导组织细胞发生过度凋亡[22]。在代谢有毒的AFB1时,动物机体存在严重氧化应激反应,导致大量正常肝细胞受到损伤,损伤后的肝细胞释放凋亡信号并启动下游调控因子Caspase-3,进而大量肝细胞发生凋亡反应[23]。直接调控细胞凋亡反应的主要是细胞内的凋亡相关蛋白,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。P53是位于上游调控凋亡反应发生的一种蛋白,在机体氧化应激发生凋亡反应发生时,P53可转移至肝脏细胞的线粒体,对Bcl-2直接发挥作用,从而Bcl-2与Bax的结合会被抑制[24]。有研究表明,AFB1可以通过上调Bax、Caspase-3和P53等基因的表达以及下调Bcl-2基因的表达来诱导肝细胞凋亡[25]。在本研究中,Raf通过抑制AFB1诱导的Bax和Caspase-3蛋白表达水平升高和Bcl-2蛋白表达水平降低,进而抑制AFB1诱导的小鼠肝脏组织中肝细胞的过度凋亡。
MDA是在动物机体受到外界刺激时,其组织膜内脂质产生过度的氧化反应而生成。MDA含量会在机体受到刺激氧化应激后升高,在临床应用时常作为生物标志物来评价机体脂质过氧化程度。GSH是动物机体内最主要的含巯基的抗氧化物质,在抗氧化损伤、氨基酸跨膜转运、保护蛋白质巯基等方面具有十分重要的作用。SOD是机体内重要的抗氧化酶,也是机体抵抗氧化应激损伤的第1道屏障[26]。在本研究中,AFB1提高了小鼠肝脏中MDA含量,降低了肝脏中GSH含量和SOD活性。Demirkapi等[27]研究发现,AFB1会导致小鼠肝脏发生氧化损伤,使小鼠肝脏中GSH含量和SOD活性降低,与本研究结果一致。Lan等[28]研究发现,天然低聚糖壳聚糖可降低热应激诱导肉鸡氧化应激导致的肝脏中MDA含量升高,提高肝脏中SOD活性。在本研究中,Raf干预降低了AFB1诱导小鼠肝脏中MDA含量,提高了肝脏中GSH含量和SOD活性,表明Raf有着良好的抗氧化应激能力,可以改善AFB1诱导的肝脏氧化损伤。
Nrf2是抗氧化系统中的关键转录因子,通过调节抗氧化酶相关基因的表达,在防御氧化应激中发挥着不可或缺的作用[29]。在生理状态下,Nrf2与细胞质中的Keap-1结合之后以复合体形式存在于细胞质中。在本研究中,对照组和Raf组小鼠机体均为正常生理条件,Nrf2与Keap-1结合,机体的细胞凋亡也在正常范围内。在氧化应激的情况下,Nrf2转运进入细胞核与ARE结合形成一个复合物,促进抗氧化和解毒基因的转录和翻译,包括HO-1、GSH、醌氧化还原酶1(NQO1)[30]。同样,在稳态条件下,HO-1在大多数细胞中低表达或不表达。然而,在机体对大量促氧化刺激的反应中它的表达被高度上调,并提供抗氧化损伤的保护[31]。本研究中,AFB1作用后小鼠发生氧化应激,Raf可以改善AFB1诱导的小鼠肝脏中Nrf2、HO-1蛋白表达水平的降低与Keap1蛋白表达水平的升高,说明Raf对AFB1诱导的小鼠肝脏氧化损伤具有保护作用。
4 结论
综上所述,Raf对AFB1诱导的小鼠体重增长速度降低、肝脏功能受损和肝脏氧化损伤具有改善作用。
京公网安备 11010802041926号
