动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1022 - 1032

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.089

研究论文

黄豆苷元和藤茶黄酮组合在蛋鸡卵巢颗粒细胞上的抗氧化作用及其对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

  • 鄂晓迪 , 1 ,
  • 胡友军 , 1, * ,
  • 赵晓南 1 ,
  • 文伟 1 ,
  • 程皇座 1 ,
  • 陈杰梅 1 ,
  • 王龙书 1 ,
  • 苟钟勇 , 2, *
展开
  • 1 广东酸动力生物科技有限公司,清远 511500
  • 2 广东省农业科学院动物科学研究所,猪禽种业全国重点实验室,农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室,广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广州 510640
*胡友军,研究员,E-mail: ;
苟钟勇,副研究员,E-mail:

鄂晓迪(1998—),女,河南南阳人,硕士,从事动物营养与分子调控研究。E-mail:

Copy editor: 武海龙

收稿日期: 2024-07-30

  网络出版日期: 2025-02-16

基金资助

广州市科技计划项目(202206010168)

广州市科技计划项目(2024E04J0562)

国家重点研发计划项目(2021YFD1300404)

国家重点研发计划项目(2022YFD1300502)

广东省基础与应用基础研究基金项目(2024A1515012121)

广东省自然科学基金项目(2022A1515012069)

广东省农业科学院科技计划项目(202106TD)

广东省农业科学院科技人才引进专项资金项目(R2021YJ-YB3012)

广东省农业科学院青年科技人员指导协议(R2021QD-024)

广东省畜禽育种与营养研究重点实验室开放课题(2021SZ03)

收起

Antioxidant Effects of Daidzein and Dihydromyricetin Combination on Ovarian Granulosa Cells of Laying Hens and Its Effects on Performance of Laying Hens during Later Laying Period

  • E Xiaodi , 1 ,
  • HU Youjun , 1, * ,
  • ZHAO Xiaonan 1 ,
  • WEN Wei 1 ,
  • CHENG Huangzuo 1 ,
  • CHEN Jiemei 1 ,
  • WANG Longshu 1 ,
  • GOU Zhongyong , 2, *
Expand
  • 1 Guangdong Acid Power Biotechnology Co., Ltd., Qingyuan 511500, China
  • 2 Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, State Key Laboratory of Swine and Poultry Breeding Industry, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
*HU Youjun, professor, E-mail: ;
GOU Zhongyong, associate professor, E-mail:

Received date: 2024-07-30

  Online published: 2025-02-16

Fold

摘要

本试验旨在探究饲粮中添加不同比例的黄豆苷元(DA)和藤茶黄酮(DHM)组合在蛋鸡卵巢颗粒细胞(GCs)上的抗氧化作用及其对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响。利用叔丁基过氧化氢(TBHP)处理蛋鸡卵巢GCs,构建氧化应激模型,细胞试验分为对照组(Ⅰ组)、TBHP组(Ⅱ组)、TBHP+DA∶DHM(7∶3)组(Ⅲ组)、TBHP+DA∶DHM(8∶2)组(Ⅳ组)、TBHP+DA∶DHM(9∶1)组(Ⅴ组)。动物试验选取75周龄的京粉1号蛋鸡192只,根据产蛋率一致原则分为2个组,每组6个重复,每个重复16只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加300 mg/kg的DA∶DHM(7∶3)组合。预试期1周,正试期12周。结果表明:1)细胞试验中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组GCs中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05);与Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组GCs中SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。2)动物试验中,与对照组相比,试验组产蛋率显著提高(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05),卵巢大白卵泡数量和T-AOC显著提高(P<0.05),卵巢MDA含量极显著降低(P<0.01),血清雌二醇(E2)含量显著降低(P<0.05),血清孕酮(P4)、促卵泡素(FSH)和促黄体激素(LH)含量极显著提高(P<0.01)。综上所述,DA和DHM以7∶3的比例组合添加,可提高蛋鸡卵巢GCs内源性抗氧化酶活性,提高产蛋后期蛋鸡卵巢抗氧化能力,降低MDA含量,提高蛋鸡血清P4和FSH含量,从而达到提高产蛋后期蛋鸡生产性能的作用。

关键词： 蛋鸡; 卵巢颗粒细胞; 产蛋后期; 氧化应激; 生产性能

本文引用格式

鄂晓迪 , 胡友军 , 赵晓南 , 文伟 , 程皇座 , 陈杰梅 , 王龙书 , 苟钟勇 . 黄豆苷元和藤茶黄酮组合在蛋鸡卵巢颗粒细胞上的抗氧化作用及其对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(2) : 1022 -1032 . DOI: 10.12418/CJAN2025.089

Abstract

The objective of this study was to investigate the different ratios of antioxidant effects of daidzein (DA) and dihydromyricetin (DHM) combination in diets on ovarian granulosa cells (GCs) of laying hens and its effects on performance of laying hens during later laying period. The ovarian GCs were treated with tert-butyl hydroperoxide (TBHP) to establish an oxidative stress model, the cell experiment was divided into 5 groups: control group (group Ⅰ), TBHP group (group Ⅱ), TBHP+DA∶DHM (7∶3) group (group Ⅲ), TBHP+DA∶DHM (8∶2) group Ⅱ (group Ⅳ) and TBHP+DA∶DHM (9∶1) group Ⅲ (group V). Animal experiment: a total of 192 Jingfen No.1 laying hens at 75 weeks of aged were divided into 2 groups according to similar egg production, with 6 replicates per group and 16 hens per replicate. The control group was fed a basal diet, while the experimental group was fed the basal diet supplemented with 300 mg/kg DA∶DHM (7∶3) combination. The pre-experimental period lasted for 1 week, and the experimental period lasted for 12 weeks. The results showed as follows: 1) in the cell experiment, compared with group Ⅰ, the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and total antioxidant capacity (T-AOC) in GCs of group II were significantly decreased (P<0.05), and the malondialdehyde (MDA) content was significantly increased (P<0.05); compared with group Ⅱ, the activities of SOD, GSH-Px, CAT and T-AOC in GCs of groups Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly increased (P<0.05), and the MDA content was significantly decreased (P<0.05). 2) In animal experiment, compared with the control group, the egg production of experimental group was significantly increased (P<0.05), the feed-to-egg ratio was significantly decreased (P<0.05), the ovarian white follicle number and T-AOC were significantly increased (P<0.05), the ovarian MDA content was significantly decreased (P<0.01), the serum estradiol (E2) content was significantly decreased (P<0.05), and the contents of progesterone (P4), follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in serum were significantly increased (P<0.01). In conclusion, the combination addition of DA and DHM at a 7∶3 ratio can enhance the endogenous antioxidant enzyme activity in ovarian GCs of laying hens, increase the ovarian antioxidant capacity of laying hens during the later laying period, reduce MDA content, and increase serum P4 and FSH contents, thereby improving the performance of laying hens in the later laying period.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025, 37(2):1022-1032]

Key words： laying hens; ovarian granulosa cells; later laying period; oxidative stress; performance

蛋鸡产蛋后期生产性能下降困扰着蛋鸡养殖行业,随着蛋鸡周龄的增加,机体逐渐进入衰老状态,表现为产蛋率下降、蛋品质变差,极大地影响了养殖效益[1]。蛋鸡后期产蛋率下降已成为蛋鸡产业的难点问题,通过遗传选育、饲养管理等常规方法已很难解决。随着蛋鸡衰老,机体抗氧化能力逐渐减弱,活性氧(reactive oxygen species,ROS)在机体内逐渐积累,影响健康[2]。饲粮中添加抗氧化剂可以减轻衰老引起的氧化应激,维持畜禽的繁殖能力[3]。大豆异黄酮属于黄酮类物质,具有弱雌激素样作用,对蛋鸡抗氧化能力和繁殖机能有积极影响。大豆异黄酮可以提高蛋鸡的抗氧化能力,对产蛋后期蛋鸡卵巢机能有积极作用[4]。研究发现,黄豆苷元(daidzein,DA)和藤茶黄酮(dihydromyricetin,DHM)属于多酚黄酮类化合物,可提高机体抗氧化能力,提高动物的生产性能[5⇓⇓-8]。DA和DHM除均具有抗氧化功能外,DA还具有类似雌激素的作用,DHM还具有抗炎作用,DA和DHM联合使用可能具有协同作用,实现二者功效互补。但是,目前DA和DHM的组合效应研究尚未见报道。为了探究DA和DHM的组合效应对产蛋后期蛋鸡的影响,本研究通过DA和DHM组合处理产蛋后期蛋鸡卵巢颗粒细胞(granular cells,GCs),探究其对蛋鸡卵巢GCs的影响及机理,并在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加DA和DHM组合,探寻缓解产蛋后期蛋鸡产蛋率下降的新方法及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.1.1 细胞试验

选用健康、状态良好、生产性能相似的82周龄蛋鸡,提取蛋鸡原代GCs:1)蛋鸡颈静脉放血致死,剖腹并取出卵泡,置于盛有灭菌的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)的烧杯中;2)进入细胞房,将卵泡转移至有PBS的培养皿中,分层;3)剪碎颗粒层组织并移至50 mL离心管中,加入Ⅱ型胶原酶(终浓度为0.1%)消化;4)在37 ℃水浴锅中消化1~3 min,轻微振荡;5)消化结束后立即加入等体积含血清预冷的M199基础培养基,终止反应;6)200目滤器过滤,收集滤液,移入15 mL离心管中,1 000×g离心5 min,弃上清,加入含10%胎牛血清(FBS)培养基重悬;7)进行细胞计数,铺板。采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测法探索DA和DHM的最佳剂量和配比。参考杨晓岚[9]的方法,用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)建立蛋鸡GCs氧化应激模型,分为设对照组(Ⅰ组)、TBHP组(Ⅱ组)、TBHP+DA∶DHM(7∶3)组(Ⅲ组)、TBHP+DA∶DHM(8∶2)组(Ⅳ组)、TBHP+DA∶DHM(9∶1)组(Ⅴ组)。

1.1.2 动物试验

本试验通过广东省农业科学院动物科学研究所实验动物福利伦理委员会的审查(批准编号:GDIAS20221103)。选取细胞试验结果中DA与DHM最佳比例进行动物试验。选取75周龄的京粉1号蛋鸡192只,根据产蛋率(80.13±0.64)%一致原则分为2个组,每个组6个重复,每个重复16只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加DA和DHM(7∶3)组合(其中DA和DHM纯品含量分别为70%和30%),添加量为300 mg/kg。预试期1周,正试期12周。基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)蛋鸡产蛋期营养需要量参数设计,所有营养成分满足或超过蛋鸡产蛋后期营养需要量,基础饲粮组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 62.73
小麦麸Wheat bran 1.50
豆粕Soybean meal 19.90
玉米蛋白粉Corn gluten meal 3.00
大豆油Soybean oil 1.00
L-赖氨酸L-Lys 0.16
DL-蛋氨酸DL-Met 0.16
L-苏氨酸L-Thr 0.03
L-色氨酸L-Trp 0.01
石粉Limestone 9.00
磷酸氢钙CaHPO4 1.70
食盐NaCl 0.25
小苏打NaCHO3 0.15
氯化胆碱Choline chloride 0.12
维生素预混料Vitamin premix1) 0.04
矿物质预混料Mineral premix2) 0.10
沸石粉Zeolite 0.15
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels3)
代谢能ME/(MJ/kg) 11.51
粗蛋白质CP 16.00
赖氨酸Lys 0.78
蛋氨酸Met 0.40
蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys 0.61
苏氨酸Thr 0.53
钙Ca 3.72

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 The vitamin premix provided the following per kg of the diet: VA 9 000 IU,VD3 1 600 IU,VE 15 IU,VK3 2.0 mg,VB1 1.5 mg,VB2 5.0 mg,VB6 2.0 mg,VB12 4 μg,烟酸 nicotinic acid 20 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 5 mg,生物素 biotin 0.15 mg,叶酸 folic acid 0.60 mg。

2)矿物质预混料为每千克饲粮提供 The mineral premix provided the following per kg of the diet: Fe (as ferrous sulfate) 90 mg,Cu (as copper sulfate) 8 mg,Mn (as manganese sulfate) 120 mg,Zn (as zinc sulfate) 100 mg,I (as potassium iodide) 0.50 mg,Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

3)代谢能为计算值,其余为实测值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.2 试验材料和仪器

主要材料:DA和DHM(含量≥98%,广东酸动力生物科技有限公司),1×PBS干粉(北京索莱宝科技有限公司,P1010-2),细胞基础培养基M199(武汉普诺赛生命科技有限公司,PM150610),Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司,C6885),胎牛血清(美国Gibco公司,10091148),雌二醇(estradiol,E2)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-OSRL-Ch0001)、孕酮(progesterone,P4)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-EL-0154),促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)(武汉菲恩生物科技有限公司,ECH0020)、促黄体激素(luteinizing hormone,LH)(武汉菲恩生物科技有限公司,ECH0050)、ROS(北京索莱宝科技有限公司,CA1410-500)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K096-M)、过氧化氢酶(catalase,CAT)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K031-M)、总抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K136-M)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K019-S)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K028-M)、CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所,CK04)。
主要仪器:超净工作台(北京斯尔福仪器设备有限公司)、倒置荧光显微镜(Sigma,德国)、高速离心机(Beckman,美国)、微量移液枪(Eppendorf,德国)、超纯水分离系统(Labconco,美国)、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、电子天平(江苏海门其林贝尔公司)、恒温水浴锅(北京科学仪器厂)、解剖取材器具(北京广达恒益科技有限公司)、二氧化碳培养箱(Thermo,美国)。

1.3 检测指标

1.3.1 卵巢GCs活力

提取卵巢GCs后,将细胞密度调整为1×105个/孔,接种于96孔板,5%二氧化碳、37 ℃培养细胞4 h后,观察细胞贴壁情况,当卵巢GCs培养至密度达到80%,加入DA和DHM,于24 h后用CCK-8检测。去除细胞培养基,用PBS洗1次以去除漂浮的死细胞,每孔加入100 μL新鲜的培养基及10 μL CCK-8试剂溶液。在细胞培养箱内孵育2 h后分别用酶标仪检测,在450 nm测定吸光度。

1.3.2 卵巢GCs中抗氧化指标

按1.1试验设计分组,TBHP处理细胞12 h,再加不同比例DA和DHM组合处理24 h,收细胞样本,超声破碎后,检测抗氧化酶活性,使用试剂盒测定蛋鸡卵巢GCs中GSH-Px、CAT、SOD活性和MDA含量及T-AOC,按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 卵巢GCs中ROS含量

在96孔细胞培养板中加入100 μL细胞悬液,在悬液四周添加PBS,设置一列空白孔;待96孔板内细胞长至80%,TBHP处理12 h,再加DA∶DHM(7∶3)组合处理24 h,每组6个复孔;将2'7'-二乙酰二氯荧光素(2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针(南京建成生物科技有限公司,E004-1-1)加入无血清培养基中:一般按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA(终浓度为10 μmol/L)。去除处理液后,每孔加入100 μL稀释好的DCFH-DA。设立阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔:已加入探针的细胞,同时加入ROS供氢体诱导细胞;阴性对照孔:不加探针,只加入培养基的细胞。37 ℃孵育细胞30 min。PBS或无血清培养基清洗2遍,去除多余的DCFH-DA以减少误差;使用荧光显微镜拍照,使用ImageJ软件进行定量分析。

1.3.4 饲粮营养成分

饲粮代谢能参考《中国饲料成分及营养价值表》(2022年第33版)中鸡用饲料能值的参考值和各原料在饲粮中的含量计算。参考国家标准GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》测定饲粮中粗蛋白质含量,参考国家标准GB/T 18246—2019《饲料中氨基酸的测定》测定饲粮中赖氨酸和苏氨酸含量,参考国家标准GB/T 15399—2018《饲料中含硫氨基酸的测定离子交换色谱法》测定饲粮中蛋氨酸和半胱氨酸含量,参考国家标准GB/T 13885—2017《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定原子吸收光谱法》测定饲粮中钙含量。

1.3.5 蛋鸡生产性能

每天15:00准时收蛋,按笼位记录产蛋数和蛋重。每周末定时结料、称剩余料重,统计各重复的实际周耗料量。统计各重复试验鸡产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和计算料蛋比。

1.3.6 卵泡数量

将完整摘取的卵巢浸泡在生理盐水中,分离每个卵泡并由大到小排序,使用游标卡尺测量每个卵泡的最大直径,按照卵泡分级标准统计数量。

1.3.7 卵巢抗氧化指标

使用试剂盒测定蛋鸡卵巢中T-AOC、SOD活性和MDA含量,按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.8 血清生殖激素指标

使用试剂盒检测血清E2、P4、FSH和LH含量,按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 数据统计分析

整理后的数据使用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析。细胞试验组间有显著差异者再进行Duncan氏多重比较检验,动物试验组间的结果采用t检验。所有数据均以平均值±标准误表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 DA和DMH对细胞活力的影响

由图1可见,与0 ng/mL的DA和0 ng/mL的DHM相比,10 ng/mL的DA和10 ng/mL的DHM均没有显著影响细胞活力(P>0.05)。因此,选用10 ng/mL的DA和10 ng/mL的DHM进行配比,寻找最佳的配比。
由图2可见,用9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5的DA与DHM比例处理GCs,结果发现,DA与DHM比例在7∶3、8∶2、9∶1时均没有显著影响细胞活力(P>0.05)。因此,选取7∶3、8∶2、9∶1的DA与DHM比例进行后续试验。
图1 DA和DHM对蛋鸡卵巢GCs活力的影响

数据点标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。图2同。

Fig.1 Effects of DA and DHM on ovarian GCs viability of laying hens

Value points with different small letters mean significant difference (P<0.05), with the same small letter mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.2.

图2 不同比例DA和DHM组合对蛋鸡卵巢GCs活性的影响

Fig.2 Effects of different ratios of DA and DHM combination on ovarian GCs viability of laying hens

2.2 DA和DHM组合对蛋鸡卵巢GCs抗氧化指标的影响

由图3和图4可见,与Ⅰ组相比,Ⅱ组GCs中SOD、GSH-Px、CAT活性和T-AOC显著降低(P<0.05),GCs中MDA和ROS含量显著升高(P<0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组GCs中SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高(P<0.05),Ⅳ、Ⅴ组GCs中T-AOC显著升高(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组GCs中MDA含量显著降低(P<0.05),Ⅲ组GCs中ROS含量显著降低(P<0.05)。这说明通过添加DA和DHM组合可以改善TBHP氧化应激对细胞造成的损伤,提高蛋鸡卵巢GCs中抗氧化酶活性,降低ROS和MDA含量。因DA∶DHM(7∶3)组GCs中MDA含量最低,抗氧化酶活性与另外2个组相当,综合考虑,最终选定DA与DHM以7∶3的比例添加到蛋鸡饲粮中开展后续相关研究。
图3 不同比例DA和DHM组合对蛋鸡卵巢GCs抗氧化指标的影响

Fig.3 Effects of different ratios of DA and DHM combination on ovarian GCs antioxidant indices of laying hens

图4 DA∶DHM(7∶3)组合对蛋鸡卵巢GCs中ROS含量的影响

Fig.4 Effects of DA∶DHM (7∶3) combination on content of ROS in ovarian GCs of laying hens

2.3 DA和DHM组合对蛋鸡生产性能的影响

由表2可知,与对照组相比,试验组产蛋率显著提高(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05),平均蛋重和平均日采食量无显著差异(P>0.05)。
表2 DA和DHM组合对蛋鸡生产性能的影响

Table 2 Effects of DA and DHM combination on performance of laying hens

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
初始产蛋率Initial egg production/% 80.17±0.76 80.08±0.58 0.953
产蛋率Egg production/% 77.81±0.33 80.17±0.23 0.010
平均蛋重Egg weight/g 59.68±0.77 60.59±0.60 0.377
平均日采食量ADFI/g 116.04±2.81 114.08±2.51 0.232
料蛋比Feed/egg mass 2.50±0.07 2.35±0.05 0.034

2.4 DA和DHM组合对蛋鸡卵巢卵泡数量的影响

由表3可知,与对照组相比,试验组卵巢大白卵泡数量显著提高(P<0.05),卵巢等级卵泡、小黄卵泡和小白卵泡数量无显著差异(P>0.05)。
表3 Effects of DA and DHM combination on ovarian follicle numbers of laying hens 个

Table 3

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
等级卵泡Dominant follicles 4.75±0.47 6.00±0.41 0.094
小黄卵泡Small yellow follicles 5.25±0.48 5.75±0.48 0.488
大白卵泡Great white follicles 5.25±0.25 6.50±0.29 0.017
小白卵泡Small white follicles 14.25±1.31 13.50±0.65 0.627

2.5 DA和DHM组合对蛋鸡卵巢抗氧化指标的影响

由表4可知,与对照组相比,试验组卵巢T-AOC显著提高(P<0.05),卵巢MDA含量极显著降低(P<0.01),卵巢SOD活性无显著差异(P>0.05)。
表4 DA和DHM组合对蛋鸡卵巢抗氧化指标的影响

Table 4 Effects of DA and DHM combination on ovarian antioxidant indices of laying hens

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
超氧化物歧化酶SOD/(U/mg prot) 14.79±0.32 14.92±0.43 0.820
总抗氧化能力T-AOC/(U/mg prot) 9.10±0.21 11.23±0.65 0.015
丙二醛MDA/(nmol/mg prot) 3.64±0.15 2.91±0.08 0.003

2.6 DA和DHM组合对蛋鸡血清激素指标的影响

由表5可知,与对照组相比,试验组血清E2含量显著降低(P<0.05),血清P4、FSH和LH含量极显著提高(P<0.01)。
表5 DA和DHM组合对蛋鸡血清激素指标的影响

Table 5 Effects of DA and DHM combination on serum hormone indices of laying hens

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
雌二醇E2/(pg/mL) 168.35±11.83 130.20±7.92 0.028
孕酮P4/(ng/mL) 6.47±0.31 8.56±0.48 0.004
促卵泡素FSH/(pg/mL) 1 419.55±71.59 4 009.57±418.86 0.001
促黄体激素LH/(pg/mL) 218.35±15.47 348.99±32.40 0.005

3 讨论

3.1 DA和DHM组合对产蛋后期蛋鸡卵巢GCs的影响

正常情况下,动物机体内存在一个微妙的平衡,即抗氧化系统与氧化系统之间的和谐共存。然而,当遭遇外界不利因素的刺激时,这种平衡状态可能会被打破,导致ROS在动物机体内逐渐累积[10];而蛋鸡卵巢GCs对ROS极为敏感,易在ROS的攻击下发生氧化应激损伤[5]。DA和DHM属于多酚类化合物,具有很强的抗氧化、抗炎、降血糖、抗癌的作用,此外,小剂量使用还具有雌激素样作用,可以提高机体免疫功能和生产性能,因此广泛应用于畜禽生产中[11-12]。本试验用DA和DHM处理GCs,结果发现10 ng/mL的剂量不影响细胞活性;而DA和DHM组合处理GCs,以7∶3、8∶2、9∶1的比例对GCs活性无影响。
TBHP具有很强的氧化能力,且稳定性更高,因此常被用来建立氧化应激模型[13]。TBHP会转化为ROS中间体,大量的ROS蓄积会破坏细胞防御系统,引起细胞氧化损伤。ROS会导致脂质过氧化与抗氧化酶活性降低现象的发生,丙二醛是脂质过氧化的重要产物,它能产生细胞毒性,造成细胞凋亡[14]。本试验用400 μmol/L的TBHP处理GCs,结果发现,TBHP提高了GCs中MDA和ROS含量,降低了抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性及T-AOC。而在TBHP处理的GCs加入10 ng/mL的DA和DHM组合,发现7∶3、8∶2和9∶1的比例可以改善TBHP对细胞造成的损伤,提高蛋鸡GCs中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性及T-AOC,降低脂质过氧化产物MDA和ROS的含量,其中7∶3比例的组合效果最佳。

3.2 DA和DHM组合对产蛋后期蛋鸡生产性能及卵泡数量的影响

在经历连续的产蛋高峰期后,蛋鸡机体逐渐步入衰老阶段,这一过程伴随着其生理代谢活动的减缓。由于抗氧化能力的降低,蛋鸡的繁殖器官如子宫、输卵管和卵巢逐渐出现衰老迹象,进而导致了产蛋性能的显著下降,这一变化成为了蛋鸡养殖过程中不可避免的一大挑战[5]。黄酮类化合物作为植物激素的一种,包括苷元、糖苷和甲基化衍生物等,能够影响动物的生命调节过程,提高动物的繁殖性能[15-16]。Guo等[17]研究发现,淫羊藿黄酮能有效改善蛋鸡初级、等级和排卵后GCs的增殖和分化,改善激素分泌和卵泡发育,从而提高产卵率。冯猛等[18]研究发现,饲粮中添加DHM能够提高海兰蛋鸡的生产性能,该生产性能的提高与在饲粮中添加药物抗菌剂的效果相似。田何芳等[6]研究发现,在55周龄的京粉1号蛋鸡饲粮中添加10 mg/kg的DA可以提高蛋品质,但对产蛋率无影响。与前人研究不同,本研究发现在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加DA和DMH组合可以提高产蛋率,降低料蛋比,可能是DA和DHM组合协同更大的发挥抗炎、抗氧化和提高机体免疫的作用。
卵巢作为衰老最先发生的器官,同时也是与蛋鸡繁殖功能最直接关联的部位,卵巢内卵泡的数量可以一定程度反映卵巢功能是否发生变化[19]。因此,为了进一步探究DA和DHM组合调控繁殖功能的具体机制,本试验通过统计各级卵泡数量验证DA和DHM组合是否影响老龄蛋鸡卵泡的发育形成及卵巢功能。孟晓彤[20]研究发现,蛋鸡饲粮中添加15 mg/kg DA极显著提高了大白卵泡和初级卵泡数量,同时极显著降低了小黄卵泡、大白卵泡、次级卵泡的闭锁率。与前人研究一致,本研究在饲粮中添加DA和DHM组合可以提高大白卵泡的数量。

3.3 DA和DHM组合对产蛋后期蛋鸡抗氧化能力的影响

衰老蛋鸡体内抗氧化能力显著降低,无法有效清除细胞代谢过程中产生的氧化代谢产物。由于这些有害物质的不断累积,蛋鸡的过氧化物清除机制受到严重抑制,进而触发了线粒体的凋亡过程,加剧了细胞和线粒体的损伤程度,最终导致了其生产性能的严重下降[21]。卵巢衰老会导致原始卵泡逐渐减少,最终导致绝经,除了数量上的减少外,卵母细胞质量的下降也与年龄有关,这主要是染色体非整倍体增加的结果[22]。黄酮类化合物可以提高蛋鸡的抗氧化能力,降低炎症的发生,提高机体免疫力[23]。Wei等[24]研究表明,在生长肥育猪饲粮中添加0.03%的DHM,可提高生长育成猪空肠中CAT、GSH-Px活性及T-AOC,降低MDA含量,并上调血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶、核因子E2相关因子2(Nrf2)和磷酸-胞外调节蛋白激酶(p-ERK)的蛋白表达,通过激活胞外调节蛋白激酶(ERK)/Nrf2/HO-1信号通路增强了生长育成猪的肠道抗氧化能力。徐美玲[25]研究发现,在仔猪饲粮中添加0.5%的DHM可提高仔猪血清GSH-Px、CAT活性和T-AOC,降低MDA含量。李晓玲[26]研究发现,在蛋鸡饲粮中添加400、800、1 200 g/t的DA均能显著降低蛋鸡血清和蛋黄中MDA含量。作为植物源黄酮类化合物的一员,DA和DHM被证明具有优秀的抗氧化性能。与前人研究一致,本试验在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加DA和DHM组合可以提高卵巢T-AOC,降低MDA含量。这可能是DA和DHM通过激活Nrf2/HO-1信号通路,提高抗氧化酶活性,以及调控核因子-κB(NF-κB)信号通路,降低细胞炎症,减少ROS在细胞内积累所达到的机体抗氧化应激效应。

3.4 DA和DHM组合对产蛋后期蛋鸡生殖激素的影响

机体生殖激素影响卵泡的发育,下丘脑-垂体-性腺轴调控激素的分泌影响蛋鸡生殖活动。调控蛋鸡产蛋的激素有FSH、LH、E2、P4等,其中FSH可以促进GCs的增殖和发育,LH诱导卵泡的成熟和排卵,E2和P4是由蛋鸡卵泡产生的类固醇激素,往往受FSH和LH调控[27]。E2可以调控卵泡发育和促进蛋壳形成,蛋鸡的产蛋率和E2含量有一定的相关性[28]。丁文文[29]研究发现,在蛋鸡饲粮中添加蛇床子素和淫羊藿苷可降低血清E2含量,血清FSH和LH含量呈现先下降后上升的趋势,血清P4含量升高。官丽辉等[30]研究发现,在坝上长尾鸡饲粮中添加15 mg/kg的DA可以显著提高血清FSH、LH、E2、P4和催乳素含量。本研究发现,在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加DA和DHM组合可以提高血清P4、LH、FSH含量,降低血清E2含量。研究发现,可通过血清E2/P4的比值来评估产蛋率,得出E2/P4的比值越小,蛋鸡产蛋率越高[31]。有研究发现,每天给高脂饮食小鼠灌喂200 mg/kg体重的DHM溶液,可缓解高脂饲粮导致的小鼠发情周期紊乱,缩短肥胖小鼠发情间期、延长发情期,并升高血清FSH和E2含量[32]。推测本试验条件下,血清E2含量降低的原因可能是饲喂植物雌激素时间过长引起抑制E2含量的原因导致的。总之,DA和DHM组合提高蛋鸡生产性能是通过增加P4、FSH、LH含量及促进卵泡发育,进而改善产蛋后期蛋鸡的繁殖性能。

4 结论

① TBHP可以导致蛋鸡卵巢GCs发生氧化应激。
② DA和DHM以7∶3的比例组合添加可以提高蛋鸡卵巢GCs内源性抗氧化酶活性,同时降低MDA含量,缓解TBHP诱导的氧化应激。
③ DA和DHM以7∶3的比例组合添加可以提高产蛋后期蛋鸡卵巢抗氧化能力,调节繁殖相关激素含量,减缓氧化带来的卵巢衰老,改善卵巢机能,提高产蛋后期蛋鸡生产性能。

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