动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1234 - 1244

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.107

研究论文

芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响

  • 朱建军 ,
  • 柳婷婷 ,
  • 王政力 ,
  • 马艳 ,
  • 申红 , * ,
  • 王俊刚
展开
  • 石河子大学动物科技学院,石河子 832061
*申 红,教授,博士生导师,E-mail:

朱建军(1983—),男,新疆阜康人,博士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-07-30

  网络出版日期: 2025-02-16

基金资助

国家自然科学基金项目(31660703)

收起

Effects of Brassica rapa L. Polysaccharides on Immune and Antioxidant Functions of Peripheral Blood Lymphocytes in Yellow-Feathered Quails

  • ZHU Jianjun ,
  • LIU Tingting ,
  • WANG Zhengli ,
  • MA Yan ,
  • SHEN Hong , * ,
  • WANG Jungang
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832061, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-07-30

  Online published: 2025-02-16

Fold

摘要

本试验旨在探究芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响。将经过粉碎机粉碎的芜菁块根,通过热水浸提、大孔树脂吸附和DEAE-52纤维素柱纯化,获得纯度为99.85%、分子质量为118 ku的芜菁多糖。静脉采血收集黄羽鹌鹑的静脉血液样品,通过PBLs提取试剂盒收集黄羽鹌鹑淋巴细胞,悬于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清+1%双抗)中,然后使用台盼蓝染色计数,调整外周血淋巴细胞悬浮液中细胞浓度为1×107个/mL,用于外周血淋巴细胞体外培养试验。外周血淋巴细胞体外培养试验中设置5个芜菁多糖浓度(0、25、50、100和200 μg/mL),每个浓度设6个重复孔,外周血淋巴细胞体外培养24 h后收集上清液,测定免疫指标[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量]与抗氧化指标[谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量];同时,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法测定免疫相关基因IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)、髓样分化因子88(MyD88)与抗氧化相关基因GSH-Px、CAT、SOD的mRNA相对表达量。结果显示:1)在免疫功能方面,与空白对照组(0 μg/mL芜菁多糖)相比,50、100和200 μg/mL芜菁多糖可极显著提高上清液中IgA、IgM含量(P<0.01),极显著降低上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α含量(P<0.01);此外,50和100 μg/mL芜菁多糖还可显著提高上清液中IgG含量(P<0.05)。2)在抗氧化功能方面,与空白对照组相比,50、100和200 μg/mL芜菁多糖可极显著提高上清液中CAT活性(P<0.01);同时,上清液中TLR4、NF-κB、IL-8、TNF-α的mRNA相对表达量在芜菁多糖浓度为100和200 μg/mL时极显著降低(P<0.01),SOD、GSH-Px和CAT的mRNA相对表达量在芜菁多糖浓度为100和200 μg/mL时显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),MyD88的mRNA相对表达量在芜菁多糖浓度为25和50 μg/mL时极显著升高(P<0.01)。综上所述,芜菁多糖可通过调节淋巴细胞响应,提高黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞的免疫和抗氧化功能,本试验条件下的最佳作用浓度为100 μg/mL。

关键词： 芜菁多糖; 黄羽鹌鹑; 外周血淋巴细胞; 免疫; 抗氧化; NF-κB信号通路

本文引用格式

朱建军 , 柳婷婷 , 王政力 , 马艳 , 申红 , 王俊刚 . 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(2) : 1234 -1244 . DOI: 10.12418/CJAN2025.107

Abstract

This study aimed to evaluate the effects of Brassica rapa L. polysaccharides (BRP) on the immune and antioxidant functions of peripheral blood lymphocytes (PBLs) in yellow-feathered quails. The Brassica rapa L. roots were crushed, and BRP was extracted using hot water extraction, macroporous resin adsorption, and DEAE-52 cellulose column purification, resulting in a purity of 99.85% and a molecular weight of 118 ku. Blood samples were taken from the veins of yellow-feathered quails, and lymphocytes were isolated with a PBLs extraction kit. Lymphocytes were suspended in RPMI-1640 medium (with 10% fetal bovine serum and 1% double antibiotics), and the cell concentration was adjusted to 1×107 cells/mL using Trypan blue staining and counting for PBLs culture in vitro test. The PBLs culture in vitro test involved five concentrations (0, 25, 50, 100 and 200 μg/mL) of BRP, with six replicates for each concentration. After 24 hours of PBLs culture, and the supernatant was collected to measure immune indexes [tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-8 (IL-8), interleukin-10 (IL-10), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin G(IgG) and immunoglobulin M (IgM) contents] and antioxidant indexes [glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) content]. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) method was also performed to assess the mRNA relative expression levels of immune-related genes, including IL-1β, IL-8, IL-10, TNF-α, Toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-κB (NF-κB), myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and antioxidant-related genes, including GSH-Px, CAT, SOD. The results showed as follows: 1) in terms of immune function, compared with the blank control group (0 μg/mL BRP), BRP at the concentrations of 50, 100 and 200 μg/mL extremely significantly increased IgA and IgM contents in the supernatant (P<0.01), while extremely significantly reduced IL-1β, IL-8 and TNF-α contents in the supernatant (P<0.01); moreover, BRP at the concentrations of 50 and 100 μg/mL also significantly increased IgG content in the supernatant (P<0.05). 2) In terms of antioxidant function, compared with the blank control group, BRP extremely significantly increased the supernatant CAT activity at the concentrations of 50, 100 and 200 μg/mL (P<0.01); furthermore, the mRNA relative expression levels of TLR4, NF-κB, IL-8 and TNF-α in the supernatant were extremely significantly reduced by BRP at the concentrations of 50, 100 and 200 μg/mL (P<0.01), whereas the mRNA relative expression levels of SOD, GSH-Px and CAT were significantly or extremely significantly elevated by BRP at the concentrations of 100 and 200 μg/mL (P<0.05 or P<0.01), and the mRNA relative expression level of MyD88 was extremely significantly elevated by BRP at the concentrations of 25 and 50 μg/mL (P<0.01). In conclusion, BRP enhances the immune and antioxidant functions of PBLs in yellow-feathered quails by modulating lymphocyte responses, with 100 μg/mL being the optimal concentration under this experimental condition.

Key words： Brassica rapa L. polysaccharides; yellow-feathered quails; peripheral blood lymphocytes; immune; antioxidant; NF-κB signal pathway

随着“禁抗”时代的到来,天然植物及其提取物因具有无毒副、无残留,不易产生耐药性等特性[1],在替抗方面具有较大的潜力。研究表明,植物多糖可以调节免疫器官的生长发育,增强机体对细菌和病毒的抵抗力[2-3]。多糖是细胞表面信号识别、细胞间信号传递和免疫相关反应的关键因素,它们可以通过与免疫细胞的相互作用刺激先天免疫和细胞免疫,以适当的方式调节免疫反应,促进免疫系统对抗各种不利因素[4]。我国家禽业几乎每2年就会出现一种新的疾病[5⇓⇓-8]。此外,家禽养殖每天面临相当多的环境应激,包括应激源、有毒物质、药物作用、营养因子不足、病毒、疾病等,导致免疫水平低下或免疫器官发育不良,致使免疫功能异常[9⇓⇓-12]。由于免疫系统的缺陷,机体的免疫屏障容易被打破,某些致病因子容易侵入机体[13-14]。黄羽鹌鹑在家禽养殖中占有重要地位,其肉和蛋富含优质蛋白质、多不饱和脂肪酸、矿物质和维生素[15-16],具有积极的健康益处,包括提高身体能量水平和改善视力[16-17]。
芜菁(Brassica rapa L.),维吾尔语为“恰玛古”,属十字花科(Brassicaceae)芸苔属(Brassica)[18],是新疆人民广泛食用的药食同源植物,主要产地在新疆柯坪县,为其地理保护登记产品,其种子、根均可入药,具有多种药理活性。芜菁多糖是芜菁的主要活性成分之一,其干燥块茎的总多糖含量在9.10%~16.32%[19]。海力茜·陶尔大洪等[20]研究发现,芜菁中性多糖能使荷瘤小鼠血清和脾脏中免疫因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量升高,从而参与免疫调节,发挥抗肿瘤作用;李亚童等[21]通过水提醇沉法得到芜菁粗多糖,分离纯化得到含量为55.47%的均一芜菁酸性多糖,该多糖具有抗氧化活性,其抗氧化能力随浓度增加而增大;Shin等[22]研究发现,来自芜菁的活性成分arvelexin通过干扰IκB激酶β(IKKβ)诱导的核因子-κB(NF-κB)和一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)在转录水平上的表达,降低了注射脂多糖小鼠的血清一氧化氮(NO)和炎性细胞因子含量以及小鼠的死亡率。
本研究对芜菁多糖进行提取、分离、纯化,将所得到的芜菁多糖作用于黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞,分析其对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响,为其作为新型绿色饲料添加剂应用在家禽养殖上提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

该研究已获得石河子大学动物科学与技术学院动物实验伦理委员会的批准,伦理审查代码为A2021-14。

1.2 试验材料

芜菁购于石河子市九鼎批发市场,经石河子大学农学院王俊刚教授鉴定为芜菁的地下茎。黄羽鹌鹑购于新疆呼图壁县105团锦程果蔬种植农民专业合作社。石油醚购自天津富宇精细化工有限公司;浓硫酸(H2SO4)购自天津永晟精细化工有限公司;苯酚(C6H6O)、氯仿和无水乙醇均购自天津鑫伯特化工有限公司;正丁醇购自天津福晨化学试剂厂;NKA-9大孔树脂和DEAE-52纤维素均购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司;葡萄糖标准品购自天津大茂化学试剂厂;细胞因子检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司;RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;荧光定量PCR试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司;RP-MI1640细胞培养液和胎牛血清购自依科赛公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司;水为实验室自制超纯水;其他常用化学试剂为国产分析纯。

1.3 主要仪器

主要仪器有真空冷冻干燥机(美国Thermo Fisher公司)、分析天平(北京楚齐仪表责任有限公司)、超净台(上海博迅公司)、NanoDrop微量分光光度计仪器(美国Thermo Fisher公司)、酶标仪(美国Bio-Rad公司)、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)、细胞培养板(西安ONOBATE公司)和实时荧光PCR仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.4 芜菁多糖的提取和分离纯化

本试验选择经典的水提醇沉方法提取芜菁多糖。

1.4.1 水提

准确称取20.001 1 g经过预处理过的芜菁粉末,在索氏抽提器中脱脂12 h,使用滤纸包好,滤纸和线绳使用前需要使用石油醚进行12 h脱脂,烘干后方可使用,按照药物∶提取液=1∶20比例,加入400 mL蒸馏水,煮沸提取3次,每次30 min,收集3次上清液,用旋转蒸发仪浓缩至原上清液体积的1/5,得到约50 mL的浓缩液。

1.4.2 醇沉

边搅拌边向浓缩液中加无水乙醇500 mL使含醇量达到90.9%,置4 ℃冰箱过夜。次日早晨将醇沉好的浓缩液从冰箱里拿出,倾去上清液,将沉淀加少许蒸馏水,转移至已经恒重的蒸发皿中,置于真空干燥箱中,50 ℃干燥至恒重,既得芜菁粗多糖,称重记录。

1.4.3 除蛋白

将上述干燥至恒重的芜菁粗多糖放入三角烧瓶内,加入少许蒸馏水,按Sevag法加入多糖溶液3倍试剂(正丁醇∶氯仿=1∶4),放在振荡器上振摇5 min,转移至分液漏斗中,静置10 min后,可发现溶液分为3层,从上至下分别为多糖溶液层、沉淀层(变性蛋白层)和Sevag试剂层。取多糖溶液层,继续按体积比1∶4加入氯仿-正丁醇混合液,至没有沉淀产生为止,取多糖溶液层备用。

1.4.4 脱色

将除完蛋白的多糖溶液加热至60 ℃,然后加入其体积2%活化好的活性炭,放在60 ℃水浴锅中静置30 min,用布氏漏斗加双层润湿滤纸抽滤2遍,滤液置蒸发皿中于水浴锅中浓缩至50 mL左右,加乙醇490 mL,使含醇量达到90.1%,4 ℃冰箱静置过夜后,在7 155×g下离心5 min,沉淀放恒重的蒸发皿中,在真空干燥箱中以50 ℃的干燥至恒重,装入密封袋后置干燥容器中备用。

1.4.5 分离纯化

将NKA-9大孔树脂和DEAE-52纤维素装入玻璃层析柱中,采用无菌去离子水洗涤,经蒸馏水平衡后床层体积为50 mL。称取100 mg芜菁多糖(由上述步骤中制得)溶于10 mL蒸馏水中,待充分溶解后,上样,使用蒸馏水洗脱,流速为1 mL/min,每管收集8 mL。采用苯酚-硫酸法对每管溶液中的多糖含量进行测定,合并收集液,浓缩、冷冻干燥后得到纯化后的芜菁多糖,将其置于-20 ℃保存备用。

1.5 芜菁多糖单糖组成测定

分别准确称取单糖(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸)标准品,加入蒸馏水配成10 mg/mL标准品母液单标,然后取适量标准品母液单标混合配制成浓度为60(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖)、50(甘露糖)或40 μg/mL(果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古罗糖醛酸)的标准品混标。取干净的色谱瓶,称取适量芜菁多糖样品,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶液,121 ℃加热2 h;通氮气,吹干;加入99.99%甲醇清洗,再吹干,重复甲醇清洗2~3次;加入无菌水溶解,转入色谱瓶中待测。色谱系统采用的是Thermo ICS 5000+离子色谱系统,利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。
采用DionexTM CarboPacTM PA20(150 mm×3.0 mm,10 μm)液相色谱柱;进样量为5 μL。流动相A为水(H2O),流动相B为0.1 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液,流动相C为0.1 mol/L NaOH+0.2 mol/L醋酸钠(NaAc)溶液,流速0.5 mL/min;柱温为30 ℃;洗脱梯度:0 min A相∶B相∶C相=95∶5∶0(体积比),26 min A相∶B相∶C相=85∶5∶10(体积比),42 min A相∶B相∶C相=85∶5∶10(体积比),42.1 min A相∶B相∶C相=60∶0∶40(体积比),52 min A相∶B相∶C相=60∶40∶0(体积比),52.1 min A相∶B相∶C相=95∶5∶0(体积比),60 min A相∶B相∶C相=95∶5∶0(体积比)。

1.6 黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞的体外培养试验

1.6.1 外周血淋巴细胞的培养

黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞的采集及其悬浮液制备参照张凌会[23]的方法,略有不同。用无菌的肝素钠抗凝采血管对黄羽鹌鹑翅静脉进行血液样品采集,取4 mL淋巴细胞分离液置于新的离心管中,将等体积的血液样品缓慢加入到淋巴细胞分离液上层,以698×g转速离心20 min后收集悬浮在液体中间的乳白色淋巴细胞层到新的离心管中,使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后,收集淋巴细胞悬于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清+1%双抗)中。使用台盼蓝(TBD)染色计数法进行计数,调整悬浮液中细胞浓度为1×107个/mL,用于外周血淋巴细胞体外培养试验。

1.6.2 芜菁多糖对外周血淋巴细胞活性的影响

以MTT法测定芜菁多糖对上述获得的外周血淋巴细胞的细胞毒性。配制浓度分别为25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL的芜菁多糖溶液,过滤后置于4 ℃冰箱保存。将外周血淋巴细胞悬浮液接种于96孔板,密度为每孔100 μL、1×106个细胞,在培养箱(37 ℃和5% CO2)培养24 h;试验组加入100 μL不同浓度的芜菁多糖溶液,对照组则加入相同体积的RPMI-1640培养基,空白组加入110 μL的RPMI-1640培养基,培养24 h;试验组和对照组每孔加入10 μL MTT溶液(1 mg/mL)培养4 h,每孔加入110 μL DMSO,在570 nm下读取吸光度值。每个处理设置6个重复孔,按如下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(%)=[(试验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100。

1.6.3 芜菁多糖对外周血淋巴细胞免疫和抗氧化指标的影响

将上述外周血淋巴细胞接种于24孔无菌培养板中,每孔接种2 mL外周血淋巴细胞悬浮液,分别在培养孔中加入终浓度为0、25、50、100、200 μg/mL的芜菁多糖,每个处理6个重复孔,在培养箱(37 ℃和5% CO2)中孵育培养24 h至淋巴细胞铺满底部,取上清液,用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测上清液中免疫指标[TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量]和抗氧化指标[谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量]。

1.6.4 芜菁多糖对外周血淋巴细胞Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路相关基因表达的影响

上述获得的外周血淋巴细胞溶于细胞裂解液中,使用TransZoL Up Plus RNA Kit提取细胞中的总RNA,通过NanoDrop微量分光光度计测定RNA浓度,用BioGold Q RT SuperMix for qPCR将RNA反转成cDNA。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法测定免疫相关基因IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、TLR4、NF-κB、髓样分化因子88(MyD88)与抗氧化相关基因GSH-Px、CAT、SOD的表达量。反应体系为20 μL,其中包含cDNA 1 μL、上游和下游引物各0.4 μL、BioGold SYBR qPCR MasterMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL。相关引物序列见表1,引物合成由新疆有康生物公司完成,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。
表1 实时荧光定量PCR的基因特异性引物

Table 1 Gene-specific primers for RT-qPCR

基因名称
Gene names		 基因序列号
Gene ID		 引物序列
Primer sequence (5'—3')		 产物大小
Product size/bp
白细胞介素-1β
IL-1β		 NM_204524 F:CAGCCTCAGCGAAGAGACCTT
R:ACTGTGGTGTGCTCAGAATCC		 84
白细胞介素-8
IL-8		 HM179639 F:CTGGCCCTCCTCCTGGTT
R:GCAGCTCATTCCCCATCTTTAC		 139
白细胞介素-10
IL-10		 AB559574 F:CACAACTTCTTCACCTGCGAG
R:CATGGCTTTGTAGATCCCGTTC		 96
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 MM_204628.2 F:TGTGTATGTGCAGCAACCCGTAGT
R:GGCATTGCAATTTGGACAGAAGT		 229
Toll样受体4
TLR4		 NM_001030693.2 F:TTCAGAACGGACTCTTGAGTGG
R:CAACCGAATAGTGGTGACGTTG		 131
核因子-κB
NF-κB		 NM_001396038.1 F:CAGCCCATCTATGACAACCG
R:CAGCCCAGAAACGAACCTC		 151
髓样分化因子88
MyD88		 NM_001030962.5 F:CCTGGCTGTGCCTTCGGA
R:TCACCAAGTGCTGGATGCTA		 198
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px		 NM_001277853.1 F:GACCAACCCGCAGTACATCA
R:GAGGTGCGGGCTTTCCTTTA		 136
过氧化氢酶
CAT		 NM_001031215.1 F:GGTTCGGTGGGGTTGTCTTT
R:CACCAGTGGTCAAGGCATCT		 182
超氧化物歧化酶
SOD		 NM_205064.1 F:CCGGCTTGTCTGATGGAGAT
R:TGCATCTTTTGGTCCACCGT		 98
β-肌动蛋白
β-actin		 NM_205518 F:ATTGTCCACCGCAAATGCTTC
R:AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC		 118

1.7 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法进行多重比较,P<0.01为差异或回归效应极显著,P<0.05为差异或回归效应显著,0.05<P<0.10为差异或回归效应趋于显著,P>0.10为差异或回归效应不显著。

2 结果与分析

2.1 芜菁多糖的单糖组成

采用苯酚-硫酸法检测本试验提出纯化的芜菁多糖的多糖含量,用标准葡萄糖系列溶液绘制标准曲线,以吸光度值为纵坐标(y),葡萄糖浓度为横坐标(x),葡萄糖浓度与吸光度值呈良好的线性关系,回归方程为:y=3.914 9x+0.055 6(R2=0.999 4)。检测结果表明,芜菁多糖的提取率达到6.22%。用大孔树脂和葡聚糖凝胶柱层析纯化芜菁多糖,多糖的纯度为99.85%,测定分子质量为118 ku;采用离子液相色谱测定其单糖组分,主要由葡萄糖(90.23%)组成,其次是半乳糖醛酸(8.91%)、阿拉伯糖(0.49%)和半乳糖(0.37%)。单糖组分测定结果如图1所示。
图1 本试验制备的芜菁多糖单糖组分测定结果

Ara:阿拉伯糖 arabinose;Gal:半乳糖 galactose;Glc:葡萄糖glucose;Gal-UA:半乳糖醛酸 galacturonic acid。

Fig.1 Determination results of monosaccharide composition of Brassica rapa L. polysaccharides prepared in this experiment

2.2 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞活性的影响

由图2可知,在25~200 μg/mL的低浓度范围内,芜菁多糖对外周血淋巴细胞的抑制作用不明显,细胞存活率在90%以上。
图2 芜菁多糖对外周血淋巴细胞活性的影响

Fig.2 Effects of Brassica rapa L. polysaccharides on viability of peripheral blood lymphocytes

2.3 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞中免疫和抗氧化指标的影响

由表2可知,与空白对照组(0 μg/mL芜菁多糖)相比,当芜菁多糖浓度为50 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中IgA、IgM、IgG的含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),IL-1β和TNF-α的含量显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);当芜菁多糖浓度为100 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中IgA、IgM、IgG的含量极显著升高(P<0.01),促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α的含量显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。
表2 芜菁多糖对外周血淋巴细胞中免疫球蛋白和细胞因子含量的影响

Table 2 Effects of Brassica rapa L. polysaccharides on immunoglobulin and cytokine contents in peripheral blood lymphocytes

项目
Items		 芜菁多糖浓度
Brassica rapa L. polysaccharides concentration/(μg/mL)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0 25 50 100 200
免疫球蛋白A
IgA/(μg/mL)		 158.16Bc 178.22Ab 181.48Ab 195.37Aa 189.94Aab 3.02 <0.001 <0.001 <0.001
免疫球蛋白G
IgG/(μg/mL)		 1 231.76Bc 1 326.45ABbc 1 403.72ABab 1 464.04Aa 1 354.48ABabc 22.60 0.009 0.079 0.001
免疫球蛋白M
IgM/(μg/mL)		 635.09Cd 660.37Cd 751.83Bc 927.69Aa 855.21Ab 22.62 <0.001 <0.001 <0.001
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 64.96a 63.65ab 59.28bc 58.12c 58.42c 0.86 0.017 0.006 0.036
白细胞介素-8
IL-8/(pg/mL)		 237.29Aa 236.78Aa 221.03ABa 186.22Cb 199.17BCb 4.89 <0.001 <0.001 0.005
白细胞介素-10
IL-10/(pg/mL)		 38.28 39.40 41.25 43.26 42.02 0.72 0.188 0.071 0.095
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 73.96Aa 72.21Aa 62.08Bb 48.43Cc 51.53Cc 2.04 <0.001 <0.001 <0.001

同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different uppercase letter superscripts indicated extremely significant difference (P<0.01), and with different lowercase letter superscripts indicated significant difference (P<0.05), while with the same lowercase letter or no letter superscripts indicated no significant difference (P>0.05). The same as below.

由表3可知,与空白对照组相比,当芜菁多糖浓度为50、100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中CAT的活性极显著升高(P<0.01),GSH-Px和SOD的活性无显著变化(P>0.05)。
表3 芜菁多糖对外周血淋巴细胞中抗氧化指标的影响

Table 3 Effects of Brassica rapa L. polysaccharides on antioxidant indexes in peripheral blood lymphocytes

项目
Items		 芜菁多糖浓度
Brassica rapa L. polysaccharides concentration/(μg/mL)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0 25 50 100 200
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U/mL)		 11.03 10.92 11.12 12.86 10.14 0.30 0.054 0.523 0.015
过氧化氢酶
CAT/(U/mL)		 5.14Bb 5.53ABb 6.41Aa 6.53Aa 6.48Aa 0.16 0.006 0.003 0.015
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mL)		 50.14 50.31 49.89 56.75 52.09 1.08 0.235 0.286 0.159
丙二醛
MDA/(nmol/mL)		 2.55 1.97 2.28 1.61 1.88 0.12 0.104 0.079 0.111

2.4 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞中TLR4/NF-κB信号通路相关基因表达的影响

由表4可知,当芜菁多糖浓度为100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中TLR4、NF-κB、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量极显著低于空白对照组(P<0.01);当芜菁多糖浓度为25和50 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中MyD88的mRNA相对表达量极显著高于空白对照组(P<0.01);当芜菁多糖浓度为25、50、100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中IL-10的mRNA相对表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。
表4 芜菁多糖对外周血淋巴细胞中免疫相关基因表达的影响

Table 4 Effects of Brassica rapa L. polysaccharides on expression of immune-related genes in peripheral blood lymphocytes

项目
Items		 芜菁多糖浓度
Brassica rapa L. polysaccharides concentration/(μg/mL)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0 25 50 100 200
Toll样受体4
TLR4		 1.00Aa 0.98ABa 0.92ABab 0.85Bb 0.86Bb 0.02 0.009 0.002 0.076
核因子-κB
NF-κB		 1.00Aa 1.02Aa 0.95Aa 0.80Bb 0.80Bb 0.02 <0.001 <0.001 0.011
髓样分化因子88
MyD88		 1.00Cb 1.44Aa 1.35ABa 0.92Cb 1.10BCb 0.04 <0.001 0.095 0.879
白细胞介素-1β
IL-1β		 1.00 1.00 0.97 0.87 0.97 0.02 0.070 0.273 0.027
白细胞介素-8
IL-8		 1.00Aa 0.66Bb 0.64Bbc 0.53Cd 0.59BCc 0.03 <0.001 <0.001 <0.001
白细胞介素-10
IL-10		 1.00Cc 1.20Bb 1.22ABb 1.23ABb 1.28Aa 0.02 <0.001 <0.001 <0.001
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 1.00Aa 1.03Aa 0.99Aa 0.72Bb 0.77Bb 0.02 <0.001 <0.001 0.010
由表5可知,当芜菁多糖浓度为25、50、100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中GSH-Px和CAT的mRNA相对表达量极显著高于空白对照组(P<0.01);当芜菁多糖浓度为100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中SOD的mRNA相对表达量显著高于空白对照组(P<0.05)。
表5 芜菁多糖对外周血淋巴细胞中抗氧化相关基因表达的影响

Table 5 Effects of Brassica rapa L. polysaccharides on expression of antioxidant-related genes in peripheral blood lymphocytes

项目
Items		 芜菁多糖浓度
Brassica rapa L. polysaccharides concentration/(μg/mL)		 SEM P值P-value
处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
0 25 50 100 200
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px		 1.00Cc 1.29Bb 1.30Bb 1.38Bb 1.63Aa 0.03 <0.001 <0.001 0.056
过氧化氢酶
CAT		 1.00Ee 1.29Dd 2.73Cc 3.00Bb 4.21Aa 0.17 <0.001 <0.00 <0.001
超氧化物歧化酶
SOD		 1.00b 1.08ab 1.11ab 1.31a 1.16a 0.04 0.042 0.005 0.194

3 讨论

3.1 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞免疫功能的影响

黄羽鹌鹑的外周血中含有大量淋巴细胞,淋巴细胞是由淋巴器官产生的一类白细胞。本试验采用黄羽鹌鹑的外周血淋巴细胞作为模型,研究芜菁多糖对其免疫与抗氧化调节机制的影响。植物多糖能够从多个方面调节免疫系统功能,不仅能活化T细胞、B细胞、巨噬细胞及自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞,促进细胞因子的分泌,还可激活补体,从而调控机体的免疫功能[24]。Wufuer等[25]发现,芜菁多糖对正常细胞无毒性作用,且对人肺癌A549细胞具有显著的抑制作用,其机制主要通过诱导A549细胞释放活性氧(ROS),降低线粒体膜电位,上调B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3及p53基因的表达,同时抑制B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的表达,发挥抗肺癌作用。Wu等[26]的研究表明,黄芩多糖可降低小鼠结肠组织中IL-1β、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-6及TNF-α等炎症因子的含量;Li等[27]的研究显示,银杏叶多糖可通过减少脱毛小鼠皮肤中TNF-α、IL-12及IL-1β等炎症因子的含量,抑制炎症反应,并通过抑制NF-κB的激活缓解炎症。本试验所得结果与上述这些研究结果相似。本试验结果显示,与空白对照组相比,当芜菁多糖浓度为100 μg/mL时,可极显著提高外周血淋巴细胞上清液中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量,同时显著或极显著降低促炎因子IL-1β、IL-8及TNF-α的含量及其基因的表达,并极显著提升抗炎因子IL-10的基因表达。

3.2 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞抗氧化功能的影响

多糖的抗氧化机制具有多通道、多靶点、多效应的特点,主要通过内源性抗氧化应激通路核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路调控下游抗氧化酶基因的表达,从而减少自由基的生成[28]。CAT和SOD是关键的抗氧化酶,GSH-Px则是促进生物氧化的重要抗氧化剂。郭君婷等[29]研究发现,芜菁多糖可以通过调控Nrf2/血红素加氧酶-1(HO-1)通路,在多柔比星(DOX)诱导的H9c2细胞中降低DOX引起的心脏毒性,发挥其抗氧化作用。Xie等[30]研究发现,黄芪多糖不仅能显著提高鸡外周血淋巴细胞中SOD和GSH-Px的活性,还能减轻氧化剂的损害,本试验所得结果与此一致。本试验结果表明,当芜菁多糖浓度达到100 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中MDA含量减少,CAT活性增加,SOD和GSH-Px的基因表达提高,且呈现剂量依赖效应。同时,本试验还发现,外周血淋巴细胞上清液中GSH-Px的活性在芜菁多糖浓度由100 μg/mL增加到200 μg/mL后出现下降,这与吴蔚等[31]研究得出的在饲粮中添加500 mg/kg巴戟天多糖的文昌鸡血清中GSH-Px活性低于添加250 mg/kg的结果相似,这可能是由于多糖本身具有抗氧化活性,能够清除自由基,高浓度的多糖可能快速清除了自由基,减少了抗氧化酶的底物(如超氧阴离子自由基或过氧化氢)浓度,从而间接降低了抗氧化酶的活性。

3.3 芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞中TLR/NF-κB信号通路相关基因表达的影响

Toll样受体在识别病原体和启动先天免疫反应中发挥重要作用,同时也会触发各种细胞因子的产生。多糖与Toll样受体结合可激活多条信号通路,包括NF-κB信号通路介导一系列细胞内反应,从而诱导细胞因子产生[32]。NF-κB广泛分布于机体,参与多种基因、炎症反应和免疫反应的调控,是引发炎性小体激活,产生TNF-α、IL-6等细胞因子以及IL-1β前体的关键[33-34]。本试验结果显示,与空白对照组相比,芜菁多糖浓度为25和50 μg/mL时外周血淋巴细胞上清液中TLR4、NF-κB和炎症因子IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达量差异不显著,但均起到了一定的抑制作用;芜菁多糖浓度为100和200 μg/mL时,外周血淋巴细胞上清液中TLR4、NF-κB和下游促炎因子IL-8、TNF-α的mRNA相对表达量极显著下降,抗炎因子IL-10的mRNA相对表达量极显著上升,表明100和200 μg/mL的芜菁多糖对黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞的免疫功能具有一定的调节能力。此外,本试验还发现GSH-Px活性与其基因表达的变化趋势不一致,可能是由于蛋白质与基因表达并不总是同步,某些基因的mRNA分子可能在细胞质中快速降解,或在核输出过程中受阻;某些蛋白质可能通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解,或通过自噬途径被清除,导致蛋白质表达量低于预期。整体来看,添加芜菁多糖后,黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞上清液中GSH-Px活性及其基因相对表达量相较空白对照组有所提高。

4 结论

芜菁多糖通过淋巴细胞响应,可以在一定程度上提升黄羽鹌鹑外周血淋巴细胞的免疫和抗氧化功能,本试验条件下的最佳作用浓度为100 μg/mL。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
张泽茹, 赵玉全, 董可, 等. 植物提取物促动物生长作用机制的研究进展[J]. 动物营养学报, 2023, 35(8):4850-4859.

DOI

ZHANG Z R, ZHAO Y Q, DONG K, et al. Research progress on mechanism of action of plant extracts to promote animal growth[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2023, 35(8):4850-4859. (in Chinese)

DOI

[2]
WAN X H, YIN Y M, ZHOU C Z, et al. Polysaccharides derived from Chinese medicinal herbs:a promising choice of vaccine adjuvants[J]. Carbohydrate Polymers, 2022, 276:118739.

[3]
LI C X, LIU Y, ZHANG Y Z, et al. Astragalus polysaccharide:a review of its immunomodulatory effect[J]. Archives of Pharmacal Research, 2022, 45(6):367-389.

[4]
GONG H X, LI W N, SUN J L, et al. A review on plant polysaccharide based on drug delivery system for construction and application,with emphasis on traditional Chinese medicine polysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 211:711-728.

[5]
ALKIE T N, RAUTENSCHLEIN S. Infectious bursal disease virus in poultry:current status and future prospects[J]. Veterinary Medicine, 2016, 7:9-18.

[6]
KUMAR Y, SINGH V, KUMAR G, et al. Serovar diversity of Salmonella among poultry[J]. The Indian Journal of Medical Research, 2019, 150(1):92-95.

[7]
MAYERS J, MANSFIELD K L, BROWN I H. The role of vaccination in risk mitigation and control of Newcastle disease in poultry[J]. Vaccine, 2017, 35(44):5974-5980.

DOI PMID

[8]
JIANG W M, HOU G Y, LI J P, et al. Prevalence of H7N9 subtype avian influenza viruses in poultry in China,2013-2018[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2019, 66(4):1758-1761.

[9]
ABDEL-MONEIM A M E, SHEHATA A M, KHIDR R E, et al. Nutritional manipulation to combat heat stress in poultry-a comprehensive review[J]. Journal of Thermal Biology, 2021, 98:102915.

[10]
NAVEED M, HALEEM K S, GHAZANFAR S, et al. Quantitative estimation of aflatoxin level in poultry feed in selected poultry farms[J]. BioMed Research International, 2022, 2022:5397561.

[11]
ZHAI S S, ZHU Y W, FENG P S, et al. Ochratoxin A:its impact on poultry gut health and microbiota,an overview[J]. Poultry Science, 2021, 100(5):101037.

[12]
DHAMA K, CHAKRABORTY S, VERMA A K, et al. Fungal/mycotic diseases of poultry-diagnosis,treatment and control:a review[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences:PJBS, 2013, 16(23):1626-1640.

[13]
GIMENO I M, SCHAT K A. Virus-induced immunosuppression in chickens[J]. Avian Diseases, 2018, 62(3):272-285.

DOI PMID

[14]
WIGLEY P. Immunity to bacterial infection in the chicken[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2013, 41(3):413-417.

DOI PMID

[15]
PRITI M, SATISH S. Quail farming:an introduction[J]. International Journal of Life Science, 2014, 2(2):190-193.

[16]
ADENIYI P O, OBATOLU V A, FARINDE E O. Comparative evaluation of cholesterol content and storage quality of chicken and quail eggs[J]. World Journal of Nutrition and Health, 2016, 4(1):5-9.

[17]
TUNSARINGKARN T, TUNGJAROENCHAI W, SIRIWONG W. Nutrient benefits of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs[J]. International Journal of Scientific and Research Publications, 2013, 3(5):1-8.

[18]
王花, 乜国雁, 张萍, 等. 高原药食两用植物芜菁醚提取物对衰老小鼠免疫器官和SOD、MDA、GSH-Px水平的影响[J]. 时珍国医国药, 2014, 25(1):58-60.

WANG H, NIE G Y, ZHANG P, et al. Effects of plateau region plant Brassica rapa ether extracts to immune organ and SOD,MDA and GSH-Px of the aging-model mice[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2014, 25(1):58-60. (in Chinese)

[19]
杨永东. 藏药蔓菁多糖的制备、组分分析及抗急性低压缺氧损伤作用的研究[D]. 硕士学位论文. 成都: 成都中医药大学, 2013.

YANG Y D. Study on polysaccharide preparation,composition analysis and inhibition acute hypobaric hypoxia injury of Brassicae radix[D]. Master’s Thesis. Chengdu: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2013. (in Chinese)

[20]
海力茜·陶尔大洪, 古丽米拉·卡德尔, 乔丽洁, 等. 芜菁中性多糖对A549荷瘤小鼠免疫功能的影响[J]. 食品安全质量检测学报, 2023, 14(12):234-241.

HAILIQIAN T E D H, GULIMILA K D E, QIAO L J, et al. Effects of neutral polysaccharide from Brassica rapa L.on immune function of A549 tumor-bearing mice[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2023, 14(12):234-241. (in Chinese)

[21]
李亚童, 阿依夏古丽·巴卡斯, 李改茹, 等. 新疆芜菁酸性多糖分离纯化、抗氧化活性研究及红外表征[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(4):1050-1057.

LI Y T, AYIXIAGULI B K S, LI G R, et al. Isolation,purification,antioxidant activity exploration and infrared characterization of acidic polysaccharide from Xinjiang Brassica rapa L.[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(4):1050-1057. (in Chinese)

[22]
SHIN J S, NOH Y S, LEE Y S, et al. Arvelexin from Brassica rapa suppresses NF-κB-regulated pro-inflammatory gene expression by inhibiting activation of IκB kinase[J]. British Journal of Pharmacology, 2011, 164(1):145-158.

[23]
张凌会. 艾蒿多糖对肉仔鸡免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究[D]. 博士学位论文. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2021.

ZHANG L H. Study on the effects of Artemisia argyi polysaccharide on immune and antioxidant functions in broilers and the underlying mechanism[D]. Ph.D.Thesis. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2021. (in Chinese)

[24]
YIN M, ZHANG Y, LI H. Advances in research on immunoregulation of macrophages by plant polysaccharides[J]. Frontiers in Immunology, 2019, 10:145.

DOI PMID

[25]
WUFUER R, BAI J, LIU Z, et al. Biological activity of Brassica rapa L. polysaccharides on RAW264.7 macrophages and on tumor cells[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2020, 28(7):115330.

[26]
WU X, XU N N, YE Z Q, et al. Polysaccharide from Scutellaria barbata D. Don attenuates inflammatory response and microbial dysbiosis in ulcerative colitis mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 206:1-9. (in Chinese)

[27]
LI Y N, SHENG Y, LIU J Y, et al. Hair-growth promoting effect and anti-inflammatory mechanism of Ginkgo biloba polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers, 2022, 278:118811. (in Chinese)

[28]
邢媛媛. 黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其机理研究[D]. 博士学位论文. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2021.

XING Y Y. Study on the mitigation action of Artemisia ordosica polysaccharide on immune stress of broilers and the underlying mechanism[D]. Ph.D.Thesis. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2021. (in Chinese)

[29]
郭君婷, 赵婷婷, 叶斯木·塔拉甫别克, 等. 基于Nrf2/HO-1信号通路调控的恰玛古多糖抗多柔比星心肌毒性的机制研究[J]. 药学学报, 2024, 59(4):930-938.

GUO J T, ZHAO T T, YE SI MU T L F B K, et al. Mechanistic studies on the anti-DOX cardiotoxicity of polysaccharides of Brassica rapa L.based on the regulation of Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024, 59(4):930-938. (in Chinese)

[30]
XIE W Q, GE M, LI G X, et al. Astragalus polysaccharide protect against cadmium-induced cytotoxicity through the MDA5/NF-κB pathway in chicken peripheral blood lymphocytes[J]. Molecules, 2017, 22(10):1610.

[31]
吴蔚, 孙瑞萍, 刘杰, 等. 巴戟天多糖对文昌鸡生长性能、血清免疫和抗氧化指标及免疫器官发育的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(9):3847-3856.

DOI

WU W, SUN R P, LIU J, et al. Effects of Morinda officinalis polysaccharide on growth performance,serum immune and antioxidant indexes and immune organs development of Wenchang chickens[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2024, 51(9):3847-3856. (in Chinese)

[32]
ZHANG X R, QI C H, GUO Y, et al. Toll-like receptor 4-related immunostimulatory polysaccharides:primary structure,activity relationships,and possible interaction models[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 149:186-206.

[33]
DING Z, AN K, XIE L L, et al. Transmissible gastroenteritis virus infection induces NF-κB activation through RLR-mediated signaling[J]. Virology, 2017, 507:170-178.

DOI PMID

[34]
LAN W W, PETZNICK A, HERYATI S, et al. Nuclear factor-κB:central regulator in ocular surface inflammation and diseases[J]. The Ocular Surface, 2012, 10(3):137-148.

Options
文章导航

/

〈 〉

    联系我们

  • 地址：北京市海淀区圆明园西路2号
    　　　中国农业大学动科动医大楼153室
  • 邮编：100193
  • 电话：010－62817823
  • 网址：http://www.chinajan.com
  • E-mail：cjan@chinajan.com
京公网安备 11010802041926号    京ICP备17050989号-2