动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1312 - 1324

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.113

研究论文

苹果酸和柠檬酸对黄梁木叶青贮品质及微生物多样性的影响

  • 陈金钰 ,
  • 田汉晨 ,
  • 刘金洋 ,
  • 郭勇庆 ,
  • 邓铭 ,
  • 孙宝丽 , *
展开
  • 华南农业大学动物科学学院,广州 510642
*孙宝丽,教授,博士生导师,E-mail:

陈金钰(2000—),女,甘肃金昌人,硕士研究生,研究方向为动物健康养殖与安全生产。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2024-06-28

  网络出版日期: 2025-02-16

基金资助

华南农业大学新农村发展研究院2022年度农业科技合作共建项目-永根科技站(4300-E23053)

收起

Effects of Malic Acid and Citric Acid on Silage Quality and Microbial Diversity of Neolamarckia cadamba Leaves

  • CHEN Jinyu ,
  • TIAN Hanchen ,
  • LIU Jinyang ,
  • GUO Yongqing ,
  • DENG Ming ,
  • SUN Baoli , *
Expand
  • College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-06-28

  Online published: 2025-02-16

Fold

摘要

本试验旨在探究添加苹果酸(MA)和柠檬酸(CA)对黄梁木叶青贮品质及微生物多样性的影响。采用单因素设计方法,设置5个组,分别为空白对照组(CK组)、MAL组(添加0.5% MA)、MAH组(添加1.0% MA)、CAL组(添加0.5% CA)和CAH组(添加1.0% CA),每组设置3个重复;青贮60 d后开袋取样测定发酵参数、营养成分、蛋白质组分、蛋白酶活性、单宁含量以及微生物多样性。结果表明:1)与CK组相比,添加不同剂量MA和CA均可显著降低黄梁木叶青贮pH、干物质损失率(DML)以及乙酸(AA)、非蛋白氮(NPN)、氨态氮(AN)和游离氨基酸氮(FAN)含量(P<0.05),显著提高乳酸(LA)、粗蛋白质(CP)和真蛋白氮(TPN)含量(P<0.05);2)与CK组相比,MAH组酸性洗涤纤维(ADF)含量显著降低(P<0.05),MAL组和MAH组可溶性碳水化合物(WSC)含量显著提高(P<0.05);3)与CK组相比,CAL组和CAH组羧基肽酶活性显著降低(P<0.05);4)与CK组相比,添加有机酸对单宁含量无显著影响(P>0.05);5)与CK组相比,各有机酸添加组厚壁菌门相对丰度显著降低(P<0.05),乳杆菌属相对丰度有所降低(P>0.05);CAH组微小杆菌属相对丰度显著提高(P<0.05),变形菌门、不动杆菌属和气单胞菌属相对丰度有所提高(P>0.05)。综上所述,MA和CA均能不同程度改善黄梁木叶青贮品质,以添加1.0% MA效果较佳。

关键词： 黄梁木叶; 苹果酸; 柠檬酸; 青贮品质; 微生物多样性

本文引用格式

陈金钰 , 田汉晨 , 刘金洋 , 郭勇庆 , 邓铭 , 孙宝丽 . 苹果酸和柠檬酸对黄梁木叶青贮品质及微生物多样性的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(2) : 1312 -1324 . DOI: 10.12418/CJAN2025.113

Abstract

The aim of this study was to investigate the effects of adding malic acid (MA) and citric acid (CA) on silage quality and microbial diversity of Neolamarckia cadamba leaves. A single-factor design method was used to set up 5 groups, which were blank control group (CK group), MAL group (adding 0.5% MA), MAH group (adding 1.0% MA), CAL group (adding 0.5% CA) and CAH group (adding 1.0% CA), with 3 replicates in each group. The fermentation parameters, nutrients, protein component, protease activity, tannin content and microbial diversity in silage were determined after 60 days. The results showed as follows: 1) compared with CK group, adding MA and CA at different doses significantly decreased the pH, dry matter loss rate (DML) and contents of acetic acid (AA), non-protein nitrogen (NPN), ammonia nitrogen (AN) and free amino acid nitrogen (FAN) in silage (P<0.05), and significantly increased the contents of lactic acid (LA), crude protein (CP) and true protein nitrogen (TPN) (P<0.05); 2) compared with CK group, the acid detergent fiber (ADF) content in MAH group was significantly decreased (P<0.05), and the water soluble carbohydrate (WSC) content in MAL and MAH groups was significantly increased (P<0.05); 3) compared with CK group, the carboxypeptidase activity in CAL and CAH groups was significantly decreased (P<0.05); 4) compared with CK group, adding organic acids had no significant effects on tannin content (P>0.05); 5) compared with CK group, the Firmicutes relative abundance in each organic acid adding group was significantly decreased (P<0.05), and the Lactobacillus relative abundance was decreased (P>0.05); the Exiguobacterium relative abundance in CAH group was significantly increased (P<0.05), and relative abundances of Proteobacteria, Acinetobacter and Aeromonas were increased (P>0.05). In conclusion, both MA and CA can improve silage quality of Neolamarckia cadamba leaves in different degrees, and 1.0% MA is the best addition.

Key words： Neolamarckia cadamba leaves; malic acid; citric acid; silage quality; microbial diversity

饲料不足是导致畜牧业发展缓慢的主要原因之一。与草本饲料相比,木本饲料具有青绿期长、产量高以及经济实惠等优点[1],因此合理利用木本植物资源,调整饲料产业结构,可以充分缓解饲料供应不足的问题。在我国利用率较高的木本饲料原料主要有构树、银合欢、辣木及黄梁木(Neolamarckia cadamba)等[2]。其中,黄梁木是一种茜草科、团花属乔木,广泛分布于我国广西、云南等低海拔湿润地带。黄梁木生长速度极快[3],生物产量较高,年平均高生长量达3.5 m[4]。同时,黄梁木有着“奇迹树”“宝石树”的美称,其树皮、花和叶片等部位均具有不同的应用价值,是我国畜牧业近几年大力开发研究的新型木本饲料之一[2]。不仅如此,黄梁木还含有丰富的生物活性成分,具有多种生物学功能,如黄酮类化合物和生物碱具有显著抗氧化能力;萜类与抗腹泻、抗肿瘤等功能有关。Umachigi等[5]研究表明,黄梁木的树皮、叶片和果实的提取物能够明显抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。Gupta等[6]研究发现,黄梁木叶片中含有的皂甙成分有助于降低注射了肝炎疫苗小鼠体内的巨噬细胞水平,从而发挥消炎作用。Bussa[7]将黄梁木乙醇提取物应用于糖尿病大鼠发现,该提取物能够降低糖尿病大鼠血糖水平,而对正常大鼠无明显作用。
青贮是利用厌氧发酵保存新鲜饲料的一种技术,由于不同青贮原料营养成分组成的差异,直接发酵难以得到品质良好的青贮饲料,因此需要合理添加青贮添加剂,进而促进发酵的稳定进行,提高青贮质量[8]。目前,常见的青贮饲料添加剂大致包括微生物制剂、酶制剂、营养添加剂以及有机酸等[9]。其中,有机酸能够抑制好氧微生物和腐败细菌的活性,从而保存营养物质和提高发酵品质,被广泛应用于青贮饲料发酵[10]。已有资料显示,苹果酸(malic acid,MA)和柠檬酸(citric acid,CA)被应用于青贮饲料发酵过程时,具有提高发酵品质、减少蛋白质降解以及有效促进乳酸菌生长等多种益处。张娟等[11]研究了MA对圆叶决明青贮品质的影响,发现添加MA能够提高生物氮产量,减少甲烷排放,提高饲料利用率,有效改善了圆叶决明的青贮品质[12]。CA作为青贮添加剂的研究已有较多报道。韩雪林等[13]的研究结果表明,添加CA后能够有效改善圆叶决明青贮品质,且添加量为0.5%时效果最佳。还有研究表明,青贮饲料中的乳酸菌能够将CA转化成具有芳香气味的双乙酰和乙酸(acetic acid,AA)等物质,在改善青贮饲料适口性方面发挥重要作用[14-15]。此外,MA与CA作为柠檬酸循环中的重要组成成分,可以直接作为青贮发酵的基质,减少可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)的损失[16]。蛋白质降解是青贮过程中不可避免的现象,在蛋白酶及相关微生物酶的催化作用下,青贮饲料中的氮组分会发生变化,从而降低青贮饲料的营养价值[17]。大量研究表明,向青贮饲料中加入有机酸不仅可以提高发酵品质和有氧稳定性,延长青贮饲料的保存时间,还可以显著提高其粗蛋白质(crude protein,CP)含量,缓解蛋白质的分解,降低植物自身的呼吸作用对蛋白质的消耗,起到保护蛋白质的作用。李茂等[18]研究表明,使用浓度为0.2%的AA和丙酸处理青贮木薯叶,不仅可以显著降低其pH和丁酸含量,还可以增加乳酸(lactic acid,LA)含量,保证良好的发酵品质和营养价值。He等[19]的研究显示,没食子酸和单宁酸可以保护辣木蛋白避免在青贮过程中发生蛋白质降解。此外,还有研究表明,采用MA或CA处理苜蓿青贮能够改善青贮饲料发酵品质,抑制蛋白质水解[20]。
黄梁木作为一种高蛋白质木本饲料,营养物质全面,生物产量高,在畜禽行业中有较多应用。本试验对黄梁木叶进行青贮,将不同剂量MA与CA作为添加剂加入其中,探究有机酸对青贮饲料发酵品质和微生物多样性的影响以及对蛋白质的保护作用,以期为我国南方牧草资源的开发利用和畜牧业发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集与青贮饲料调制

MA和CA由华南农业大学草食动物研究室提供,纯度均为99.5%。黄梁木叶采摘于华南农业大学增城基地,放置在室内室温下晾晒3 h至水分为65%~75%,然后使用自动揉丝机将叶片切碎至1~2 cm的小段。
本试验采用单因素设计方法,设置5个组,分别为空白对照组(CK组)、MAL组(添加0.5% MA)、MAH组(添加1.0% MA)、CAL组(添加0.5% CA)和CAH组(添加1.0% CA),每组设置3个重复。将不同剂量MA和CA均匀喷洒至黄梁木叶表面,CK组喷洒相同体积蒸馏水。将原料与添加剂充分混匀之后,取200 g样品于聚乙烯袋中,使用XH-1200BL型真空压缩机压实并密封,置于室温,在相对湿度为40%~60%的阴暗处青贮60 d。

1.2 取样处理

青贮结束后开袋取样,各取10 g新鲜样品于冻存管和锥形瓶中,冻存管青贮样品于-80 ℃保存,用于微生物多样性测定;锥形瓶样品中加入90 mL蒸馏水,搅拌均匀,于4 ℃冰箱静置24 h后采用4层纱布过滤,收集滤液,保存于-20 ℃冰箱中备用。袋中剩余样品取150 g左右,放入105 ℃烘箱中烘2 h,之后温度调至65 ℃继续烘48 h,取出后放置于干燥器中冷却并称重。将烘干的样品粉碎后存放于密封袋中,用于营养成分测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 发酵参数测定

采用电子pH计测定pH;采用对羟基联苯比色法测定LA含量[21];采用Agilent 7890b气相色谱仪测定AA含量,进样前样品浸提液过0.45 μm滤膜。

1.3.2 营养成分测定

将150 g左右样品置于65 ℃烘箱中烘至恒重,按照AOAC(1990)[22]的方法测定干物质(DM)含量以及干物质损失率(dry matter loss rate,DML)。将烘干后的样品粉碎,按照Van Soest等[23]的方法,采用A200i型纤维分析仪(ANKOM,美国)测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量;采用6800型全自动凯氏定氮分析仪(Foss,瑞典)测定CP含量;采用硫酸-蒽酮比色法[24]测定WSC含量。

1.3.3 蛋白质组分测定

采用苯酚-次氯酸钠比色法[25]和茚三酮比色法[26]分别测定浸提液中氨态氮(ammonia nitrogen,AN)和游离氨基酸氮(free amino acid nitrogen,FAN)含量,采用三氯乙酸法测定粉碎样品中真蛋白氮(true protein nitrogen,TPN)和非蛋白氮(non-protein nitrogen,NPN)含量,具体方法为:称取0.5 g样品于离心管中,加入15%三氯乙酸溶液充分浸泡1 h后用定量滤纸过滤,无损获得过滤残渣,并将残渣连同滤纸烘干,采用凯氏定氮仪测定TPN含量,CP含量减去TPN含量即为NPN含量。

1.3.4 蛋白酶活性测定

蛋白酶活性的测定参考李旭娇[17]的方法,向10 g发酵后样品冷冻液中加入50 mL 0.1 mol/L的预冷磷酸钠缓冲液(pH=6,5 mmol/L硫代硫酸钠)进行匀浆。将匀浆液用4层纱布过滤后在4 ℃、4 419×g条件下离心10 min,提取上清液作为羧基肽酶和氨基肽酶活性测定的酶提取物。
羧基肽酶活性的测定:取0.1 mL酶提取物于试管中,将溶于乙酸钠-乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲溶液中的Z-苯丙酰胺-丙氨酸-OH作为反应底物取2 mL 2 mmol/L加入其中;将试管置于30 ℃水浴锅中2 h,之后沸水浴5 min终止反应;冷却后测定反应液中的氨基酸含量。酶提取物中的游离氨基酸含量与冷却后反应液中的氨基酸含量相减的数值表示为羧基肽酶的活性。
氨基肽酶的测定:取0.5 mL酶提取物于试管中,将溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的L-亮氨酸-4-硝基苯胺作为底物取2 mL 2 mmol/L加入试管中;将试管放入30 ℃水浴锅中静置2 h,之后沸水浴5 min终止反应;在410 nm处测定吸光度,所测吸光度值即为氨基肽酶活性。

1.3.5 单宁含量测定

水解单宁(hydrolysable tannin,HT)测定:称取0.2 g粉碎样品于10 mL离心管中,加入70%丙酮溶液,超声提取20 min后在4 ℃、621×g条件下离心10 min,收集上清液;采用Folin-Ciocalteu试剂比色法[27]测定总酚(total phenol,TP)和简单酚(simple phenol,SP)含量,使用没食子酸制作标准曲线,TP含量减去SP含量即为HT含量。
缩合单宁(condensed tannin,CT)测定[28]:称取20 mg样品于10 mL离心管中,加入10 mL盐酸-丙酮-丁醇溶液,70 ℃水浴2.5 h,冷却后1 105×g离心5 min,收集上清液,在554 nm处测定吸光度,使用原花青素制作标准曲线,计算CT含量。

1.3.6 微生物多样性测定

对各组青贮样品进行高通量测序,在无菌操作环境下取250~500 mg青贮样品置于2.0 mL离心管中,使用细菌基因组DNA提取试剂盒获得样品总DNA。采用PCR仪对细菌16S rDNA基因进行扩增,扩增区域为16S rDNA V3~V4区,选择引物为341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3');每个样本3个重复,PCR产物切胶回收,采用QuantiFluorTM荧光计进行定量;将纯化的扩增产物进行等量混合,连接测序接头,构建测序文库,通过Illumina PE250平台测序,测序工作由广州基迪奥生物科技有限公司完成。将测序结果与美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库进行比对,按97%相似性水平划分操作分类单元(OTU),利用QIIME软件计算α多样性指数(ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数),采用R语言中的“vegan”包进行β多样性分析,并绘制主成分分析(PCA)散点图,选取相对丰度高于1%的细菌类群进行属水平分析。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2019对原始数据进行处理,然后采用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行多重比较,结果数据采用平均值和均值标准误(SEM)表示,以P<0.05作为差异显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 黄梁木叶原料成分

由表1可知,黄梁木叶的DM含量为33.77%,位于30%~35%的理想DM含量内;CP含量为10.30%,其中TPN含量为93.17%;WSC含量为10.79%;TP、SP、HT和CT含量分别为1.73%、0.58%、1.14%和6.89%。
表1 黄梁木叶原料成分

Table 1 Raw material ingredients of Neolamarckia cadamba leaves %

项目Items 含量Content
干物质DM 33.77
粗蛋白质CP 10.30
可溶性碳水化合物WSC 10.79
真蛋白氮TPN/% CP 93.17
总酚TP 1.73
简单酚SP 0.58
水解单宁HT 1.14
缩合单宁CT 6.89

2.2 不同有机酸对黄梁木叶青贮品质的影响

由表2可知,与CK组相比,各有机酸添加组黄梁木叶青贮DM含量均无显著差异(P>0.05);CK组DML最高,各有机酸添加组DML相较于CK组均显著降低(P<0.05),且以添加1.0% MA(MAH组)效果最佳。各有机酸添加组pH与CK组相比均显著降低(P<0.05),以添加1.0% CA(CAH组)后pH达到最低3.69。CK组LA含量最低,各有机酸添加组LA含量均显著高于CK组(P<0.05),且添加1.0% MA后LA含量达到最高;CK组AA含量最高,各有机酸添加组AA含量均显著低于CK组(P<0.05),且添加1.0% CA后AA含量降至最低。
表2 不同有机酸对黄梁木叶青贮品质的影响

Table 2 Effects of different organic acids on silage quality of Neolamarckia cadamba leaves

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
干物质DM/% 32.72 32.90 32.98 32.86 33.03 0.04 0.09
干物质损失率DML/% 5.19a 3.80b 3.02c 3.88b 2.92c 0.02 <0.01
pH 4.20a 3.88c 3.69d 4.05b 3.71d 0.05 <0.01
乳酸LA/% 0.12c 0.25b 0.28a 0.25b 0.29a 0.02 <0.01
乙酸AA/% 0.59a 0.13b 0.03d 0.11bc 0.04cd 0.06 <0.01

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 不同有机酸对黄梁木叶青贮营养成分的影响

由表3可知,与CK组相比,MAH组黄梁木叶青贮ADF含量显著降低(P<0.05);同时,CAH组ADF含量显著低于CAL组(P<0.05)。与CK组相比,MAL和MAH组WSC含量均显著提高(P<0.05)。各有机酸添加组CP含量均显著高于CK组(P<0.05),且CAH组CP含量提高至12.65% DM,显著高于MAL组和MAH组(P<0.05)。各组间NDF含量无显著差异(P>0.05)。
表3 不同有机酸对黄梁木叶青贮营养成分的影响

Table 3 Effects of different organic acids on nutrients in silage of Neolamarckia cadamba leaves % DM

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
中性洗涤纤维NDF 40.75 41.23 39.42 41.57 37.18 0.59 0.09
酸性洗涤纤维ADF 34.96ab 35.43a 32.11bc 34.64ab 30.50c 0.63 0.02
可溶性碳水化合物WSC 4.45b 4.49b 4.46b 5.26a 5.30a 0.11 <0.01
粗蛋白质CP 10.70d 11.33c 12.65a 11.82b 12.10b 0.18 <0.01

2.4 不同有机酸对黄梁木叶青贮氮分布的影响

由表4可知,与CK组相比,添加MA和CA均能显著提高黄梁木叶青贮TPN含量(P<0.05),且不同剂量间无显著差异(P>0.05);添加MA和CA均能显著降低NPN、AN和FAN含量(P<0.05),但CAH组和MAH组的效果优于CAL和MAL组,差异不显著(P>0.05)。
表4 不同有机酸对黄梁木叶青贮氮分布的影响

Table 4 Effects of different organic acids on nitrogen distribution in silage of Neolamarckia cadamba leaves %

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
真蛋白氮TPN 82.27b 86.02a 87.46a 85.64a 86.73a 0.56 <0.01
非蛋白氮NPN 17.73a 13.99b 12.54b 14.37b 13.27b 0.56 <0.01
氨态氮AN 1.69a 0.83bc 0.59c 0.87b 0.68bc 0.11 <0.01
游离氨基酸氮FAN 5.70a 4.35bc 3.12c 4.41b 3.34bc 0.29 <0.01

2.5 不同有机酸对黄梁木叶青贮蛋白酶活性及单宁含量的影响

由表5可知,与CK组相比,CAL组黄梁木叶青贮氨基肽酶活性显著提高(P<0.05),MAL组和MAH组氨基肽酶活性均无显著差异(P>0.05);CAL组和CAH组羧基肽酶活性均显著降低(P<0.05),且CAH组羧基肽酶活性显著低于CAL组(P<0.05)。与CK组相比,添加不同剂量MA和CA对黄梁木叶青贮TP、SP、HT和CT含量均无显著影响(P>0.05)。
表5 不同有机酸对黄梁木叶青贮蛋白酶活性及单宁含量的影响

Table 5 Effect of different organic acids on proteinase activity and tannin content in silage of Neolamarckia cadamba leaves

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
氨基肽酶
Aminopeptidase/[U/(h·g DM)]		 11.26b 13.36a 10.49b 11.00b 9.92b 0.38 0.01
羧基肽酶
Carboxypeptidase/[μmol AA/(h·g DM)]		 62.14ab 41.70c 22.05d 52.99bc 73.92a 5.07 <0.01
总酚TP/% 0.82 1.00 1.17 1.03 1.07 0.05 0.36
简单酚SP/% 0.21 0.21 0.24 0.21 0.26 0.01 0.26
水解单宁HT/% 0.61 0.79 0.93 0.83 0.81 0.05 0.36
缩合单宁CT/% 4.56 3.98 4.46 4.01 4.23 0.11 0.37

2.6 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物多样性的影响

2.6.1 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物α多样性的影响

由表6可知,各组黄梁木叶青贮微生物群落Good’s覆盖度均大于0.99,表明测序结果很好地反映出样本中细菌的真实情况。与CK组相比,各有机酸添加组Chao1指数、ACE指数和Shannon指数均有所提高,但差异均不显著(P>0.05)。
表6 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物α多样性的影响

Table 6 Effects of different organic acids on microbial α diversity in silage of Neolamarckia cadamba leaves

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
Good’s覆盖度Good’s coverage 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 <0.01 0.58
Chao1指数Chao1 index 225.68 236.58 241.32 253.64 246.66 9.17 0.93
ACE指数ACE index 232.64 238.32 247.97 252.04 249.44 7.89 0.95
Shannon指数Shannon index 2.21 2.74 3.87 2.71 3.01 0.24 0.30
Simpson指数Simpson index 0.59 0.61 0.86 0.65 0.66 0.05 0.40

2.6.2 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物β多样性的影响

黄梁木叶青贮微生物β多样性PCA如图1所示,第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的贡献率分别为16.0%和12.1%,各组微生物群落未见明显区分,表明各组间微生物差异不显著(P>0.05)。
图1 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物β多样性的影响(主成分分析)

Fig.1 Effects of different organic acids on microbial β diversity in silage of Neolamarckia cadamba leaves (PCA)

2.6.3 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物组成的影响

由表7可知,在门水平上,黄梁木叶青贮微生物中相对丰度排名前10的菌门分别是蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、髌骨菌门(Patescibacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinoccus-Thermus)、浮霉菌门(Planctomycetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)。与CK组相比,CAH组蓝细菌门相对丰度明显降低,但差异不显著(P>0.05);各有机酸添加组厚壁菌门相对丰度均显著降低(P<0.05),变形菌门相对丰度有所提高(P>0.05)。各组间其他菌门相对丰度均无显著差异(P>0.05)。
表7 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物在门水平上相对丰度的影响

Table 7 Effects of different organic acids on relative abundance of microflora in silage of Neolamarckia cadamba leaves at phylum level %

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
蓝细菌门Cyanobacteria 60.46 54.77 8.57 49.85 50.31 6.99 0.11
变形菌门Proteobacteria 21.46 33.47 69.32 37.71 31.93 5.89 0.08
厚壁菌门Firmicutes 15.50a 6.60b 6.69b 4.21b 6.03b 1.28 0.01
拟杆菌门Bacteroidetes 0.65 2.35 14.81 6.68 10.04 2.15 0.22
放线菌门Actinobacteria 1.74 2.59 0.56 1.35 1.48 0.24 0.08
髌骨菌门Patescibacteria 0.04 0.03 0.00 0.03 0.17 0.03 0.50
脱铁杆菌门Deferribacteres 0.03 0.05 0.00 0.00 0.02 0.01 0.61
异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus 0.01 0.02 0.00 0.05 0.01 0.01 0.60
浮霉菌门Planctomycetes 0.00 0.02 0.01 0.04 0.00 0.01 0.46
酸杆菌门Acidobacteria 0.03 0.02 0.00 0.02 0.00 0.00 0.34
由表8可知,在属水平上,黄梁木叶青贮微生物中相对丰度排名前10的菌属分别是不动杆菌属(Acinetobacter)、黄金杆菌属(Chryseobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、马赛菌属(Massilia)、链球菌属(Streptococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)和魏斯氏菌属(Weissella)。与CK组相比,CAH组微小杆菌属相对丰度显著提高(P<0.05),不动杆菌属、气单胞菌属和马赛菌属相对丰度均有所提高(P>0.05);各有机酸添加组乳杆菌属相对丰度均有所降低,而黄金杆菌属、假单胞菌属和丛毛单胞菌属相对丰度有所提高,但差异均不显著(P>0.05)。各组间其他菌属相对丰度均无显著差异(P>0.05)。
表8 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物在属水平上相对丰度的影响

Table 8 Effects of different organic acids on relative abundance of microflora in silage of Neolamarckia cadamba leaves at genus level %

项目
Items		 组别Groups SEM P值
P-value
CK CAL CAH MAL MAH
不动杆菌属Acinetobacter 0.35 10.31 28.22 9.25 7.88 3.86 0.22
黄金杆菌属Chryseobacterium 0.10 1.22 12.75 5.34 6.25 1.98 0.29
气单胞菌属Aeromonas 0.11 0.19 17.48 2.01 0.22 2.56 0.11
假单胞菌属Pseudomonas 0.16 5.35 5.66 2.67 4.71 1.39 0.76
丛毛单胞菌属Comamonas 0.09 1.37 5.38 2.51 1.92 0.83 0.37
乳杆菌属Lactobacillus 8.25 0.60 0.13 1.06 0.93 1.17 0.12
马赛菌属Massilia 0.10 1.25 5.78 0.89 2.89 0.80 0.17
链球菌属Streptococcus 1.93 2.25 0.37 1.39 2.05 0.31 0.32
微小杆菌属Exiguobacterium 0.05b 2.00ab 5.50a 0.14b 0.08b 0.73 0.04
魏斯氏菌属Weissella 3.70 0.13 0.05 0.39 0.11 0.88 0.44

3 讨论

3.1 不同有机酸对黄梁木叶青贮品质的影响

青贮饲料原料的理想DM含量为30%~35%[29]。DM损失主要是因为青贮前期植物细胞的呼吸作用以及各种微生物的活动,如梭菌或酵母的代谢[30],而青贮后期这些生命活动均会逐渐受到抑制。本试验中,添加1.0% CA和MA均能够提高黄梁木叶青贮DM含量,且含量均在33%左右,表明本试验在添加一定剂量的有机酸后可以减少青贮饲料中DM的损失,保存更多营养物质。由于糖等易发酵物质在青贮过程中会首先被消耗,DML能够直接体现青贮饲料的保存率和消化率。本试验结果显示,与CK组相比,MAH组和CAH组DML显著降低,表示添加高剂量MA和CA可以提高青贮饲料在动物体内的消化率,应用于反刍动物生产中有助于提高经济效益。
pH是评价青贮饲料是否发酵成功的重要参考依据之一,pH低于4.2表明青贮饲料发酵良好,能够长期保存[31]。本试验中,各组黄梁木叶青贮pH均低于4.2,与Li等[32]、Ke等[33]的研究结果相似。此外,与CK组相比,各有机酸添加组pH均显著降低。本试验pH的降低可能有2方面原因:一方面,添加有机酸后直接导致青贮黄梁木酸性增强,从而导致pH的降低;另一方面,LA的大量累积也是pH降低的重要原因。LA是青贮过程中值得关注的重要有机酸之一,是乳酸菌发酵所得产物。有文献报道,MA和CA能够在青贮过程中转化为LA,从而造成LA含量的升高[34]。除此以外,MA和CA及其代谢过程也会在青贮初期迅速降低环境pH,限制植物的呼吸作用和不良微生物的生长,从而减少营养物质的损失。本试验中,添加不同剂量MA和CA均能显著提高LA含量,表明黄梁木叶在青贮期间发酵良好,添加MA或CA均可以不同程度地改善黄梁木叶青贮品质。

3.2 不同有机酸对黄梁木叶青贮营养价值的影响

青贮饲料中WSC含量是决定发酵品质的重要因素之一。本试验中,添加0.5%和1.0% MA均可显著提高黄梁木叶青贮WSC含量,而添加不同剂量CA后WSC含量无显著变化,表明MA比CA更有助于减少WSC的损耗。WSC是乳酸菌发酵产生LA的底物,但由于本试验添加MA和CA后乳酸菌数量的降低,MAL组和MAH组的WSC可能没有被乳酸菌利用,从而导致WSC含量的升高。此外,MA为青贮发酵提供了额外的底物,随着青贮过程的持续进行,MA会同时向LA转化[35],因此添加0.5%和1.0% MA均可显著提高WSC和LA含量。pH降低的同时也抑制了其他有害菌的活动,减少了其他有害菌对营养物质的损耗以及蛋白质的水解[36]。
本试验中,添加1.0% MA可以显著降低黄梁木叶青贮中ADF含量,而添加不同剂量CA对NDF和ADF含量均无显著影响。青贮发酵过程中的蛋白质损失是造成青贮品质下降的关键因素。CP含量越高,证明饲料的饲用价值就越高。本试验中,与CK组相比,各有机酸添加组CP含量均显著提高,且CAH组CP含量最高,可见添加MA和CA均能够改善黄梁木青贮的营养价值,原因可能是添加有机酸后青贮环境迅速酸化,pH下降从而有效抑制了腐败微生物的活动,降低了其对蛋白质的利用,减少了青贮过程中的蛋白质损失[37]。

3.3 不同有机酸对黄梁木叶青贮蛋白质保护的影响

在高蛋白质饲料中,蛋白质水解是青贮饲料发酵过程中存在的重要问题。蛋白质会在植物蛋白酶的作用下水解为肽和游离氨基酸,之后在微生物作用下进一步分解为酰胺、胺和氨[38]。本试验中,添加MA和CA可能减弱了肽和游离氨基酸的脱氨基作用,从而减少了AN的产生。青贮饲料发酵过程中的AN和NPN是反映蛋白质降解程度的2个重要指标,高水平的AN代表不良微生物梭菌对蛋白质的分解活动旺盛[38],NPN的利用率在反刍动物体内低于TPN,因此,高水平的AN和NPN在青贮饲料中是不可取的。若存在严重的蛋白质水解现象,青贮饲料的营养价值将大幅降低,并且在实际生产中造成动物生产性能的下降及氮排放的增加[39]。TPN比例越高意味着蛋白质保存更好,蛋白质营养价值更高。本试验中,添加MA和CA后黄梁木叶青贮FAN、AN和NPN含量均显著降低,TPN含量均显著提高,这与Ke等[16]的研究结果类似,表明添加MA和CA均能有效保存更多蛋白质。
羧基肽酶和氨基肽酶是青贮饲料中主要的蛋白质水解酶,其活性在pH低于4.0时会大幅下降[40]。有研究表明,向青贮苜蓿中添加甲酸使其酸化后,可以显著降低羧基肽酶活性[41]。本试验结果发现,添加MA和CA对蛋白酶活性的影响不同,添加不同剂量CA显著降低羧基肽酶活性,而对氨基肽酶活性作用不明显;而添加MA并没有显著降低氨基肽酶和羧基肽酶活性。一方面,pH是影响蛋白酶活性的主要原因之一;另一方面,酶的活性可能与酶的构象有关。MA的酸性较CA而言更弱,在一定的pH环境下会对酶的结构产生影响,但是可能并不会对酶的活性产生显著抑制作用;而CA酸性较强,能够快速降低环境pH,可能导致酶构象的改变,从而导致酶活性的降低。
根据化学结构的不同,单宁可以分为HT和CT。单宁具有强大的蛋白质结合能力,这可能会在青贮期间保护蛋白质不被降解[42]。本试验结果显示,添加MA和CA对黄梁木叶青贮HT和CT含量均无显著影响,可能是因为青贮过程中的微生物产生的单宁酶在低pH环境下难以存活,无法促进单宁的降解[43]。此外,pH的变化会影响单宁酶的活性。刘如石等[43]和郭鲁宏等[44]研究发现,单宁酶的最适pH在6.0~6.5。因此,青贮60 d后,可能是pH的显著下降抑制了单宁酶、蛋白酶的活性以及不良微生物的发酵,蛋白质得以更好保存;也有可能是单宁能够和蛋白质形成一种难以降解的复合物,使得CP及单宁含量得以保存。

3.4 不同有机酸对黄梁木叶青贮微生物多样性的影响

青贮发酵是微生物群落演变的过程,其代谢产物生成直接影响到青贮品质。微生物多样性分析中的α多样性分析包括对微生物群落物种多样性及物种丰富度的分析,其中Chao1指数和ACE指数用于估算群落中物种的丰富度,其数值越高代表物种越丰富;而Shannon指数和Simpson指数则是用来描述群落多样性,数值越大表明群落种类越多且分布更均匀。本试验中,各有机酸添加组Chao1指数、ACE指数和Shannon指数均有所提高,但差异不显著,其中有机酸添加组中变形菌门相对丰度有所提升,而厚壁菌门相对丰度显著降低,说明添加有机酸改变了黄梁木叶青贮的微生物群落组成。在厌氧条件下,变形菌门和厚壁菌门在降解纤维的过程中发挥着关键作用[45],同时可以为青贮中微生物的活动提供更多发酵底物,这与周燚等[46]的研究结果一致。不动杆菌属是青贮原料中普遍存在的细菌种类,其为需氧、非发酵型菌属[47],可以存在于以AA为底物的厌氧环境[48]。本试验中,各组不动杆菌属仍然是相对丰度较高的菌属,这可能跟青贮时长以及添加有机酸使得青贮环境适宜不动杆菌属繁殖有关,但不动杆菌属也被证明具有蛋白酶和脱氨酶活性等功能[49]。研究表明,牧草青贮中最丰富的物种主要有微小杆菌属、假单胞菌属等[47],但与青贮发酵相关的乳酸菌主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属和魏斯氏菌属等[50]。本试验中,各有机酸添加组假单胞菌属和微小杆菌属相对丰度有所提高,这可能跟青贮过程中pH、青贮时长及温度有关;而乳酸菌的生长速率就受到pH和温度的影响,其在27~38 ℃的温度下繁殖速度最快,而低于27 ℃其生长速度会变慢,这也可能是本试验中各有机酸添加组乳杆菌属相对丰度降低的原因之一[34]。
当青贮饲料形成厌氧环境后,好氧微生物的生长迅速受到抑制,而厌氧微生物(如乳酸菌和梭菌)开始大量生长,并且彼此竞争营养物质。而青贮过程中产生的有机酸就是有益菌和有害菌如丁酸梭菌、霉菌等相互竞争的结果。在低pH环境下,乳酸菌大量繁殖并产生LA,进一步降低pH,抑制其他不良微生物的生长,最终获得高品质的青贮饲料。相反,高pH环境则会促进梭菌等有害微生物的生长,它们与乳酸菌竞争营养物质,导致青贮饲料品质下降。丁酸是由腐败微生物丁酸梭菌通过消耗青贮饲料中的蛋白质产生的有害物质,被奶牛摄入后会严重影响其健康。此外,梭菌发酵产生的AN等物质还会严重影响青贮饲料的气味及其适口性[51-52]。因此,在本试验条件中,MA和CA的添加使青贮环境迅速酸化,有效抑制了不良微生物的生长增殖,较好地保存了黄梁木叶青贮的营养成分。
综上所述,在青贮饲料添加剂研究领域,MA和CA的应用可能是一种可行的替代方案,但应与其他目前使用的微生物制剂及化学添加剂等进行进一步比较,以评估其使用效率和经济可行性。

4 结论

在本试验条件中,添加MA和CA可有效改善黄梁木叶青贮品质,其中添加1.0% MA可以更显著提高WSC含量,降低DML以及ADF和NDF含量,但2种有机酸均不能直接促进青贮中乳酸菌的增殖。综合分析得出,黄梁木叶青贮过程中以添加1.0% MA效果较佳。

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