动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1354 - 1364

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.116

研究论文

2株羊源酵母菌的分离鉴定及体外益生特性评价

  • 张璐 , 1 ,
  • 周英昊 2, * ,
  • 冯曼 2 ,
  • 宋连杰 2 ,
  • 刘爱瑜 1 ,
  • 董晴 1 ,
  • 苏东遥 1 ,
  • 李雪梅 , 1, ** ,
  • 高玉红 , 1, **
展开
  • 1 河北农业大学动物科技学院,保定 071000
  • 2 承德市农林科学院,承德 067000
**李雪梅,副教授,E-mail: ;
高玉红,教授,硕士生导师,E-mail:

*同等贡献作者

张 璐(1999—),女,河北秦皇岛人,硕士研究生,研究方向为动物营养与环境控制。E-mail:

Copy editor: 菅景颖

收稿日期: 2024-08-16

  网络出版日期: 2025-02-16

基金资助

河北省自然科学基金(C2023204024)

河北省重点研发计划项目(22326603D)

河北省羊产业体系(HBCT2024250403)

收起

Isolation and Identification of Two Yeast Strains Derived from Sheep and Probiotic Characteristics in Vitro Evaluation

  • ZHANG Lu , 1 ,
  • ZHOU Yinghao 2, * ,
  • FENG Man 2 ,
  • SONG Lianjie 2 ,
  • LIU Aiyu 1 ,
  • DONG Qing 1 ,
  • SU Dongyao 1 ,
  • LI Xuemei , 1, ** ,
  • GAO Yuhong , 1, **
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China
  • 2 Chengde Academy of Agriculture and Forestry, Chengde 067000, China
**LI Xuemei, associate professor, E-mail: ;
GAO Yuhong, professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2024-08-16

  Online published: 2025-02-16

Fold

摘要

本研究旨在分离鉴定羊源酵母菌并评价其益生特性,为提高育肥羊的消化性能提供益生菌筛选来源。以育肥羊不同肠段和瘤胃的内容物为菌株分离的来源,通过初筛和溶血试验复筛获取安全菌株,对其进行形态学、生化鉴定并进行26S rDNA测序鉴定得到2株酿酒酵母菌,并评价其耐受性、抑菌能力和药敏性。选取益生效果好的酿酒酵母菌进一步进行体外瘤胃发酵试验,设7个添加不同剂量(1×104 ~1×1010 CFU/g)酿酒酵母菌的试验组和1个不添加菌株的对照组,体外发酵48 h,检测不同时间段的产气量和养分降解率。结果显示:从育肥羊盲肠中分离并鉴定出2株酿酒酵母菌Ma和Mb,其生长对数期均为6~16 h,且对人工胃液和人工肠液均具一定的耐受性,存活率均超过100%,且酿酒酵母菌Ma的存活率极显著高于酿酒酵母菌Mb(P<0.01)。另外,2株酿酒酵母菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制性,且酿酒酵母菌Ma对这2种典型致病菌的抑菌圈直径均大于酿酒酵母菌Mb。从药敏特性分析,2株酿酒酵母菌对7种抗生素均具敏感性。酿酒酵母菌Ma的体外发酵结果表明,添加剂量为1×107 CFU/g时48 h产气量最多,且此时干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率最高,均显著高于对照组(P<0.05)。综上可知,本试验从育肥羊盲肠中分离出的2株酿酒酵母菌均具有耐受胃肠液、抑菌能力强且对抗生素敏感的特性,且酿酒酵母菌Ma的体外发酵效果较好,可为饲用益生菌剂的开发提供优良菌种。

关键词： 育肥羊; 酵母菌; 益生特性; 耐受性; 抑菌能力; 体外发酵

本文引用格式

张璐 , 周英昊 , 冯曼 , 宋连杰 , 刘爱瑜 , 董晴 , 苏东遥 , 李雪梅 , 高玉红 . 2株羊源酵母菌的分离鉴定及体外益生特性评价[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(2) : 1354 -1364 . DOI: 10.12418/CJAN2025.116

Abstract

This study aimed to isolate and identify yeast strains from sheep and evaluate their probiotic characteristics, so as to provide a source for screening probiotics for improving the digestive performance of fattening sheep. The content of different intestinal segments and rumen of fattening sheep was used as the source of strain isolation, safe strains were obtained via primary screening and re-screening in hemolysis test, and then identified by these methods of morphological, biochemical identification, and 26S rDNA sequencing was performed. As a result, two strains of Saccharomyces cerevisiae were obtained. Three parameters including tolerance, bacteriostatic ability and drug sensitivity of identified strains above were also evaluated. Optimal strains above were selected for in vitro rumen fermentation test for 48 h. Seven test groups were designed with Saccharomyces cerevisiae doses of 1×104 to 1×1010 CFU/g, and one control group was set without adding strain. Gas production and nutrient degradation rates were measured at different time intervals. The results showed that two strains of Saccharomyces cerevisiae Ma and Mb were isolated from the cecum with a growth logarithmic phase of 6 to 16 h, and demonstrated a certain tolerance to artificial rumen liquid and artificial intestinal fluid, with survival rates exceeding 100%. The survival rate of Saccharomyces cerevisiae Ma was extremely significantly greater than Saccharomyces cerevisiae Mb in both artificial rumen liquid and artificial intestinal fluid (P<0.01). In addition, both Saccharomyces cerevisiae Ma and Mb had some inhibited effects on two typical pathogenic bacteria (Staphylococcus aureus and Escherichia coli). Particularly, the Saccharomyces cerevisiae Ma exhibited a larger inhibition-zone diameter than Saccharomyces cerevisiae Mb. From the analysis of drug sensitivity characteristics, two strains of Saccharomyces cerevisiae were susceptible to seven antibiotics. Results from in vitro fermentation showed that the 48-h gas production was greater when Saccharomyces cerevisiae Ma additive dose was 1×107 CFU/g, meanwhile, the degradation rates of dry matter, crude protein, neutral detergent fiber and acid detergent fiber for additive dose of 1×107 CFU/g were the highest, and they were significantly greater than those of control group (P<0.05). In conclusion, the two Saccharomyces cerevisiae strains isolated form the cecum of fattening sheep in this experiment exhibit properties of tolerance to gastrointestinal fluids, strong bacteriostatic activity, and sensitivity to antibiotics, and the in vitro fermentation effect of Saccharomyces cerevisiae Ma is better, which can provide a good strain for the development of feed probiotics

Key words： fattening sheep; yeast; probiotic characteristics; tolerance; bacteriostatic ability; in vitro fermentation

随着国家养殖端禁抗政策的实施,益生菌的研发已成为国内外的研究热点。已有研究表明,作为饲料添加剂的理想益生菌种往往来源于动物消化道[1],尤其是同源益生菌,容易调节消化道的微生物平衡,从而发挥其益生功效。酵母菌是目前益生菌应用较为广泛的菌种之一,也是反刍动物营养中常用的益生菌,因为酵母菌安全、绿色且无残留,具有平衡消化道微生物区系、稳定pH、促进养分消化吸收的功能,有助于提高动物免疫和抗应激能力[2⇓-4]。目前酵母菌作为饲料添加剂已广泛应用于肉牛[5]和奶牛[6]。Olson等[7]的研究显示,每只育肥牛饲粮中添加28.4 g/d酵母培养物可使育肥牛增重5%~8%,犊牛增重12%~13%。王卫正等[8]的研究显示,泌乳中期奶牛饲粮中添加3%酵母培养物,奶牛产奶量可增加1.42 kg/d,且乳蛋白率和乳脂率分别提高2.67%和2.57%。肉羊育肥是我国近几年新兴起的产业,随着人们对羊肉消费量和高端羊肉需求量的增加,肉羊产业的发展前景更加广阔。但是,在当前肉羊养殖场过度追求高利润的背景下,肉羊胃肠道健康问题也逐渐暴露出来,而目前有助于胃肠道健康的饲用酵母菌多来源于食物[9]、肠道[10]、原乳[11]和粪便[12]等材料。已有研究证明,由于动物与自身消化道中微生物的长期选择与适应,来源于同类动物的益生菌其饲喂效果更好[13],但从育肥后期绵羊的胃肠内容物中分离酵母菌的相关研究很少。为了更好地解决肉羊在育肥过程中出现的消化性能差和饲料利用率低的难题,本研究选择育肥肉羊胃肠内容物作为酵母菌分离材料,通过初筛、复筛以及形态学鉴定和26S rDNA基因测序技术,筛选出安全、益生效果好的菌株,并通过体外发酵试验探究筛选出的酵母菌对体外发酵产气量和养分降解率的影响,以期为饲用益生菌的开发提供良好的菌种资源,以提高肉羊的饲养效率和健康水平提供帮助。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本试验方案已获得河北农业大学实验动物伦理委员会的批准(No.2023125)。

1.2 样本采集

挑选12只健康的待屠宰育肥羊,体重(60±5) kg,采集其瘤胃、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的内容物各50 g,置于4 ℃冰盒以备菌株分离。

1.3 菌株分离与鉴定

1.3.1 试验材料

试验所用培养基主要包括营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、YPD肉汤培养基、YPD琼脂培养基和血琼脂培养基。人工胃液和人工肠液配制参照韩佳临[14]报道的方法,人工胃液组成:3.1 g/L NaCl、1.1 g/L KCl、0.15 g/L CaCl2·2H2O和0.6 g/L NaHCO3,调节pH=3.0。人工肠液组成:13.6 g/L KH2PO4,调节pH=6.8,然后加入胰蛋白酶10 g/L。
抑菌试验所用的2株病原菌株均购自于中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC),分别为大肠杆菌(K88)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 分离纯化

称取已采集的各段胃肠道内容物各1 g,10倍稀释后,30 ℃振荡1~2 h。选取3个稀释度(10-4、10-5和10-6)的菌液,分别取50 μL涂布于YPD琼脂培养基表面,30 ℃倒置培养24 h。挑单菌落的酵母菌,划线接种到YPD培养基中,连续进行3次纯化。

1.3.2.2 筛选

酵母菌初筛采用产气性能测定方法[15]。将纯化的单菌落接种于含有杜氏小管的YPD肉汤培养基中,30 ℃培养48 h,选择24和48 h杜氏小管内均有气体产生的菌落进行复筛。挑取单菌落接种于YPD肉汤培养基中,30 ℃、150 r/min培养24~48 h。为了检测菌落的溶血性,将菌液接种于添加脱纤维羊血的血琼脂培养基表面,30 ℃培养24~48 h,筛选无溶血发生的安全菌株。

1.3.2.3 鉴定

对已筛出的安全菌株进行形态学、生化和26S rDNA基因测序鉴定。挑取复筛的单个安全菌落,在光学显微镜下观察其细胞形态,根据形态筛出疑似酵母菌的单菌落,然后按《酵母菌的特征与鉴定手册》[16]进行碳源同化生长试验和氮源同化生长试验。进一步将上述初步鉴定为酵母菌的菌液进行基因测序,上游和下游引物序列分别为27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTGTTACGACTT-3')。测序结果通过NCBI中BLAST功能分析不同生物序列的相似性。

1.3.2.4 胃肠液耐受性试验

将已鉴定的菌液以2%的接种量分别接种于人工胃液、人工肠液和对照培养基(YPD液体培养基)中,37 ℃培养3 h后,从稀释梯度为10-6和10-7的菌液中分别吸取50 μL,涂布平板后,倒置培养24~48 h,计算菌落的存活率。

1.3.2.5 抑菌试验

选择2种常见致病菌(金色葡萄球菌和大肠杆菌),其浓度控制在每毫升106~107个菌落形成单位(CFU)。将致原菌液涂布于营养琼脂培养基表面,然后在平板上打出3个直径为0.6 cm的小孔,每个孔加入100 μL本试验已鉴定的菌悬液,37 ℃培养24~48 h,测量抑菌圈直径。

1.3.2.6 药敏试验

采用药敏纸片琼脂扩散法(即K-B法)评估酵母菌对10种抗生素的敏感性。将已鉴定的菌液涂布于YPD培养基中,并将药敏纸片置于培养基上,30 ℃倒置培养24 h,测量抑菌圈直径。试验菌株对抗生素药敏性的判定标准参照NCCLS M27-A2抗真菌药敏试验标准[17]。

1.3.2.7 生长曲线测定

按照2%的接种量将已鉴定的菌液接种于YPD液体培养基中,30 ℃振荡培养24 h。每隔2 h测量菌液在600 nm处的吸光度值(OD600值),绘制该菌株的生长曲线。

1.3.3 酵母菌的体外发酵试验

1.3.3.1 试验设计

选择上述筛选出的益生效果好的酵母菌株进行体外发酵试验。共设8组,以不添加酵母菌株的组作为对照组,7个试验组的酵母菌株添加剂量分别1×104(1组)、1×105(2组)、1×106(3组)、1×107(4组)、1×108(5组)、1×109(6组)、1×1010 CFU/g(7组),发酵底物为精粗比例为6∶4的全混合日粮(TMR),每组5个重复。将装有5.0 g TMR的尼龙袋(尼龙布孔径为50 μm,尼龙袋尺寸为15 cm×20 cm)放入每个重复的发酵袋中,按照上述分组设计将酵母菌株和人工瘤胃液放入发酵袋中,发酵时间48 h。人工瘤胃液按照瘤胃液∶缓冲液=1∶3进行配比,其中瘤胃液取于待屠宰育肥羊,缓冲液的配制参照Menke等[18]报道的方法。

1.3.3.2 产气量测定

记录发酵2、4、6、8、10、12、24、36和48 h的气体产生量,并根据Ørskov等[19]的产气量模型计算理论总产气量。

1.3.3.3 养分降解率测定

发酵残渣和饲粮中干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的含量和总能(GE)参照AOAC(2000)[20]的方法进行测定,并根据姜菲等[21]方法计算养分降解率。

1.4 数据处理与分析

采用SAS 9.4软件的PROC GLM程序对试验数据进行单因素方差分析,并用Contrast语句对体外发酵试验中菌液添加剂量进行线性、二次、三次效应分析,采用Duncan氏法进行多重比较,结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

初筛菌株在YPD琼脂培养基上的菌落特性如图1所示。从育肥羊的胃肠道共分离出疑似酵母菌菌株2株(分别命名为Ma和Mb),均来源于盲肠,该菌株的菌落为乳白色,圆形,湿润有光泽,黏稠,易挑起,表面光滑,边缘整齐规则,无褶皱,无醭膜,较一般细菌菌落大而厚。
图1 疑似酵母菌菌株的形态

Fig.1 Morphology of suspected yeast strain

2.2 菌株的筛选

通过产气性能试验初筛,上述2株疑似酵母菌的发酵液在培养48 h后均出现产气现象,说明这2株菌生长和发酵速率快。通过溶血试验复筛发现,这2株疑似酵母菌均为安全菌株。菌株溶血试验的结果如图2所示,图2-A中的菌株具溶血性,图2-B中的菌株为安全菌株。
图2 菌株溶血现象

Fig.2 Hemolytic phenomenon of stains

2.3 筛选出的菌株的形态学特征

对上述筛选出的2株疑似酵母菌进行显微镜镜检,菌株镜检结果如图3所示,多数为出芽繁殖的椭球形菌株。
图3 菌株的镜检结果

Fig.3 Microscopic examination results of strains (1 000×)

2.4 筛选出的菌株的生化鉴定

对溶血试验筛出的2株疑似酵母菌进行生化鉴定,结果如表1所示。这2株疑似酵母菌对D-葡萄糖、麦芽糖、半乳糖等糖类具有发酵作用,但不能发酵乳糖;纤维二糖同化、水杨苷、柠檬酸盐、硝酸钾、尸胺、L-赖氨酸、类淀粉形成、0.01%放线菌酮和50% D-葡萄糖生长试验均呈阴性,无烟酸试验呈阳性。根据形态学观察以及生化试验试剂盒判定标准,对照文献[22],初步判定本试验分离出的Ma和Mb菌株为疑似酿酒酵母菌。
表1 2株安全菌株的生化鉴定结果

Table 1 Biochemical identification results of two safe strains

项目
Items		 菌株Strains
Ma Mb
D-葡萄糖D-glucose + +
麦芽糖Maltose + +
乳糖Lactose - -
半乳糖Galactose + +
纤维二糖同化
Cellobiose assimilation		 - -
水杨苷Salicin - -
柠檬酸盐Citrate - -
硝酸钾Potassium nitrate - -
L-赖氨酸L-lysine - -
尸胺Cadaverine - -
无烟酸Smokeless acid + +
尿素Urea - -
类淀粉形成Amyloid formation - -
0.01%放线菌酮
0.01% actinomycin		 - -
50% D-葡糖糖生长
50% D-glucose growth		 - -

“+”表示阳性;“-”表示阴性。

“+” means positive, “-” means negative.

2.5 筛选出的菌株的26S rDNA测序结果

从上述2株疑似酿酒酵母菌的DNA测序结果发现,26S rDNA基因特异性扩增产生的PCR产物片段均位于1 700 bp的位置,表现为清晰、无拖尾现象的单一条带(图4)。将符合测序要求的PCR产物测序结果进行BLAST序列比对,确认上述的Ma和Mb菌株为酿酒酵母菌(表2)。
图4 2株酵母菌的基因组DNA电泳图

M:DL2000DNA标记物 DL2000DNA marker。

Fig.4 Genomic DNA electrophoresis of two yeast strains

表2 Ma和Mb菌株的26S rDNA序列相似性比对结果

Table 2 Similarity comparison of 26S rDNA sequences from strains Ma and Mb

菌株编号
Strain numbers		 中文名
Chinese name		 英文名
English name		 覆盖率
Coverage/%		 同源性
Holomogy/%		 序列号
Serial number
Ma 酿酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 100 100 KM655848
Mb 酿酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 100 100 JX103177

2.6 2株酿酒酵母菌的抑菌性

本试验分离的2株酿酒酵母菌对2种典型致病菌——金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,具有不同程度的抑制性。Ma和Mb菌株对2种致病菌的抑菌效果如图5所示。Ma和Mb菌株对大肠杆菌的抑菌直径分别为10.83和9.63 mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为9.97和9.10 mm,Ma菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制性均大于Mb菌株。
图5 2株酿酒酵母菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果

Fig.5 Antibacterial effect of two strains of Saccharomyces cerevisiae on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

2.7 2株酿酒酵母菌的药敏性

本试验分离的2株酿酒酵母菌对10种抗生素的敏感性结果如图6所示。2株酿酒酵母菌对7种抗生素恩诺沙星(ENR)、卡那霉素(KAN)、链霉素(S)、新霉素(N)、强力霉菌素(DO)、环丙沙星(CIP)和多黏菌素B(PB)均具有敏感性,其中,对ENR、KAN、CIP和PB呈高度敏感;另外,2株酿酒酵母菌对氨苄西林(AMP)和青霉素(PEN)均不敏感。
图6 2株酿酒酵母菌对7种抗生素的敏感性

ERM:红霉素 erythromycin;ENR:恩诺沙星 enrofloxacin;CIP:环丙沙星 ciprofloxacin;DO:强力霉菌素 doxycycline;S:链霉素 streptomycin;N:新霉素 neomycin;PB:多黏菌素B polymyxin B;PEN:青霉素 penicillin;AMP:氨苄西林 ampicillin;KAN:卡那霉素 kanamycins。

“S”、“I”、“R”和“-(R)”依次表示高度敏感、中度敏感、不敏感和无抑菌圈。“S”、“I”、“R” and “-(R)” represent sequentially as highly sensitive, moderately sensitive, insensitive and no zone of inhibition.

Fig.6 Sensitivities of Saccharomyces cerevisiae to seven antibiotics

2.8 2株酿酒酵母菌的生长曲线和耐受性

本试验分离的2株酿酒酵母菌的生长对数期均为6~16 h,在18 h后进入生长平缓期(图7)。这2株酿酒酵母菌的在人工胃液和人工肠液中的存活率均高于100%(图8),Ma菌株在人工胃液和人工肠液中的存活率均极显著高于Mb菌株(P<0.01),较Mb菌株分别提高了8.8%和45.9%。
图7 2株酿酒酵母菌的生长曲线

Fig.7 Growth curve of two strains of Saccharomyces cerevisiae

图8 2株酿酒酵母菌在人工胃液和人工肠液中的存活率

数据柱形标注不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Fig.8 Survival rate of two strains of Saccharomyces cerevisiae in artificial rumen liquid and artificial intestinal liquid

Value columns with different capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

2.9 不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下产气量的影响

选择抑菌性和耐受性好的酿酒酵母菌Ma进行体外发酵试验。不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵产气量的影响如表3所示。4组48 h的产气量和理论总产气量最多,显著高于对照组(P<0.05),也显著高于2个较低剂量组(1组、2组和3组)和最高剂量组(7组)(P<0.05);另外,随着酿酒酵母菌Ma剂量的增加,48 h的产气量表现出线性(P<0.01)和三次变化(P<0.01)。
表3 不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下产气量的影响

Table 3 Effects of different doses of Saccharomyces cerevisiae Ma on gas production under in vitro fermentation mL

项目
Items		 对照组
Control
group		 1组
Group 1		 2组
Group 2		 3组
Group 3		 4组
Group 4		 5组
Group		 6组
Group 6		 7组
Group 7		 均值
标准误
SEM		 P值P-value
线性
Linear		 二次
Quadratic		 三次
Triple
产气量Gas production
2 h 7.50 6.92 8.53 7.68 8.42 9.83 9.25 7.50 0.69 0.15 0.80 0.05
4 h 19.08ab 14.83b 19.18ab 18.13ab 19.52ab 27.25a 27.58a 20.78ab 2.17 0.02 0.15 0.02
6 h 71.27ab 62.72b 77.17ab 80.68ab 79.88ab 89.17a 83.30ab 66.33ab 4.38 0.13 0.29 <0.01
8 h 185.83a 104.67c 142.83bc 158.83ab 187.52a 159.67ab 152.70ab 175.42ab 7.51 0.55 <0.01 <0.01
10 h 168.42b 173.33b 194.23ab 190.03ab 215.47a 221.83a 192.58ab 181.33b 6.32 <0.01 <0.01 <0.01
12 h 192.18c 198.75c 225.17bc 218.68bc 239.92ab 271.12a 220.13bc 220.08bc 6.68 <0.01 0.03 <0.01
24 h 289.92abc 272.50c 280.08bc 300.50abc 313.50ab 323.17a 308.92abc 318.50ab 7.46 <0.01 0.04 0.01
36 h 415.33ab 391.72b 428.30ab 416.98ab 453.33a 451.48a 435.67ab 429.15ab 9.01 0.01 0.76 <0.01
48 h 430.73cd 419.83d 431.33cd 455.43bc 495.18a 479.80ab 471.48ab 448.78c 5.26 <0.01 0.50 <0.01
理论总产气量
Total theoretical gas production		 477.09c 471.66c 467.98c 487.66abc 525.12a 495.95abc 519.36ab 482.21bc 7.08 0.06 0.95 0.02

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different lowercase letter superscripts indicate significant difference (P<0.05), while with the same lowercase letter superscripts indicate no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.10 不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下养分降解率的影响

不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下养分降解率的影响如表4所示。3组、4组、5组GE的降解率显著高于对照组以及其他剂量组(P<0.05);2组、4组、5组、6组DM的降解率显著高于对照组(P<0.05);CP、NDF和ADF的降解率均以4组最高,尤其是CP和NDF的降解率,4组的CP降解率显著高于除5组外的其他组(P<0.05),NDF降解率显著高于除6组外的其他组(P<0.05)。随着酿酒酵母菌Ma剂量的增加,GE和DM的降解率呈现出二次(P<0.01)和三次变化(P<0.01)。
表4 不同剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下养分降解率的影响

Table 4 Effects of different doses of Saccharomyces cerevisiae Ma on nutrient degradation rates under in vitro fermentation %

项目
Items		 对照组
Control
group		 1组
Group 1		 2组
Group 2		 3组
Group 3		 4组
Group 4		 5组
Group		 6组
Group 6		 7组
Group 7		 均值
标准误
SEM		 P值P-value
线性
Linear		 二次
Quadratic		 三次
Triple
总能GE 58.56b 59.35b 59.78b 63.20a 63.56a 64.74a 57.66b 57.75b 0.45 0.20 <0.01 <0.01
干物质DM 60.05c 60.70bc 64.41a 63.96ab 65.22a 64.41a 64.39a 58.37c 0.60 0.05 <0.01 <0.01
粗蛋白质CP 72.73c 73.86bc 74.65bc 72.89c 78.01a 76.02ab 72.51c 74.94bc 0.58 0.02 0.05 0.07
中性洗涤纤维
NDF		 37.63cd 36.73d 36.33d 37.20d 42.57a 38.93bcd 40.40abc 41.90cd 0.62 <0.01 <0.01 0.03
酸性洗涤纤维
ADF		 24.95bc 23.33c 26.50ab 27.60a 26.95ab 26.58ab 25.55abc 27.32ab 0.46 0.05 0.88 0.03

3 讨论

本试验分离的2株酵母菌(Ma和Mb)均来自肉羊的盲肠。已有研究表明,盲肠作为动物机体内微生物发酵的重要场所,微生物的数量远超前肠,并且动物盲肠微生物在宿主营养物质消化和肠道健康方面扮演着重要角色[23]。多年来国内外学者对家禽[24]和猪[25]的盲肠微生物进行了系统研究,但对绵羊的盲肠微生物的研究较少。本试验分离出的2株酵母菌通过形态学、生化鉴定以及26S rDNA鉴定确定为酿酒酵母菌。已有研究表明,酿酒酵母菌的耐高温性较强,易存活于动物肠道或瘤胃中并发挥其作用[26]。Dann等[27]研究发现,在断奶犊牛饲粮中添加14 g/d酿酒酵母菌可显著提高其采食量。饲用酿酒酵母不仅对奶牛产生积极影响,在肉牛养殖中也表现出一定的积极作用。杨顺然[28]在肉牛饲粮中添加30 g/(头·d)酿酒酵母菌时,显著提高了牛肉的嫩度和风味。本研究从羊盲肠筛出的2株酿酒酵母菌对胃肠液的耐受性和抑菌性均表现出一定的益生性,尤其是酿酒酵母菌Ma。已有研究指出,动物消化道内的高浓度胆酸盐构成了酿酒酵母菌生长的限制因素,对酿酒酵母菌生长产生抑制作用,但有些酿酒酵母菌对胆酸盐具有高耐受性[13]。刘琼等[29]通过高浓度胆酸盐冲击试验,成功验证了从肉鸭消化道中分离的7株酿酒酵母菌的存活率随胆酸盐浓度的增加而减小。本试验筛出的2株酿酒酵母菌在人工胃液、人工肠液中的存活率均高于100%,说明均能耐受胃液和肠液。酵母菌虽无法在瘤胃内增殖,但是可在瘤胃内保持一定活性,发挥其益生功效。另外,本试验分离出的2株酿酒酵母菌对致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较强的抑制能力,这与赵小燕等[30]的研究结果基本一致,该研究认为,酵母菌可以减少瘤胃液中大肠杆菌和李斯特菌的菌体数量。
从酿酒酵母菌Ma的体外发酵产气效果和养分降解率结果可以看出,添加不同剂量的酿酒酵母菌Ma,其效果不同。随着酿酒酵母菌Ma剂量的逐渐增加,48 h产气量随之增加,在添加剂量达1×107 CFU/g(4组)时,产气量达峰值,添加剂量超过1×107 CFU/g后产气量逐渐下降。众所周知,产气量是评定反刍动物瘤胃微生物对底物发酵程度的综合指标,产气量越多,说明瘤胃内微生物的发酵活性越强[31]。饲粮中添加适宜的酵母菌可在其代谢过程中产生对机体有益的某些活性物质,进而提高产气量和能量的利用率[32-33],当添加量超过适宜剂量时,菌液浓度过高,微生物之间对养分争夺激烈,造成菌体大量死亡,导致微生物活性降低。已有研究指出,适宜剂量的酵母菌能够增强反刍动物瘤胃中纤维素分解菌和乳酸利用菌的活性,有助于动物对饲粮中营养物质的消化与吸收[34]。类似研究也认为,酵母菌可以提高反刍动物瘤胃的产气量和养分消化率[35-36]。本研究中,1×107 CFU/g的酿酒酵母菌Ma显著提高了体外发酵条件下GE、DM、CP和NDF的降解率,与上述这些研究结果基本一致。养分降解率作为动物营养学研究的关键指标,常用来评价瘤胃发酵特性和动物饲料的营养价值。本研究中,添加1×107 CFU/g的酿酒酵母可能增强了瘤胃微生物活性,促进微生物对营养物质的降解。Jouany[37]研究指出,酿酒酵母菌能分泌微生物促生长因子以刺激瘤胃纤维分解菌的生长,从而提高瘤胃纤维降解能力。Malekkhahi等[38]关于羔羊饲喂酿酒酵母菌的研究也发现,羔羊饲粮中添加2×1010 CFU/d酿酒酵母菌显著提高了ADF和CP的消化率。类似研究报道也指出,湖羊饲粮中添加酵母培养物显著提高了养分降解率[39]。本研究中,虽然适宜剂量的酿酒酵母菌Ma对体外发酵条件下养分的降解率和产气量产生了积极影响,但实际生产条件下对肉羊生长性能和消化性能的影响仍未得到验证,后续本研究团队将通过饲养试验对分离出的羊源酵母菌的饲养效果进行进一步验证,为酵母益生菌的研发提供科学数据。

4 结论

本研究从育肥绵羊盲肠内容物中分离出2株耐受人工胃液和人工肠液且对2种致病菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)具有抑制作用的安全酿酒酵母菌Ma和Mb,且以Ma菌株的益生效果较佳;体外发酵条件下,酿酒酵母菌Ma添加剂量为1×107 CFU/g时48 h产气量较高,并在一定程度上提高了养分降解率。

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