异绿原酸(ICGA)是植物中的重要次生代谢产物之一,是经植物体内有氧呼吸,由莽草酸途径中咖啡酸和奎宁酸缩合形成的缩酚酸,具有较强的抗炎、抑菌、抗氧化、抗病毒等生物活性[1⇓⇓-4],广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中,如杜仲、甜叶菊、金银花、向日葵、咖啡、可可树等[5-6]。目前,有关异绿原酸的研究主要集中在异绿原酸的提取、生物活性和药代动力学方面。在我国畜牧行业全面禁抗的大背景下,植物提取物以其绿色无污染的特点,成为畜牧生产中理想的抗生素替代产品。在蛋鸡[7]、肉鸡[8]、仔猪[9]、绵羊[10]等的饲喂试验证实,在饲粮中添加适量的异绿原酸可提高畜禽的抗氧化能力和免疫力,调节肠道上皮细胞的增殖和凋亡,降低肠黏膜上皮的通透性,进而改善和提高幼畜的生长性能。因此,异绿原酸可作为潜在的替抗饲料添加剂进应用于畜禽生产。本文将从异绿原酸的结构、吸收代谢及其对畜禽生长性能、抗氧化能力、免疫功能、脂质代谢及肠道屏障的影响等方面进行综述,以期为异绿原酸在畜禽生产中的应用提供参考。
1 异绿原酸结构与提取
异绿原酸属于二咖啡酰奎宁酸类化合物,以异绿原酸A(4,5-二咖啡酰奎尼酸)、B(3,4-二咖啡酰奎尼酸)和C(3,5-二咖啡酰奎尼酸)3种异构体(图1)形式存在,但3种异构体在溶液中极不稳定,在特定条件下可以相互转化[11]。异绿原酸和绿原酸都是由咖啡酰基团与奎宁酸结合形成的酯,绿原酸由1分子咖啡酸和奎宁酸结合,而异绿原酸比绿原酸多1分子咖啡酸,因此结合后形成不同的构象,二者均表现出较强的抗氧化活性[12]。研究显示,异绿原酸表现出比绿原酸更好的抗氧化活性,这可能与奎宁酸上不同的酯化位置有关[13]。从结构上看,环己烷骨架的构象效应及异绿原酸的2个咖啡酰基的相对位置对其抗氧化能力至关重要[14-15]。拥有2个咖啡酰基团的异绿原酸比绿原酸所含羟基(-OH)更多,更易形成具有抗氧化活性的氢自由基,从而消除羟自由基和超氧阴离子自由基,以保护组织免受氧化损伤[16],且体外抗氧化试验进一步证明,异绿原酸的抗氧化活性是绿原酸的2倍[17]。
目前,在生产中主要利用D-101大孔树脂、中低压制备色谱分离金银花中异绿原酸A、B和C单体[18],也可通过70%乙醇回流,大孔树脂进行纯化获得异绿原酸单体。也有研究通过酸性丙酮溶液萃取浓缩,乙酸乙酯萃取并浓缩,最后大孔吸附树脂进行纯化,证实3种异构体中异绿原酸C含量最高[14]。安晓婷等[19]利用乙醇为溶剂提取滁菊中异绿原酸,选择乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度进行单因素试验,通过响应面试验得到最佳工艺条件为:乙醇体积分数64%、料液比22 mg/g、提取时间90 min、提取温度70 ℃,提取率可达32 mg/g。在实际应用中,可根据物质成分的需要选用适宜的提取方法,来提高异绿原酸的提取率。
2 异绿原酸的吸收代谢
异绿原酸生物学特性的发挥,主要取决于其在动物肠道中的吸收和代谢。异绿原酸的结构并不稳定,分子中酰基容易发生迁移,导致3种异构体之间互相转化。Gong等[20]首次发现了异绿原酸A灌服大鼠后在体内的3种代谢途径,第1条途径主要是异绿原酸及各种异构体发生甲基化、葡糖苷酸偶联及偶联后产物的甲基化和二甲基化;第2条途径是异绿原酸在血浆中最初水解成绿原酸、咖啡酸等含有奎宁酸基团物质,然后甲基化形成3-阿魏酸奎宁酸等物质;第3条途径是异绿原酸完全水解后生成柠檬酸,开始各种代谢反应,如葡萄糖醛酸结合、硫酸盐结合、硫酸盐结合氢化等。目前,对于异绿原酸的研究普遍选择单个物质进行试验,试验动物主要集中在大鼠和小鼠模式动物中。当大鼠摄入绿原酸后,在血浆和尿液中均能检测到其代谢产物咖啡酸及其O-甲基化产物的存在[21]。肠道灌注法可模拟接近正常生理条件下的吸收情况,利用带胆管插管的原位肠灌注大鼠模型试验中发现,灌注酚酸类物质(绿原酸和咖啡酸)至大鼠的回肠和空肠后,通过分析灌注液、胆汁和血浆中的代谢产物,明确咖啡酸和绿原酸的净吸收量分别占灌注量的19.5%和8%,一小部分咖啡酸在肠壁中以阿魏酸的形式代谢(占灌流量的0.5%),而绿原酸在肠道中以咖啡酸的形式出现;肠道黏膜中存在微量酯酶活性,不能完全将酚酸类物质进行代谢,但是在血浆和胆汁中均未检测到绿原酸,仅少量酚酸存在胆汁中,绿原酸在肠道中被消化酶降解,经肠道黏膜对其进行吸收利用[22]。异绿原酸的生物利用度差异可归因于肝脏和肠道中的首次通过效应,研究发现,异绿原酸在大鼠肠道中的生物利用度为30.71%,实际利用度为22.6%,在回肠中异绿原酸的吸收水平最高[23]。
然而,不同的给药途径会导致不同的代谢过程。刘文静等[24]利用液质联用(LC-MS)技术对异绿原酸A的代谢产物类型进行了研究,经口服给药后,在大鼠的血浆、尿液和粪便中共鉴定了39个代谢产物,其中31个来自血浆,34个来自尿液,11个来自粪便,表明在消化道各种代谢酶的作用下,异绿原酸A的机体代谢稳定性较差,易发生水解、甲基化、葡萄糖醛酸化和磺酸化等代谢反应。通过比对文献中色谱峰的保留时间和质谱数据,证实异绿原酸A代谢产物中与绿原酸代谢产物相同的有分子内酰基迁移产物、咖啡酸的甲基化、磺酸化和还原产物、阿魏酸或异阿魏酸磺酸化产物、葡萄糖醛酸化和还原产物、二氢咖啡酸代谢产物、二氢阿魏酸或二氢异阿魏酸代谢产物及3-羟基肉桂酸代谢产物等[24-25]。有研究证实,异绿原酸在肠道的代谢产物中,阿魏酸的吸收要高于咖啡酸[26],可能是由于阿魏酸B环上带有取代羟基因而不易发生葡萄糖醛酸化,同时肠道对二者的氧化程度的敏感度不同导致[27],推测异绿原酸可能因为咖啡酸的O-甲基化提高了其通过肠道屏障的概率。通过对异绿原酸B在大鼠体内的代谢和排泄情况进行研究发现,通过水解、氢化、甲基化及硫酸化等代谢途径,使异绿原酸B进行降解,最终在大鼠粪便中发现18个、尿液中发现3个、血浆中发现1个代谢产物[28]。据此推测,异绿原酸B在机体内的生物利用度较低,原形药物被吸收后会迅速被血浆和肝脏中的酶代谢,导致血浆和尿液中检测到的代谢产物较少,而大部分原形药物在肠道代谢,随粪便排出,因此粪便中检测到的代谢产物较多。利用药代动力学,以静脉注射的方式给予异绿原酸时,30 min后环状代谢产物N1、N2、N4和N5被检测到,而N2易被葡萄糖醛酸酸化形成N6,N3则被代谢形成N8;当以灌胃方式给予异绿原酸时,N6和N8作为主要的循环代谢产物被检测到,这主要由于血浆和肝脏中的酶对异绿原酸快速代谢引起的;此外,在血浆、尿液和粪便及体外肠道微生物群培养系统中可检测到代谢物N5和N9[29](图2)。
图2 静脉注射和灌胃方式小鼠体内异绿原酸的主要代谢产物ICGA:异绿原酸 isochlorogenic acid;Absolute bioavailability:绝对生物利用度;Actual bioavailability:实际生物利用度:Glucuronic acid:葡萄糖醛酸;Hydrolysis:水解;Monocaffeoyl quinic acid:单咖啡酰奎宁酸;Caffeic acid:咖啡酸;Methylation:甲基化;Hydrogenation:氢化作用;Ferulic acid:阿魏酸;m-coumaric acid or its isomers:间香豆酸或其异构体;Glu:谷氨酸Glutamic acid。 Fig.2 Main metabolites of isochlorogenic acid in mice by intravenous injection and gavage[29] |
3 异绿原酸在畜禽生产中的应用
3.1 异绿原酸对畜禽生长性能和饲料转化率的影响
生长性能是直接反映畜禽饲料转化率的重要指标,也是机体对摄入营养成分在体内消化吸收及沉积代谢的最终体现。饲料中添加异绿原酸可提高蛋鸡的产蛋率、蛋壳厚度,提升其生产性能[30]。周思源等[8]在肉鸡饲粮中添加2 000 mg/kg的异绿原酸,结果发现,肉鸡回肠pH显著降低,可能是酸性的环境可增加肠道有益菌的数量,提高粗蛋白质和钙的表观消化率,进而降低料重比。在对反刍动物的研究中发现,异绿原酸可通过调节绵羊瘤胃液中丁酸和总挥发性脂肪酸的浓度,来提高饲粮的干物质降解率,进而提高饲料转化率[10]。众多试验证实,甜叶菊残渣中富含绿原酸、异绿原酸和隐绿原酸等多种酚酸类化合物[31-32],利用甜叶菊残渣中的酚酸类物质可提高畜禽的饲料转化率,增加养殖经济效益[30,33-34]。饲料转化率的提高主要是含异绿原酸的植物提取物可显著增加空肠和回肠绒毛高度和绒毛杯状细胞数量,增强肠道紧密屏障,同时改善肠道微生物群的结构,进而改善动物肠道健康[35]。此外,异绿原酸还可以增加回肠末端微生物属水平上罕见小球菌属(Subdoligranulum)的相对丰度,促进丁酸产生[36],丁酸是肠黏膜细胞的能量来源,可修复受损肠黏膜,增强肠道养分代谢及抗氧化能力,进而提升畜禽的生长性能[37]。
3.2 异绿原酸对畜禽肉品质的影响
目前,在集约化养殖模式下,断奶应激、运输应激、热应激、冷应激等因素均会引发动物的氧化应激反应,造成肉中脂质氧化和蛋白质降解,最终导致肉品质下降[38]。此外,肌肉中较高浓度的不饱和脂肪酸也极易导致氧化损伤的发生[39],表现为肌肉蒸煮损失提高、滴水损失及剪切力增加、pH降低、肉色改变等[40]。杜仲叶绿原酸提取物可通过增强肉鸡肌肉组织中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)和蛋白质羰基含量,进而缓解应激对肉品质的不利影响[41]。研究证实,酚酸类抗氧化剂可通过自身酚羟基提供氢离子来稳定氧自由基,启动细胞的自我修复机制,同时以中和氧化反应中间产物等方式减少氧化损伤对畜禽肉品质的影响[42],亦可通过激活核因子E2相关因子2(Nrf2)通路相关基因表达以提高肌肉抗氧化能力,改善滴水损失、蒸煮损失、pH和肉色,同时调节肌肉中氨基丙二酸、生物酰胺、C5∶1肉碱和N-甲基-α-氨基异丁酸的丰度,以改善氧化应激下的肉品质[43]。另有报道,甜叶菊渣提取物可线性增加生长育肥猪的背最长肌肉质品尝得分[44]。此外,活性氧(ROS)可降低胶原蛋白合成,增加基质金属蛋白酶-2的活性,从而对肉品质产生负面影响,而异绿原酸能消除ROS带来的损伤[4]。综上可知,异绿原酸可通过缓解肌肉中氧化应激损伤,提高畜禽肌肉品质及营养价值。
3.3 异绿原酸对畜禽免疫功能的影响
免疫功能是维持畜禽机体健康的重要指标,一方面可以抵御外界病原体的侵入,另一方面可以应对外界环境变化,维持机体内环境的稳定,提高畜禽生长性能。机体免疫功能的强弱可通过免疫器官指数(胸腺、脾脏和法氏囊指数)来反映。研究显示,饲粮中添加异绿原酸对肉鸡免疫器官指数的影响不显著,但血清中补体3(C3)的含量显著增加,免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的含量亦显著增加[8],IgM通过结合补体,可溶解细菌和血细胞,有中和病毒的功效,而IgG能增强免疫细胞吞噬病原微生物,抑制感染。绿原酸可激活钙调神经磷酸酶介导的信号通路,提高巨噬细胞的吞噬能力,促进B细胞和T细胞增殖分化,进而促机体的免疫功能增强[45]。吴丽飞等[30]报道,甜叶菊异绿原酸盐能提高产蛋后期蛋鸡血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子的含量。也有试验证实,随着甜叶菊提取物添加量的增加,粪便评分曲线高度有下降的趋势,抑制犊牛腹泻的效果更加明显[33]。
此外,异绿原酸还可减少爪的肿胀程度和关节的病理损伤及白细胞介素-17(IL-17)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)炎症途径的激活,提高大鼠的免疫功能及抗炎能力[46]。促炎因子的增加是造成肠上皮细胞屏障损伤的重要原因,其中TNF-α是一种关键的启动因子,核因子-κB(NF-κB)p65主要被促炎信号如TNF-α等激活或靶向激活Toll样受体4(TLR4),从而促进信号转导因子NF-κB p65在炎症通路的传导[47]。反之,TLR4在炎症因子激活过程中也能刺激TNF-α、IL-6等因子的大量分泌[48]。因此,TLR4/NF-κB通路是调节炎症、免疫的关键性途径,绿原酸可抑制TLR4/NF-κB通路信号转导途径,减轻脓毒症大鼠的炎症反应程度及小肠组织氧化应激损伤,进而促进肠道屏障功能改善[49]。
3.4 异绿原酸对畜禽抗氧化能力的影响
抗氧化能力是影响动物机体健康的重要因素。ROS是哺乳动物细胞有氧代谢过程中的产物,在正常情况下,动物机体内的自由基处于不断产生与清除的动态平衡中,当ROS的产生超过抗氧化系统对ROS的清除能力时,就会破坏机体氧化还原稳态,引起氧化应激[50]。Zeng等[51]研究证实,氧化应激可导致幼畜血浆中皮质醇和MDA含量显著增加,空肠抗氧化酶相关基因表达下调,肠道绒毛结构损伤。另外,氧化应激产生的ROS也是慢性肠道炎症发生并加剧的主要因素,破坏线粒体中谷胱甘肽(GSH)与谷胱甘肽二硫化合物(GSSG)的平衡,进而造成线粒体DNA(ntDNA)的损伤,导致肠道细胞上皮损伤,肠道屏障被破坏[52]。异绿原酸被认为是许多植物(菊花、忍冬、甜叶菊等)中存在的主要抗氧化剂[5],但其做为新型的抗氧化植物提取物,在畜禽生产中的应用报道较少,大部分以植物粗提物或残渣进行饲喂效果的验证。例如,饲粮中添加100 mg/kg甜叶菊渣可显著降低断奶仔猪血清中MDA的含量,T-AOC呈线性升高[44]。也有研究表明异绿原酸可以提高血清中SOD和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性,进而抑制氧化应激反应对机体造成的危害[53]。通过体外研究证实,甜叶菊总异绿原酸的抗氧化活性与维生素C相当,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率可以达到90%以上,且优于没食子酸丙酯[54]。另外,甜叶菊醇和水提取物具有清除自由基和铁离子还原能力,通过抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞一氧化氮(NO)释放量,提高其抗炎活性[55-56]。异绿原酸在细胞氧化应激模型中对还原酶表现出剂量效应和抗氧化活性[57],且可提高羟自由基处理的骨髓间充质干细胞(bmMSCs)细胞的生存率,并具有剂量依赖性[58]。以上的体内和体外试验证实,异绿原酸具有做为新型的抗氧化剂在畜禽生产中发挥其生物学功能的巨大潜力。
3.5 异绿原酸对畜禽脂质代谢的影响
脂质代谢在一定程度上可反映机体摄入的营养代谢和健康状况。在应激条件下,甘油三酯、总胆固醇的含量与乙酰辅酶A羧化酶的活性显著降低,肝脏代谢水平改变[59]。研究表明,异绿原酸对肝脏具有积极的保护作用[60-61]。在饲粮中添加200 mg/kg甜叶菊异绿原酸可以显著降低蛋鸡血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量,并显著提高高密度脂蛋白胆固醇含量,但对甘油三酯含量无显著影响[30]。通过脂质代谢紊乱模型也证实,甜叶菊提取物可调节机体脂质代谢,提高营养物质的消化吸收[62]。异绿原酸对大鼠肝细胞胆固醇的合成有显著的抑制作用,对脂质合成的抑制作用呈现剂量依赖性[63],且可显著降低乙醇导致的甘油三酯血症,同时降低大鼠血清和肝脏中甘油三酯的含量[64]。另外,异绿原酸A通过上调脂质氧化相关基因过氧化酶增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化酶增殖物激活受体γ(PPARγ)及其下游靶基因肉碱棕榈酰转移酶-I(CPT-I)、乙酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)的表达及下调脂质合成相关基因的表达进而调节机体的脂质代谢[65]。在断奶仔猪饲粮中添加富含异绿原酸的蒲公英粉可使不饱和脂肪酸(PUFA)含量增加,n-6/n-3 PUFA比例下降,血脂指数和脂肪酸的组成发生改变[66]。综上可知,异绿原酸可影响肝脏脂质代谢相关酶的活性,调节机体脂质代谢。
3.6 异绿原酸对畜禽肠道屏障功能的影响
肠道是动物消化吸收营养成分的重要场所之一,完整的肠道屏障能阻碍内毒素、细菌等进入血液循环,维持肠道健康,促进营养成分的吸收。作为直接接触外来病原体的器官之一,肠道上皮中的免疫细胞持续发挥重要作用。当肠道受到外界或机体应激刺激时,巨噬细胞和中性粒细胞会发生炎性浸润,产生各类促炎因子,进而破坏肠道正常稳态环境[67];同时,免疫细胞则会影响上皮屏障,加剧破坏完整的肠道屏障,导致上皮细胞完整性降低,这也是肠道炎症难以缓解的原因之一[68]。研究证实,来源于菊花茎醇提取物中高浓度的异绿原酸可以很好地缓解肠道炎症,提高机体抗氧化能力[69]。也有研究证实,绿原酸可以通过降低中性粒细胞的浸润,抑制信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)/NF-κB通路来降低炎症因子的表达,进而缓解肠道炎症反应[70]。另外,肠道上皮屏障的完整性与紧密连接蛋白密切相关,其存在于肠道上皮屏障中,能够保障运输生长发育必需的营养物质,同时屏蔽有害的大分子物质对肠道黏膜的损伤,维持肠道上皮通透性[71];异绿原酸可以提高肠道紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的表达,提高改善肠道上皮屏障的完整性来维持肠道健康[36]。当肠道受损后,肠道菌群结构平衡被破坏,各类病菌的入侵会触发肠道微生物种群之间的变化,从而导致肠道功能紊乱,影响正常的消化代谢[72]。外界病菌亦可通过分泌蛋白来影响肠道通透性,使肠道屏障的抵御能力下降,破坏肠道屏障的完整性[73]。研究证实,异绿原酸通过提高肠道中优势菌门厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门的相对丰度,降低有害菌的相对丰度来维持肠道菌群平衡,缓解炎症损伤[30]。
4 小结
在饲料禁抗的大背景下,寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品,制定动物生长性能的替抗策略,成为动物营养学研究的重点和热点。植物提取物异绿原酸具有抗菌、抗炎、抗氧化等功效,可通过增强机体抗氧化酶活性抑制脂质氧化和清除自由基,激活免疫应激因子,降低肠道炎症反应,在畜禽生产中具有巨大的开发潜力。
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