综述

饲料霉菌毒素脱毒剂评价研究进展

  • 张雪怡 , 1, 2 ,
  • 谢刚 2, 3 ,
  • 张晶 1, 4 ,
  • 何贝贝 , 1, 4, *
展开
  • 1 国家粮食和物资储备局科学研究院粮食品质营养研究所,北京 100037
  • 2 武汉轻工大学食品科学与工程学院,武汉 430048
  • 3 国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量检验测试中心,北京 100037
  • 4 国家粮食和物资储备局科学研究院粮油生物技术重点实验室,北京 100037
*何贝贝,副研究员,E-mail:

张雪怡(2000—),女,湖北宜昌人,硕士研究生,从事饲料脱毒剂开发研究。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2024-09-12

  网络出版日期: 2025-03-13

基金资助

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ZX2424)

国家重点研发计划专项(2021YFD1300300)

Research Progress on Evaluation of Mycotoxin Detoxification Agents in Feed

  • ZHANG Xueyi , 1, 2 ,
  • XIE Gang 2, 3 ,
  • ZHANG Jing 1, 4 ,
  • HE Beibei , 1, 4, *
Expand
  • 1 Institute of Grain Quality and Nutrition, Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China
  • 2 School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430048, China
  • 3 Inspection and Testing Center for Grain and Oil Quality, Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China
  • 4 Key Laboratory of Grain and Oil Biotechnology, Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2024-09-12

  Online published: 2025-03-13

摘要

霉菌毒素广泛存在于谷物和饲料中,严重威胁动物生产和人体健康。目前,市面上已开发并应用各种类型的脱毒剂来减轻霉菌毒素的危害。但是,由于缺乏严格的产品标准和完整的评价体系,导致安全性和有效性在实际生产应用中难以保证。因此,本文主要综述了国内外关于饲料霉菌毒素脱毒剂的立法标准及评价方法的研究进展,旨在为饲料霉菌毒素脱毒剂标准评价方法的建立提供参考。

本文引用格式

张雪怡 , 谢刚 , 张晶 , 何贝贝 . 饲料霉菌毒素脱毒剂评价研究进展[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(3) : 1539 -1549 . DOI: 10.12418/CJAN2025.132

Abstract

Mycotoxins are pervasive in grains and feed, posing a significant threat to animal production and human health. Various types of detoxification agents have been developed and applied in the market to mitigate the hazards associated with mycotoxins. However, the lack of strict product standards and complete evaluation systems makes it difficult to ensure safety and effectiveness in practical production applications. This paper reviewed the research progress of legislative standards and evaluation methods for mycotoxin detoxification agents in feed at foreign and domestic, aiming to provide a reference for establishing standard evaluation methods for mycotoxin detoxification agents in feed.

霉菌毒素是一类主要由镰刀菌、青霉菌和曲霉等真菌产生的次级代谢产物,目前已知的种类多达350种,其中玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)是饲粮及原料中最为常见的霉菌毒素。摄入霉菌毒素污染的饲粮不仅会对动物生长和健康造成不利影响,还会通过在动物产品中蓄积威胁到人类健康。我国作为粮食大国,霉菌毒素的污染问题也尤为严重。我国《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)[1]和《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)[2]中分别对食品和饲料中霉菌毒素的安全限量进行了规定。美国食品药品监督管理局(FDA)、美国农业部(USDA)、欧盟等多个国家的相关机构也制定了食品和饲料中霉菌毒素含量的严格标准。
霉菌毒素脱除方法主要有物理法、化学法和生物法,其中生物法主要依赖于微生物细胞壁对毒素的吸附或微生物酶对毒素的降解作用,其因具有高效、安全和绿色环保等优点,已成为解决饲料霉菌毒素污染的主要方法。尽管目前饲料市场中霉菌毒素脱毒剂产品种类丰富,也取得了一定的实际应用效果,但由于我国尚未建立完善的霉菌毒素脱毒剂的评价标准,存在脱毒剂产业规范不统一、产品品质参差不齐等问题,一定程度上限制了产品技术创新和行业发展。因此,本文综述了国内外饲料霉菌毒素脱毒剂的立法和评价标准以及体内外评价方法,以期为饲料霉菌毒素脱毒剂的标准化评价提供参考。

1 饲料霉菌毒素脱毒剂评价标准的建立

针对霉菌毒素吸附剂市场混乱的问题,欧盟食物链和动物健康常务委员会(SCFCAH)于2009年建立了减少饲料中霉菌毒素的新的添加剂品类,并将其命名为“霉菌毒素脱毒剂”。随后在2010—2012年,欧洲食品安全局(EFSA)首次发布《关于制定霉菌毒素脱毒剂评价指南的技术建议》[3],对霉菌毒素脱毒剂的概念做出了明确界定,并对其安全性和有效性研究等方面做出了详细的要求。自2013年以来,欧盟相继批准了3个霉菌毒素脱毒剂产品,即黄曲霉毒素吸附剂双八面体蒙脱石、降解单端孢酶烯族毒素的活菌制剂BBSH 797和降解烟曲霉毒素的纯酶制剂FUMzyme®,并在执行法规文件中对脱毒剂的纯度、吸附效果、有效性和安全性进行了规定和认证。我国仅在《饲料原料目录》[4]中将凹凸棒石(粉)、沸石粉、蒙脱石和膨润土等归入矿物质类原料,并未明确规定该类原料的具体用途。《饲料添加剂品种目录》[5]在微生物类别中规定了饲料中允许添加的35个微生物菌种,酶制剂类别中仅有AFB1分解酶(产自发光假蜜环菌)允许添加到肉鸡和仔猪饲粮中,但并未专门增设霉菌毒素脱毒剂添加剂品种以及制定相关标准。
欧洲食品安全局发布的《关于制定霉菌毒素脱毒剂评价指南的技术建议》中,主要对霉菌毒素脱毒剂的定义与分类、评估原则和方法、稳定性和适用性以及标识与使用条件等进行了规定[3]。该文件将霉菌毒素脱毒剂分为2类,一类是可抑制或减少霉菌毒素吸收或促进排泄的添加剂,另一类是可通过改变毒素化学结构而改变其毒性作用的添加剂;通过作用于机体来缓解毒性的物质不属于此类添加剂。文件中规定,霉菌毒素脱毒剂在作为添加剂使用时应该明确说明适用的霉菌毒素种类及目标动物,以确保能够较大程度发挥作用;同时,还需关注真菌毒素及其代谢产物在动物体内的代谢途径及残留情况,并将排泄物、血液/血浆/血清、组织或产品(牛奶或鸡蛋)中的相关生物标志物的浓度作为脱毒剂有效性的评价终点。
由于霉菌毒素脱毒剂是要在不引入新的有害物质或改变营养价值的前提下有效降低饲料中的霉菌毒素,因此还需要考虑添加剂本身以及作用于体内时是否会存在潜在的风险。根据作用机理的不同,脱毒剂安全性研究的侧重点也不同。有些霉菌毒素脱毒剂会对饲粮中的营养物质产生吸附作用,造成营养物质的损失,特别是通过吸附发挥作用的脱毒剂,应同时评估这类脱毒剂对饲粮营养物质利用的影响。对于通过改变毒素化学结构发挥作用的脱毒剂,应开展毒理学试验评估脱毒剂及其产生的代谢产物或降解产物在靶向动物体内的联合作用,确保转化后产物不会对动物的健康造成不良影响。我国农业农村部在2021年制定印发了《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》[6],其中对可应用于饲料中微生物菌株的鉴定和安全性的评价标准进行了规定。中国饲料工业协会批准发布的团体标准中,《饲料用真菌毒素吸附剂吸附性能的测定方法 体外法》(T/CFIAS 5014—2024)和《饲料用真菌毒素生物降解剂的降解性能测定方法 体外法》(T/CFIAS 5015—2024)分别规定了霉菌毒素吸附剂的吸附性能以及霉菌毒素生物降解剂降解性能的体外测定方法。部分地方标准中规定了饲料中霉菌毒素防控[7]和脱毒技术规范[8],以及霉菌毒素脱毒剂吸附率测定方法[9],但目前还未有专门针对霉菌毒素脱毒剂的评价标准和指南。

2 饲料霉菌毒素脱毒剂的体外评价

2.1 脱毒菌

霉菌毒素脱毒菌主要通过吸附和降解2种方式发挥作用。Keawmanee等[10]从谷物、土壤和伏马毒素发酵液中筛选到5株可脱除伏马毒素的细菌,通过测定培养上清液、细胞悬浮液和细胞内容物对毒素的脱除率发现,其中3株菌仅菌体细胞具有脱毒作用,脱毒率最高为22.13%;1株菌的培养上清液和菌体细胞都具有脱毒作用,细胞悬浮液脱毒率最高为25.80%;另1株菌的菌体细胞和细胞内容物同时具有脱毒作用,细胞内容物脱毒率最高为30.29%,说明不同菌株通过吸附或降解脱毒的机制不同。由于脱毒过程中形成的产物影响其脱毒效率,因此针对不同的脱毒机制,还需对其产物进分析,如吸附形成的毒素-菌体复合物的稳定性以及降解产物的结构与功能。
脱毒菌的吸附作用主要是通过微生物细胞壁中的某些特殊成分或结构吸附霉菌毒素。Hernandez-Mendoza等[11]筛选到5株能够与AFB1结合形成稳定毒素-菌体复合物的乳酸菌,其中罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌的结合能力最强,其脱毒率分别为79%和67%。通过比较细胞壁各组分与AFB1的结合能力发现,肽聚糖和胞壁酸是促进乳酸菌吸附AFB1的关键因素。酵母菌细胞壁中甘露聚糖、葡聚糖等成分构成的网状结构可通过非共价键对毒素产生吸附作用,从而达到脱除毒素的目的[12-13]。Magnoli等[14]分别从饲粮和肉鸡肠道中分离出了9株酵母菌,结果表明,筛选到的酵母菌对AFB1的结合率与菌体细胞的数量呈正相关,且通过采用蒸馏水和缓冲液反复洗涤与毒素结合细胞沉淀物发现,酵母菌和AFB1的结合过程不可逆,可形成稳定的AFB1-酵母菌复合物,因此,酵母菌细胞壁多糖及提取液通常在生产中被普遍用作霉菌毒素吸附剂。
微生物降解霉菌毒素的作用主要是通过微生物产生的酶作用于毒性基团来破坏或改变霉菌毒素结构,从而将毒素转化成毒性更小的物质。Liu等[15]从石油中分离出一种能降解ZEN的枯草芽孢杆菌斯氏亚种B73,研究发现,该菌的细胞上清液对谷物中ZEN的降解率最高为95.6%;通过对比在该菌株各组分对ZEN的降解率发现,细胞上清液对ZEN的降解率最高,且在经过加热和加入蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)处理后降解率下降;进一步通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive-MS)分析发现,B73主要通过产生内酯水解酶将ZEN含氧内酯环C11处的C=O基团转化为2个C—O基团,再断裂形成新的C=O键发生脱羧反应形成毒性较弱的降解产物BP-1,证明B73是通过B73细胞外泌酶发挥降解ZEN的作用。Xiao等[16]从玉米浸泡液中分离出的库德里阿兹威毕赤酵母E4-205对DON降解率为34.9%,且该菌株表现出较好的耐酸性和耐热性;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析该菌株能够在辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)下将DON C8位上的羧基转化为羟基,且降解产物的毒性低于DON;此外,该菌株在灭活后依然能够脱除溶液中的DON,在pH 7.8和30 ℃时吸附容量最大,表明E4-205可同时通过细胞壁吸附和胞内酶降解2种途径来脱除DON。Garai等[17]将红球菌NI1菌株代谢物、单一或组合的霉菌毒素和NI1对霉菌毒素的降解产物注射进斑马鱼胚胎中,通过观察斑马鱼胚胎的死亡率及生长状况来评估红球菌NI1的毒性,结果表明,NI1能够有效的降解单一毒素或AFB1、ZEN、T-2混合毒素,但NI1降解AFB1和T-2混合毒素后所形成的产物比降解前毒素本身对斑马鱼胚胎的毒性作用更大。
在目前的研究中已发现,多种微生物具有降解霉菌毒素的作用,主要包括乳酸菌、酵母菌、红球菌、曲霉菌、芽孢杆菌属及假单胞菌属等,其中枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母和地衣芽孢杆菌等均属于《饲料添加剂品种目录》中允许添加的微生物。曹丽蓉[18]从驴肠道内容物中筛选出的枯草芽孢杆菌ASAG216具有高效降解DON的能力,在孵育8 d后其脱毒率能达到81.8%,并且添加到DON污染的饲粮中能够改善仔猪血清生化指标的异常,缓解DON中毒症状。张杨杨[19]筛选出的解淀粉芽孢杆菌Y1-B1在最优降解条件下对AFB1的脱毒率达到85.96%,添加到饲粮中可减弱AFB1引起的鸡肝癌细胞的毒性和细胞凋亡效应。付冠华[20]筛选的一株地衣芽孢杆菌对ZEN降解率为61.06%,其主要调控雌激素受体的表达,从而有效缓解ZEN对仔猪生殖器官的危害。不过,脱毒菌株存在易退化、降解活性不稳定以及生长条件与畜禽胃肠道环境不匹配等问题,导致其难以投入到实际生产应用中,因此脱毒菌的大规模生产和产业化应用还需要进一步研究。

2.2 脱毒酶

目前常见的脱毒酶主要有氧化还原酶、水解酶和转移酶等,其作用机制是针对毒性基团通过羟基化、糖基化和葡萄糖醛酸化、C=C氢化、去环氧化、甲基化、去甲基化、酯化、酮类和醛类的氧化还原以及水解等反应对霉菌毒素进行降解[21],如UDP-糖基转移酶能够将DON C3上的羟基[22]和ZEN C14和C16上的酚羟基进行糖基化[23];内酯水解酶能够将ZEN和AFB1的内酯环裂解[24];锰过氧化酶能够氧化AFB1呋喃环C8~C9位上的双键,漆酶能够直接氧化黄曲霉毒素的二呋喃环[25]。同时,由于微生物能够产出具有高度专一性的酶且成本较低,因此,脱毒酶的筛选一般会从能够降解霉菌毒素微生物中提取。
脱毒酶的体外评价一般从酶活性测定、毒素残留分析、酶稳定性和降解机制等方面进行。其中酶活性是衡量酶催化效率的重要指标,根据国际生物化学联合会酶学委员会规定,在最适条件下,每1 min转化1 μmol底物所需的酶量为1个酶活单位[26],对于脱毒酶的酶活性一般以霉菌毒素为底物或以其他底物反应来表示,如黄曲霉毒素降解酶BADE的活性以AFB1为底物来表示[27],漆酶活性以每分钟氧化1 μmol 3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)所需的酶量来定义[28]
Luo等[29]研究发现,嗜酸链球菌CW117细胞悬浮液和细胞裂解物对赭曲霉毒素(ochratoxin,OTA)均具有降解活性,在20~40 ℃、pH 6~8时降解率最高,且降解率极易受到铜离子(Cu2+)、锌离子(Zn2+)、蛋白质变性剂、金属螯合剂和蛋白酶的影响;进一步通过LC-MS/MS和全基因组分析得到CW117中分子质量为45.6 ku、等电点为6.9的酰胺水解酶ADH3,该酶能够通过酰胺键水解将OTA降解为赭曲霉毒素α(Otα),当浓度为1.2 μg/mL时能够在90 s内完全降解0.1 μmol/L的OTA。Xu等[27]筛选出的沙氏芽孢杆菌L7在培养3 d后对AFB1、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2,AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1,AFG1)、黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2,AFG2)和黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的降解率分别达到92.1%、84.1%、63.6%、76.1%和90.4%,其上清液在5 d后对AFB1的降解率最高达到90.3%,比活细胞和细胞提取物更能有效降解较高浓度的AFB1,通过二乙氨基乙醇(diethylaminoethanol,DEAE)-琼脂糖离子交换色谱法分离得到黄曲霉毒素降解酶BADE并对其及进行表征,该酶分子质量和酶活性分别为22 ku和3.85×10-3 U/mg[1个酶活性单位(U)定义为在37 ℃下72 h内将AFB1的量减少1 ng所需的酶量],在70 ℃、pH 8.0时表现出较高活性,且降解率受Cu2+、Zn2+、锰离子(Mn2+)的影响。Wang等[30]研究发现,将黑曲霉和糙皮侧耳菌混合培养对AFB1的降解率最高为93.4%,所得到的培养物上清液对AFB1降解的效率高于单菌培养的降解率,表明两者共培养能够促进降解酶的产生从而提升AFB1降解效率,经分析该脱毒酶主要通过内酯环断裂和呋喃环左侧双键2个羟基的增加降解AFB1。Xiang等[31]将枯草芽孢杆菌ZENL09上清液在最优发酵条件下对ZEN的降解率达到88%,通过浓缩过滤得到分子质量为25或66.2 ku的ZEN降解酶,该酶对ZEN的主要降解点在苯环处,且在反应过程中内酯键断裂形成产物结构中含有羰基,进一步通过HepG2细胞评估ZEN及其降解产物的毒性发现,降解ZEN后所形成产物的细胞毒性显著降低。
尽管关于脱毒酶的研究很多,目前市面上在售的脱毒酶种类较少,如百奥明公司的FUMzyme®降解酶是首个得到欧盟批准的霉菌毒素脱毒酶,能够在短时间内通过裂解作用将烟曲霉毒素转化为无毒的羟化烟曲霉毒素,0.5 kg/t的纯酶可以在2.5 min内将30 000 mg/kg的毒素全部降解[32]。不过,脱毒酶存在稳定性较差、生产过程复杂、成本较高以及安全性难以保证等问题,导致大规模生产和应用脱毒酶仍存在问题。

2.3 吸附剂

目前,常用的霉菌毒素吸附剂主要为铝硅酸盐类物质,如蒙脱石、水合铝硅酸钠钙等,由于其具有较大的比表面积,且微孔结构内外存在大量电荷,能交换阳离子形成负电荷吸附中心,从而具有吸附各种阳离子和极性分子的能力[33]。不过,这类物质对具有极性基团的毒素如黄曲霉毒素有较强的吸附能力,而对非极性的毒素如ZEN和DON的吸附率较差[34]。吸附剂的体外评价通常是在特定的温度和pH下,通过吸附前后溶液中毒素含量变化来计算吸脱毒率。由于大多数吸附剂与毒素结合的过程是可逆的,因此还需要在模拟胃肠液中进行毒素吸附-解吸附试验,以评估复合体的稳定性。
Mao等[35]通过酸和十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)处理得到改性蒙脱石,在模拟胃肠液中对AFB1和ZEN吸附率均在97%以上;通过X荧光光谱、热重-差热等方式对其进行表征测量发现,酸处理可使蒙脱石层剥离暴露出更多吸附活性位点,而HTAB的插层导致蒙脱石的层间间距和疏水特性增加,从而使其能够吸附更多的ZEN。Sun等[36]使用不同长度碳链的季铵盐改性累托石,并运用X射线衍射(XRD)和BET(Brunauer-Emmett-Teller)气体吸附法等对改性前后累托石进行表征测量,结果表明,随着改性剂碳链长度的增加,改性累托石层间距也随之增大,为吸附霉菌毒素提供了更多的位点,且改性剂的增加使更多的季铵盐分子进入累托石基间距,增强了其疏水性,从而提高了对非极性和弱极性霉菌毒素的吸附能力。Ying等[37]以大豆渣为原料制作出了一种新型生物碳吸附剂SDB-6-X[其中X分别为活化剂氢氧化钾(KOH)、碳酸钾(K2CO3)和碳酸氢钾(KHCO3)],通过扫描电镜-能谱(SEM-EDS)仪、XRD对其进行表征测量发现,SDB-6-KOH具有丰富的微孔结构和含氧官能团,且在吸附剂量为1.0 mg/mL、初始DON浓度为60 μg/mL、pH为7、温度为308 K(34.85 ℃)、接触时间为3 h时吸附效果最好。

2.4 体外评价模型

霉菌毒素脱毒剂的体外评价通常会先将一定量的脱毒剂加入毒素标准液中对其脱毒效果进行初步的筛选,但由于脱毒效果受多种因素的影响,与实际情况存在显著差异,因此还需要通过建立体外消化模型来模拟体内环境,对霉菌毒素脱毒剂的实际降解效果进行评估。体外消化模型分为静态和动态2种类型,其中静态消化模型是应用最广泛的体外模型,根据模拟的消化阶段可以分为胃或肠单隔室模型,也可以分为口腔、胃、小肠在内的多隔室模型。但由于这种模型简化了消化过程,并且温度、pH等模拟参数较为固定,忽略了实际胃肠道中的动态变化[38],因此可能与实际结果差异较大。相比之下,动态消化模型则能够清楚的模拟出胃排空、肠道蠕动等生理过程,能更真实地反映体内的消化过程。
Solís-Cruz等[39]通过家禽体外消化模型来评估壳聚糖与纤维素聚合物对霉菌毒素的吸附能力,首先将霉菌毒素污染的饲料与聚合物在40 ℃、pH 5.2的缓冲液中孵育30 min,加入胃蛋白酶在40 ℃、pH 1.4~2.0下孵育45 min模拟胃消化,随后加入胰蛋白酶在pH 6.4~6.8下孵育2 h模拟小肠消化,并在消化结束后采用非竞争性化学发光分析来计算聚合物对毒素的吸附量。Prapapanpong等[40]分别采用不同pH的缓冲液来模拟猪和禽类的口腔及胃肠道环境,用以评估吸附剂对ZEN、AFB1和DON的吸附效果及其复合物的吸附和解吸附稳定性。Debevere等[41]建立了体外瘤胃发酵模型,研究表明,与干奶期的奶牛相比,泌乳期奶牛的瘤胃微生物短链脂肪酸的产量更高,且在正常pH环境中对霉菌毒素的降解率更高。

3 饲料霉菌毒素脱毒剂的体内评价

3.1 霉菌毒素在动物体内代谢评价

由于动物体内环境复杂,与体外试验条件存在差异,因此可能导致霉菌毒素脱毒剂的脱毒效果不同。为了能够评估霉菌毒素脱毒剂在实际生产中的有效性,需要通过动物体内试验来验证。但受污染的饲料中往往同时存在多种霉菌毒素导致毒素的毒性之间产生协同或拮抗作用,且由于不同种类的动物对不同毒素的敏感性不同,使得同一脱毒剂对不同动物的脱毒效果存在差异[42]。欧洲食品安全局提出了AFB1、DON、ZEN相关的暴露生物标志物,如牛奶/蛋黄中的AFM1、血浆中的DON及代谢产物[3],但由于不同种类靶向动物之间存在代谢途径的差异,因此生物标志物并不是一样的。例如,ZEN在体内的主要代谢产物为α-玉米赤霉烯醇(zearalenol,ZEL)和β-ZEL,其中α-ZEL主要是在人类、猪和小鼠中存在较多,而β-ZEL在反刍动物和家禽中较为丰富[43]。Lauwers等[44]通过在猪和肉鸡饲粮中添加霉菌毒素混合物和脱毒剂,并测定粪便、尿液及血液中毒素及代谢产物的含量来筛选不同毒素适宜的生物标志物,结果发现肉鸡血浆中的DON-3α-硫酸盐(DON-3α-sulphate,DON-S)、排泄物中的AFB1、OTA、DON及ZEN为最优的生物标志物,而猪血液中的DON-葡糖苷酸(glucuronide,GlcA)、尿液中的DON、血浆和尿液中的ZEN-Glc以及粪便中的ZEN为最适宜的标志物。饲料中常见霉菌毒素在动物体及动物产品中的生物标志物见表1[45]
表1 饲料中常见霉菌毒素在动物体及动物产品中的生物标志物

Table 1 Biomarkers of common feed mycotoxins in animals and products[45]

霉菌毒素种类
Types of mycotoxins
主要生物标志物
Main biomarkers
动物种类
Animal species
来源
Sources
呕吐毒素
Deoxynivalenol
呕吐毒素-15-葡糖苷酸 尿液
呕吐毒素-15-硫酸盐 大鼠 尿液
呕吐毒素-3-葡糖苷酸 尿液
呕吐毒素-3-硫酸盐 鸡、人、火鸡 尿液
去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇 大鼠、奶牛、猪、人 尿液、粪便
黄曲霉毒素
Aflatoxin
黄曲霉毒素-白蛋白 人、大鼠 血浆
黄曲霉毒素B1-赖氨酸 人、猪、大鼠 血浆
黄曲霉毒素-N7-鸟嘌呤 人、大鼠 尿液、粪便
黄曲霉毒素Q1 人、大鼠 尿液、粪便
黄曲霉毒素P1 人、羊 尿液、粪便
黄曲霉毒素M1 牛、驴、山羊
人、山羊 粪便、尿液
玉米赤霉烯酮
Zearalenone
α-玉米赤霉烯醇/β-玉米赤霉烯醇 大鼠、猪、人、羊、牛、鸡 尿液
玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖醛酸苷 大鼠、山羊、牛、人、猪、鸡 粪便、尿液
15-羟基-玉米赤霉烯酮 大鼠、鸡、山羊、牛、猪、人 尿液
霉菌毒素的代谢过程涉及肠道、肝脏和肾脏等多个器官[46],但不同的动物对同一毒素在不同组织器官的代谢途径不同。如AFB1进入禽体内会被肝脏微粒体代谢产生致癌物质AFB1-8,9-环氧化物或通过胞质部分代谢产生黄曲霉毒素醇(aflatoxicol,AFL),不同禽类如火鸡、鹌鹑、肉鸡和鸭肝脏微粒体和胞质AFB1代谢产物的产生量不同,可能是造成不同家禽对AFB1敏感性差异的原因[47]。对于反刍动物来说,摄入的AFB1会部分被瘤胃微生物转化为AFL,其余毒素会在消化道吸收并扩散至肝脏形成AFM1[48]

3.2 动物体内耐受性评价

霉菌毒素脱毒剂对动物的耐受性试验是评估脱毒剂安全性及确定添加量的重要步骤。欧洲食品安全局指出,试验前须确认试验动物种类和饲养条件,然后需要根据脱毒剂浓度或种类设置对照组、有效剂量组和耐受组;一般来说,有效剂量组的受试剂量应该选用最高限量或最高推荐量,但若没有相关规定,则可根据目标动物的自身特性选择最低推荐剂量的2~5倍作为有效剂量,在此基础上耐受组的受试剂量则是以有效剂量组的10倍水平进行;而耐受性试验持续时间需根据动物种类和类别来设置,如哺乳仔猪的耐受性试验应在出生后14 d到断奶期间开展,蛋鸡耐受性试验应在产蛋前期进行[49]。不同动物耐受试验期见表2[49]
表2 不同动物耐受试验期

Table 2 Tolerance test period of different animals[49]

动物类别
Animal types
试验周期Test period 最短试验时间
Minimum test
duration/d
预试期
Pre-test
period/d
起始
Start
结束
End
结束体重
Final weight/kg
哺乳仔猪Suckling piglets 1日龄 21~42日龄 6~11 14
>3
断奶仔猪Weaned piglets 21~42日龄 120日龄 35 42
育肥猪Fattening pigs ≤35 kg 120~250日龄 80~150 42 >5
肉鸡Broilers 1日龄 35日龄 35 3
蛋鸡Layers 16~21周龄 13或18月龄 56 7
育肥牛Fattening cattle 瘤胃发育完全 10~36月龄 350~700 42
15
育肥犊牛Fattening calves 1日龄 6月龄 180或250 28
犊牛Calves 1日龄或体重为60~80 kg 4月龄 145 42 7
此外,试验期间还需要监测动物体重、采食量、死亡率、血液生化指标以及内脏等组织器官的变化等指标来评估耐受性,如果需要测定脱毒剂对产奶和产蛋性能的影响,还需采集牛奶和鸡蛋样品测定相关指标。Nasiri等[50]开发了一种复合生物毒素脱毒剂,添加到AFB1污染饲粮中能显著缓解蛋鸡体重的下降和肝脏损伤,同时能提高蛋鸡肝脏蛋白质代谢并减少肝脏和血清中有害物质含量。Holanda等[51]使用含膨润土、海藻、酶和酵母的复合脱毒剂评估其对采食DON污染饲粮断奶仔猪的影响发现,该脱毒剂能够有效改善DON引起的断奶仔猪肝脏损伤以及血糖水平变化。

3.3 组织及产品中的残留评价

反刍动物肝脏中存在的细胞色素P450酶能将AFB1代谢转化为AFM1,并可通过尿液及乳汁排出,采食AFB1污染的饲粮可在牛奶中检测到AFB1及其代谢产物AFM1的残留,因此各国对牛奶中AFM1的含量进行了严格的限值标准[52]。Britzi等[53]分别给泌乳中期和晚期的奶牛喂食AFB1污染的饲粮,测定发现泌乳中期和晚期生产的牛奶中AFM1的转化率分别为5.8%和2.5%,AFM1的残留量随牛奶产量增加呈指数增长。Zhu等[54]给蛋鸡饲喂含有多种毒素污染的发霉玉米发现,随着发霉玉米添加比例的提高,蛋鸡产蛋率和蛋品质显著降低,且鸡蛋中AFB1和ZEN的残留量随发霉玉米饲喂时间的增加而提高,同时在蛋鸡的肌肉和肝脏中也检测到了AFB1和ZEN残留。因此,对于脱毒剂的有效性评估还需要测定动物组织及产品中的毒素残留。Jia等[55]研究表明,ZEN和黄曲霉毒素对蛋鸡产蛋量和采食量的影响存在协同作用,在鸡蛋中可同时检测到AFB1、AFB2和AFM1的残留,且在停止添加毒素后,仍能对蛋鸡造成持续的毒性影响,而在添加枯草芽孢杆菌后能有效改善ZEN和黄曲霉毒素引起的负面影响。Intanoo等[56]将3株可脱除AFB1的酵母菌添加到饲粮中,结果表明,酵母菌能有效改善奶牛的生产性能,并减少牛奶中AFM1的残留,提高牛奶总固形物、蛋白质和乳糖含量。

4 小结与展望

霉菌毒素在动物饲粮及原料中普遍存在,不仅严重危害动物和人类健康,还会造成巨大的经济损失。控制和降低霉菌毒素带来的不利影响是饲料及养殖业长期以来的重要目标之一,目前最有效和最广为使用的方法就是在饲粮中添加霉菌毒素脱毒剂。但由于我国尚未针对霉菌毒素脱毒剂设立专门的添加剂条目类别,且缺乏完整的评价标准体系,导致脱毒剂产品在实际应用中无法确保其安全性和有效性。因此,应尽快建立和完善霉菌毒素脱毒剂评价标准体系,提供针对不同种类霉菌毒素有效性和安全性的体内和体外评价方法;同时,通过立法对霉菌毒素脱毒剂进行明确的定义和分类,规定适用动物的类别、饲养阶段以及各阶段添加量等,并制定相关的政策法规,支持和促进生物脱毒技术研究及应用技术的发展。
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