动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 4: 2441 - 2453

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.207

研究论文

植物提取物与酿酒酵母发酵饲料筛选及其对奶牛瘤胃体外发酵的影响

  • 吴薛 , 1 ,
  • 王思雨 2 ,
  • 田娇娇 1 ,
  • 运立媛 2, 3 ,
  • 田雨佳 , 1, * ,
  • 张民 , 2, 3, * ,
  • 陈雅芝 2
展开
  • 1 天津农学院动物科学与动物医学学院,天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300392
  • 2 天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300392
  • 3 农业农村部智慧养殖重点实验室,天津 300392
* 田雨佳,副教授,硕士生导师,E-mail: ;张 民,教授,博士生导师,E-mail:

吴 薛(1999—),女,河北保定人,硕士研究生,研究方向为动物性食品生产与安全。E-mail:

Copy editor: 田艳明

收稿日期: 2024-09-10

  网络出版日期: 2025-04-15

基金资助

天津市教委科研计划项目(2023KJ011)

收起

Screening of Plant Extracts and Saccharomyces cerevisiae Fermented Feed and Its Effects on Rumen Fermentation in Vitro of Dairy Cows

  • WU Xue , 1 ,
  • WANG Siyu 2 ,
  • TIAN Jiaojiao 1 ,
  • YUN Liyuan 2, 3 ,
  • TIAN Yujia , 1, * ,
  • ZHANG Min , 2, 3, * ,
  • CHEN Yazhi 2
Expand
  • 1 Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China
  • 2 School of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China
  • 3 Key Laboratory of Smart Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin 300392, China
* TIAN Yujia, associate professor, E-mail: ; ZHANG Min, professor, E-mail:

Received date: 2024-09-10

  Online published: 2025-04-15

Fold

摘要

本试验选用酿酒酵母作为发酵菌种,同时添加不同植物提取物对混合饲料进行发酵,旨在筛选出酿酒酵母与植物提取物的适宜组合,并探究该发酵饲料对奶牛瘤胃体外发酵的影响。试验采用4×5双因素设计,设置无植物提取物添加组(E1组)、添加250 mg/kg迷迭香提取物组(E2组)、添加250 mg/kg百里香提取物组(E3组)和添加187.5 mg/kg迷迭香提取物+62.5 mg/kg百里香提取物组(E4组),每组分别添加0(对照)、103、104、105和106 CFU/mL酿酒酵母(依次为S1、S2、S3、S4和S5处理),经密封室温并发酵15 d后,对常规营养成分及发酵指标进行检测。发酵饲料筛选结束后,采用单因素完全随机试验设计,设置发酵饲料组(对照组,CON组)、植物提取物添加组(E组)、酿酒酵母添加组(S组)和植物提取物与酿酒酵母添加最优组(ES组),进行48 h奶牛瘤胃体外发酵试验。结果表明: 1)添加不同种类植物提取物可以降低发酵饲料干物质的损失,添加酿酒酵母可以提高发酵饲料粗蛋白质含量,且两者有助于降解发酵饲料中的纤维素。2)添加不同种类植物提取物可以降低发酵饲料中霉菌菌落数,其中百里香提取物的抑制效果优于迷迭香提取物,且与酿酒酵母同时添加对抑制霉菌具有协同作用;添加适宜剂量酿酒酵母可以提高乳酸含量,同时降低氨态氮含量;添加不同种类植物提取物和适宜剂量酿酒酵母可以提高乙酸含量,同时降低丁酸含量。3)采用隶属函数法对发酵效果进行综合评价得出,E2组S3处理发酵效果最佳。4)在瘤胃体外发酵试验中,S组体外干物质消化率(IVDMD)显著高于其他组(P<0.05),ES组IVDMD显著高于CON组和E组(P<0.05);E组和ES组乙酸含量显著高于CON组和S组(P<0.05),且S组乙酸含量显著高于CON组(P<0.05);各试验组丙酸和异丁酸含量显著高于CON组(P<0.05),且ES组丙酸含量显著高于E组和S组(P<0.05);E组和ES组总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著高于CON组和S组(P<0.05)。综上所述,当添加250 mg/kg迷迭香提取物且酿酒酵母添加量为104 CFU/mL时,混合饲料发酵效果最佳;该发酵饲料在瘤胃体外发酵展现出优异的干物质消化性能,同时在发酵过程产生较多的挥发性脂肪酸。

关键词： 酿酒酵母; 植物提取物; 混合发酵; 瘤胃体外发酵

本文引用格式

吴薛 , 王思雨 , 田娇娇 , 运立媛 , 田雨佳 , 张民 , 陈雅芝 . 植物提取物与酿酒酵母发酵饲料筛选及其对奶牛瘤胃体外发酵的影响[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(4) : 2441 -2453 . DOI: 10.12418/CJAN2025.207

Abstract

In this experiment, Saccharomyces cerevisiae was selected as fermentation strain, and different plant extracts were added to the mixed feed for fermentation, aiming to screen out the suitable combination of Saccharomyces cerevisiae and plant extracts, and explore the effects of the fermented feed on rumen fermentation in vitro of dairy cows. The experiment adopted a 4×5 two-factor design, setting up a group without plant extract addition (E1 group), a group with 250 mg/kg rosemary extract (E2 group), a group with 250 mg/kg thyme extract (E3 group), and a group with 187.5 mg/kg rosemary extract+62.5 mg/kg thyme extract (E4 group), each group was added with 0 (control), 103, 104, 105 and 106 CFU/mL of Saccharomyces cerevisiae (S1, S2, S3, S4 and S5 treatments in sequence), sealed at room temperature and fermented for 15 days, and then the conventional nutritional components and fermentation indices were detected. After the fermented feed screening, a single factor completely randomized experiment design was used to set up fermented feed group (control group, CON group), plant extract addition group (E group), Saccharomyces cerevisiae addition group (S group) and the optimal plant extract and Saccharomyces cerevisiae addition group (ES group) for 48 h rumen fermentation in vitro of dairy cows. The results showed as follows: 1) adding different kinds of plant extracts could reduce the dry matter loss of fermented feed, adding Saccharomyces cerevisiae could increase the crude protein content in fermented feed, and both could help degrade the cellulose in fermented feed. 2) Adding different kinds of plant extracts could reduce the number of mold colonies in fermented feed, among which thyme extract had a better inhibitory effect than rosemary extract, and the simultaneous addition of Saccharomyces cerevisiae had a synergistic effect on the inhibition of mold; the suitable dosage of Saccharomyces cerevisiae could increase the lactic acid content and decrease the ammonia nitrogen content; adding different kinds of plant extracts and appropriate dosage of Saccharomyces cerevisiae could increase the acetate content and decrease the butyrate content. 3) The membership function method was used to comprehensively evaluate the fermentation effect, and it was concluded that the fermentation effect of S3 treatment in E2 group was the best. 4) In vitro rumen fermentation test, the in vitro dry matter digestibility (IVDMD) in S group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05), and the IVDMD in ES group was significantly higher than that in CON and E groups (P<0.05); the acetate content in E and ES groups was significantly higher than that in CON and S groups (P<0.05), and the acetate content in S group was significantly higher than that in CON group (P<0.05); the contents of propionate and iso-butyrate in experimental groups were significantly higher than those in CON group (P<0.05), and the propionate content in ES group was significantly higher than that in E and S groups (P<0.05); the total volatile fatty acid (TVFA) content in E and ES groups was significantly higher than that in CON and S groups (P<0.05). In conclusion, when 250 mg/kg rosemary extract and 104 CFU/mL Saccharomyces cerevisiae are added, the fermentation effect of mixed feed is the best. The fermented feed shows excellent dry matter digestion and can produce more volatile fatty acids in rumen fermentation in vitro.

Key words： Saccharomyces cerevisiae; plant extract; mixed fermentation; rumen fermentation in vitro

安全健康的天然植物提取物如迷迭香提取物、百里香提取物等,在早期研究中被指出对于动物生长性能以及免疫力的提升有较好的效果[1-2]。迷迭香提取物展现出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多类细菌的显著抑制效果[3],且对于动物机体炎症控制以及抗氧化状态改善有促进作用[4]。而百里香提取物中含有的百里香多酚也具有抗菌、抗氧化等功效[5]。在进入饲料“无抗时代”的今天,通过改变动物机体内生命活动来提高动物健康状况势在必行。酿酒酵母作为发酵饲料常用菌种,在发酵过程中产生的多糖及其他营养物质对于反刍动物的抗病能力以及肉品质和产奶量的提升具有显著的影响[6]。
本试验选用酿酒酵母作为发酵菌种,同时添加迷迭香提取物和百里香提取物对混合饲料进行发酵,旨在筛选出酿酒酵母与植物提取物的适宜组合,并探究该发酵饲料对奶牛瘤胃体外发酵的影响,为调节动物机体健康及农副产品资源和植物提取物的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 饲料准备

饲料原料及配方由新疆天牧生物科技有限公司提供,其组成见表1;迷迭香和百里香提取物由天津农学院食品科学学院食品加工与安全课题组通过乙醇回流浸提提取工艺获得,植物提取物添加量采取前期抑菌试验最佳结果用量。
表1 饲料组成

Table 1 Feed composition %

原料Ingredients 含量Content
玉米秸秆Corn stalk 27
棉叶Cotton leaf 9
棉籽粕Cottonseed meal 2
玉米芯Corncob 3
辣椒粕Pepper meal 4
糖蜜Molasses 3
水Water 52
合计Total 100

1.1.2 酿酒酵母菌液制备

选取本实验室筛选保存的酿酒酵母菌种进行培养,从生长良好的单个菌落中挑选1株酿酒酵母,培养于YM液体培养基中,在生化培养箱中28 ℃培养24 h,计数备用。

1.2 试验设计

本试验采用4×5双因素设计,设置无植物提取物添加组(E1组)、添加250 mg/kg迷迭香提取物组(E2组)、添加250 mg/kg百里香提取物组(E3组)和添加187.5 mg/kg迷迭香提取物+62.5 mg/kg百里香提取物组(迷迭香提取物∶百里香提取物=3∶1,E4组)4个植物提取物组;酿酒酵母新鲜培养液使用无菌水稀释为0(对照)、103、104、105和106 CFU/mL(依次为S1、S2、S3、S4和S5处理),并分别向混合饲料中均匀喷洒占总量0.2%的各浓度梯度的酿酒酵母菌液;每个处理3个重复,压紧密封(压实密度为650 kg/m3),于室温避光发酵,15 d后进行指标测定。
发酵饲料筛选结束后,采用单因素完全随机试验设计,设置发酵饲料组(对照组,CON组)、植物提取物添加组(E组)、酿酒酵母添加组(S组)和植物提取物与酿酒酵母添加最优组(ES组),进行奶牛瘤胃体外发酵试验,每组3个重复;48 h后对瘤胃发酵指标进行测定。

1.3 样品收集及指标测定

发酵15 d后,采用四分法均匀取样,准确称取10 g发酵饲料样品放入锥形瓶中,加入90 mL无菌蒸馏水,使用封口膜封口后,4 ℃环境下浸提24 h,浸提液放入-20 ℃冰箱保存,对霉菌菌落和发酵品质进行测定。将该混合发酵饲料置于65 ℃的烘箱中进行烘干处理,直至其达到恒重状态。对烘干后的物质进行粉碎,并通过40目筛网进行筛分,对发酵饲料营养成分进行测定。
参照Menke等[7]的方法进行体外瘤胃发酵试验,晨饲前使用瘤胃液采集器经口腔采集10头奶牛瘤胃液,过滤后与人工唾液以1∶2的比例混合后进行体外瘤胃发酵试验,48 h后冰浴终止发酵,对瘤胃液及发酵残渣进行指标测定。动物试验涉及的伦理规范已通过天津农学院动物福利和动物试验伦理审核批准(批准编号:2024LLSC24)。

1.3.1 混合发酵饲料常规营养成分测定

参考GB/T 6435—2014测定干物质(DM)含量;采用凯氏定氮仪(FOSS,美国),参考GB/T 6432—2018测定粗蛋白质(CP)含量;采用全自动纤维分析仪(ANKOM,美国),参照GB/T 20806—2006测定中性洗涤纤维(NDF)含量,参照NY/T 1459—2007测定酸性洗涤纤维(ADF)含量。

1.3.2 混合发酵饲料发酵品质测定

饲料浸提液被分别应用于测定其pH、乳酸含量、氨态氮(NH3-N)含量、霉菌菌落数以及挥发性脂肪酸含量。采用pH计(PHSJ-3F)测定pH;采用乳酸测定试剂盒(A019-2-1型,南京建成生物工程研究所)乳酸脱氢酶法测定乳酸含量;采用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N含量。量取1 mL浸提液于9 mL无菌水中,均质2 min,以10倍稀释法稀释均质后的样液到适宜浓度,吸取1 mL样液于PDA固体培养基中涂布均匀,于28 ℃恒温培养箱中培养48 h后进行霉菌菌落计数。将饲料浸提液4 ℃离心(12 000×g、10 min)后,将1.5 mL的离心管中加入1.0 mL饲料浸提上清液,同时加入0.20 mL的25%偏磷酸溶液,使其充分混合均匀,混合液静置30 min,以便充分反应;对混合液进行离心处理(4 ℃、12 000×g、15 min),使用1 mL的注射器小心吸取离心后的上清液,并通过0.22 μm的滤膜进行过滤,以去除杂质;将过滤后的上清液供给气相色谱仪(Agilent-7890A,美国)进行分析,以测定其中的挥发性脂肪酸含量。

1.3.3 体外瘤胃发酵指标测定

体外瘤胃发酵结束后,瘤胃发酵液pH采用pH计(PHSJ-3F)进行测定;采用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N含量;采用尼龙袋收集残渣65 ℃烘48 h,测定体外干物质消化率(IVDMD);采用气相色谱仪(Agilent-7890A,美国)测定挥发性脂肪酸含量。

1.4 数据处理

混合发酵饲料筛选试验数据采用SAS 9.4进行双因素方差分析和Duncan氏多重比较;体外瘤胃发酵试验数据采用SAS 9.4中的一般线性模型(GLM)进行单因素方差分析,并采用Duncan氏多重比较法进行分析。P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。
采用模糊数学隶属函数法对多个指标进行数据分析,与饲料发酵品质呈正相关的指标(DM、CP、乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸)使用公式(1)计算其隶属值;与饲料发酵呈负相关的指标(NDF、ADF、霉菌菌落数、NH3-N、pH、丁酸)使用公式(2)计算其隶属值;使用公式(3)计算各指标隶属值的平均值。相关计算公式如下[8]:
UX(+)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin);
UX(-)=1-UX(+);
D=( ∑ i = 1 nUx)/n。
式中:X为各指标测定值;Ximin表示该指标在样品中的下限值;Ximax表示该指标在样品中的上限值;UX(+)为正隶属函数;UX(-)为反隶属函数。

2 结果与分析

2.1 混合发酵饲料常规营养成分含量

由表2可知,添加不同种类植物提取物对发酵饲料DM、CP、NDF和ADF含量有极显著影响(P<0.01)。其中,E4组发酵饲料NDF和ADF含量较低,分别为46.31%~52.89%和32.19%~35.10%;DM含量较高,为42.20%~44.72%,营养价值较高。E1组则与E4组相反,其NDF和ADF含量较高,DM含量较低,营养价值较低;E2和E3组营养价值居中。各植物提取物组间CP含量存在差异,但波动幅度较小。
表2 混合发酵饲料常规营养成分含量

Table 2 Conventional nutrient contents in mixed fermented feed

项目
Items		 干物质
DM/%		 粗蛋白质
CP/% DM		 中性洗涤纤维
NDF/% DM		 酸性洗涤纤维
ADF/% DM
组别Groups 处理Treatments
E1 S1 43.64abcde 10.24gh 54.30a 31.51gh
S2 41.20i 11.60de 54.32a 35.20bcd
S3 43.74abcde 12.40a 53.60ab 35.64abc
S4 41.86ghi 11.09f 53.11ab 34.85bcde
S5 42.44efghi 12.20ab 53.21ab 34.24bcde
E2 S1 44.01abcd 10.95f 51.44ab 30.76h
S2 41.22i 11.64d 55.04a 35.40abc
S3 43.05cdefg 11.78cd 55.88a 35.27ab
S4 42.83defgh 9.92h 56.48a 34.75bcde
S5 43.29bcdefg 10.36g 56.33a 34.85bcde
E3 S1 43.46bcdef 11.23ef 55.57a 33.15efg
S2 41.65hi 11.85bcd 54.98a 35.68abc
S3 44.89a 12.47a 52.48ab 34.19cde
S4 42.35efghi 12.14abc 53.78ab 36.00a
S5 44.26abc 12.28a 51.06ab 33.30ef
E4 S1 44.72ab 10.95f 52.89ab 32.19fgh
S2 43.30bcdefg 11.59de 46.31b 33.40ef
S3 43.18bcdefg 12.44a 52.83ab 35.10bcd
S4 42.20fghi 12.39a 50.71ab 33.92cdef
S5 43.05efghi 12.36a 51.88ab 34.07bcdef
SEM 0.27 0.07 1.50 0.34
P值P-value E <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
S <0.01 <0.01 0.86 <0.01
E×S <0.01 <0.01 0.03 <0.01

表中数据用平均值表示,SEM为均值标准误,同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05);“E”表示不同种类植物提取物,“S”表示酿酒酵母不同添加量,“E×S”表示植物提取物与酿酒酵母的交互作用;ND表示未检出。表3和表4同。

Data in the table were represented by mean value, SEM was standard error of mean value, and values in the same column with different letter superscripts indicated significant differences (P<0.05); “E” represented different types of plant extracts, “S” represented different amounts of Saccharomyces cerevisiae added, and “E×S” represented the interaction between plant extract and Saccharomyces cerevisiae; ND mean not detected. The same as Table 3 and Table 4.

酿酒酵母不同添加量对发酵饲料DM、CP和ADF含量有极显著影响(P<0.01)。总体来看,S3处理CP和DM含量较高,分别为11.78%~12.47%和43.05%~44.89%;ADF含量居中,营养价值较高。S2处理CP和DM含量较低,分别为11.6%~11.85%和41.20%~43.30%;ADF含量较高,营养价值较低。S1、S4和S5处理各指标在以上2个处理之间浮动,营养价值居中。
植物提取物与酿酒酵母的交互作用对发酵饲料DM、CP、NDF和ADF含量有显著影响(P<0.05)。综合各项营养成分含量结果得出,E3组S3和S5处理CP和DM含量相比其他处理较高,且NDF和ADF含量相比其他处理较低,因此其营养价值较高。

2.2 混合发酵饲料发酵品质

2.2.1 混合发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数

由表3可知,添加不同种类植物提取物对发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数有极显著影响(P<0.01)。不同植物提取物组间pH有一定差异,但波动幅度较小;各植物提取物组均有霉菌菌落检出,但与E1组相比,其他组均有所减少,其中E3组降低最明显;各指标中,E3组乳酸含量较高,但NH3-N含量也较高;E2组乳酸含量居中,NH3-N含量较低。植物提取物发酵较优组需进一步分析。
表3 混合发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数

Table 3 pH, contents of lactic acid and NH3-N and mold colony number in mixed fermented feed

项目
Items		 pH 乳酸
Lactic acid/
(mmol/L)		 氨态氮
NH3-N/
(mg/dL)		 霉菌菌落数
Mold colony number/
(×104 CFU/mL)
组别Groups 处理Treatments
E1 S1 4.78abc 1.35i 3.21abc 56.33a
S2 4.63abc 5.92c 3.31ab 14.60b
S3 4.51abc 5.86c 2.93def ND
S4 4.37bc 6.62b 2.95cdef ND
S5 4.78abc 3.47g 3.17abcd ND
E2 S1 4.82abc 1.12i 3.18abcd 53.33a
S2 4.97abc 6.06c 3.41a 0.33b
S3 4.32c 6.93b 2.25g ND
S4 4.63abc 5.41de 3.31ab ND
S5 4.31c 4.28f 3.13bcd ND
E3 S1 5.06abc 1.40hi 3.13bcd 2.00b
S2 4.88abc 5.06e 3.41a 0.33b
S3 4.99abc 7.55a 3.20abc ND
S4 5.16ab 3.20g 2.77f ND
S5 4.67abc 5.12e 2.84ef ND
E4 S1 5.30a 1.77h 3.08bcde 14.60b
S2 4.35c 3.38g 3.29ab 1.33b
S3 4.38c 5.72cd 3.29ab ND
S4 4.58abc 5.86c 2.98cdef ND
S5 4.70abc 3.56g 3.20abc ND
SEM 0.14 0.07 0.05 3.77
P值P-value E <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
S <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
E×S <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
酿酒酵母不同添加量对发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数有极显著影响(P<0.01)。不同酿酒酵母处理pH有一定差异,但波动幅度较小;S3处理乳酸含量较高,NH3-N含量较低,且未检出霉菌菌落,因此S3处理发酵品质较优;S1处理乳酸含量较低,NH3-N含量居中,但均有霉菌菌落检出,因此S1处理发酵品质较差。
植物提取物与酿酒酵母的交互作用对发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数有极显著影响(P<0.01)。综合各项发酵品质指标可以看出,E1组S1处理和E2组S1处理乳酸含量较低,NH3-N含量较高,且均检出霉菌菌落,发酵品质较差;E1组S4处理和E2组S3处理相较于其他处理,乳酸含量较高,NH3-N含量较低,均未检出霉菌菌落,发酵品质较优。

2.2.2 混合发酵饲料挥发性脂肪酸含量

由表4可知,添加不同种类植物提取物对发酵饲料乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸含量有显著影响(P<0.05)。不同植物提取物组异戊酸和戊酸含量有一定差异,但波动幅度较小;与其他植物提取物组相比,E2组乙酸和丙酸含量较高,分别为12.70%~23.59%和3.15%~3.84%,丁酸含量较低,总体发酵品质较好;而E1组乙酸和丙酸含量较低,丁酸含量较高,总体发酵品质较差;E3组和E4组各挥发性脂肪酸含量在E1组与E2组之间波动,总体发酵品质处于居中水平。
表4 混合发酵饲料挥发性脂肪酸含量

Table 4 Volatile fatty acid contents in mixed fermented feed mmol/L

项目
Items		 乙酸
Acetate		 丙酸
Propionate		 异丁酸
Iso-butyrate		 丁酸
Butyrate		 异戊酸
Iso-valerate		 戊酸
Valerate
组别Groups 处理Treatments
E1 S1 11.04b 3.08d 2.44bc 2.90abcd 3.25ef 3.11bcde
S2 16.92ab 3.34abcd 2.75a 3.08a 3.20f 3.10bcdef
S3 13.16b 3.20bcd 2.31bcd 2.70cde 3.40abcdef 3.10bcd
S4 11.67b 3.59abcd 2.22d 2.71de 3.43abcdef 2.91g
S5 15.85ab 3.32abcd 2.30bcd 2.75bcde 3.41abcdef 2.91g
E2 S1 12.70b 3.84abc 2.34bcd 2.91abc 3.23cdef 3.21abc
S2 13.71b 3.15cd 2.29bcd 2.71de 3.49abcd 3.26ab
S3 19.18ab 3.17cd 2.31bcd ND 3.48abcde 2.91fg
S4 17.64ab 3.32abcd 2.22bcd 2.73bcde 3.406abcde 2.91fg
S5 23.59a 3.60abcd 2.23bcd 2.74cde 3.48abcde 2.93efg
E3 S1 13.52b 2.92d 2.32bcd 2.83bcde 3.21f 3.02cdefg
S2 18.15ab 3.16cd 2.26cd 2.70e 3.58a 3.17bcd
S3 10.34b 3.88ab 2.32bcd 2.69e 3.32bcdef 3.11bcde
S4 17.31ab 3.32abcd 2.22d 2.69e 3.53ab 2.92fg
S5 10.97b 3.38abcd 2.22d 2.73cde 3.40abcdef 2.91fg
E4 S1 16.32ab 3.61abcd 2.46b 2.95ab 3.26def 3.40a
S2 13.51b 3.01d 2.25cd 2.68e 3.36abcdef 3.06cdefg
S3 18.45ab 3.04d 2.36bcd 2.72cde 3.33abcdef 2.97defg
S4 12.92b 3.92a 2.22d ND 3.50abc 3.15bcd
S5 12.00b 3.52abcd 2.22d 2.68e 3.47abcde 2.91fg
SEM 1.82 0.13 0.04 0.04 0.05 0.04

P值P-value		 E 0.01 0.44 <0.01 <0.01 0.02 0.02
S 0.39 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
E×S <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
酿酒酵母不同添加量对发酵饲料除乙酸外的其他挥发性脂肪酸含量有极显著影响(P<0.01)。不同酿酒酵母组异丁酸、异戊酸和戊酸含量有一定差异,但波动幅度较小,分别为2.22%~2.75%、3.20%~3.58%和2.91%~3.40%;E4组S4处理丙酸含量较高,且未检出丁酸,总体发酵品质较好。
植物提取物与酿酒酵母的交互作用对发酵饲料各挥发性脂肪酸含量均有极显著影响(P<0.01)。其中,E3组S4处理乙酸和丙酸含量较高,丁酸含量较低,从挥发性脂肪酸含量来看,该组发酵品质较好;而E1组S1处理乙酸和丙酸含量均处于较低水平,而丁酸含量较高,因此,该组发酵品质较差。

2.3 综合评价混合发酵饲料发酵效果

因饲料组合过多,而不同指标下最优选择各异,因此引入隶属函数法对混合发酵饲料发酵效果进行综合分析。该方法利用模糊数学的原理,将各饲料组合在不同指标上的表现转化为隶属度,通过综合考虑多个指标的隶属度来全面评估饲料组合的综合性能,从而筛选出最优的饲料组合。隶属函数平均值可反映混合发酵饲料的综合效果,平均值越大,饲料发酵效果综合表现越好。由表5可知,E2组S3处理平均值最大,发酵效果最佳,即添加250 mg/kg迷迭香提取物且酿酒酵母添加量为104 CFU/mL时,混合饲料发酵效果最佳。
表5 混合发酵饲料综合评价

Table 5 Comprehensive evaluation of mixed fermented feed

组别
Groups		 处理
Treatments		 干物质
DM		 粗蛋
白质
CP		 中性洗
涤纤维
NDF		 酸性洗
涤纤维
ADF		 乳酸
Lactic
acid		 霉菌菌
落数
Mold
colony
number		 氨态氮
NH3-N		 pH 乙酸
Acetate		 丙酸
Propionate		 丁酸
Butyrate		 异丁酸
Iso-
butyrate		 异戊酸
Iso-
valerate		 戊酸
Valerate		 平均值
Mean		 排序
Rank
E1 S1 0.66 0.13 0.21 0.88 0.04 0.00 0.17 0.53 0.05 0.16 0.45 0.11 0.87 0.59 0.34 20
S2 0.00 0.66 0.21 0.32 0.75 1.00 0.09 0.68 0.50 0.42 0.00 0.00 1.00 0.61 0.46 14
S3 0.69 0.97 0.28 0.25 0.74 1.00 0.41 0.80 0.21 0.28 0.95 0.16 0.47 0.57 0.54 9
S4 0.18 0.46 0.33 0.37 0.86 1.00 0.40 0.94 0.10 0.67 0.93 0.19 0.39 1.00 0.57 6
S5 0.34 0.89 0.32 0.47 0.37 1.00 0.21 0.53 0.42 0.40 0.83 0.16 0.45 1.00 0.59 5
E2 S1 0.76 0.40 0.50 1.00 0.00 0.05 0.20 0.48 0.18 0.92 0.43 0.15 0.92 0.39 0.43 15
S2 0.01 0.67 0.14 0.29 0.77 0.99 0.00 0.33 0.25 0.23 0.93 0.17 0.24 0.29 0.39 19
S3 0.50 0.73 0.06 0.00 0.90 1.00 1.00 0.99 0.67 0.25 0.95 1.00 0.26 1.00 0.67 1
S4 0.44 0.00 0.00 0.39 0.67 1.00 0.09 0.68 0.55 0.40 0.88 0.19 0.32 1.00 0.47 13
S5 0.57 0.17 0.01 0.37 0.49 1.00 0.24 1.00 1.00 0.68 0.85 0.19 0.26 0.96 0.55 7
E3 S1 0.61 0.51 0.09 0.63 0.04 0.96 0.24 0.24 0.24 0.00 0.63 0.16 0.97 0.78 0.41 16
S2 0.12 0.76 0.15 0.24 0.61 0.99 0.00 0.42 0.59 0.24 0.95 0.18 0.00 0.47 0.40 17
S3 1.00 1.00 0.39 0.47 1.00 1.00 0.18 0.31 0.00 0.96 0.98 0.16 0.68 0.59 0.59 4
S4 0.31 0.87 0.27 0.20 0.32 1.00 0.55 0.14 0.53 0.40 0.98 0.19 0.13 0.98 0.48 12
S5 0.83 0.93 0.53 0.61 0.62 1.00 0.49 0.64 0.05 0.46 0.88 0.19 0.47 1.00 0.60 3
E4 S1 0.95 0.40 0.35 0.78 0.10 0.74 0.28 0.00 0.45 0.69 0.33 0.11 0.84 0.00 0.39 18
S2 0.59 0.65 1.00 0.59 0.35 0.98 0.10 0.96 0.24 0.09 1.00 0.18 0.58 0.69 0.54 10
S3 0.54 0.99 0.36 0.33 0.72 1.00 0.10 0.93 0.61 0.12 0.90 0.14 0.66 0.88 0.55 8
S4 0.27 0.97 0.57 0.51 0.74 1.00 0.37 0.73 0.19 1.00 0.95 1.00 0.21 0.51 0.64 2
S5 0.36 0.96 0.45 0.49 0.38 1.00 0.18 0.61 0.13 0.60 1.00 0.19 0.29 1.00 0.51 11

2.4 发酵饲料对奶牛瘤胃体外发酵指标的影响

由表6可知,与CON组相比,各试验组pH和NH3-N含量均无显著差异(P>0.05)。S组IVDMD显著高于其他组(P<0.05),ES组IVDMD显著高于CON组和E组(P<0.05)。E组和ES组乙酸含量显著高于CON组和S组(P<0.05),且S组乙酸含量显著高于CON组(P<0.05);各试验组丙酸含量显著高于CON组(P<0.05),且ES组丙酸含量显著高于E组和S组(P<0.05),同时E组丙酸含量显著高于S组(P<0.05);S组异丁酸含量显著高于其他组(P<0.05),各试验组异丁酸含量显著高于CON组(P<0.05),E组与ES组间异丁酸含量无显著差异(P>0.05);E组与ES组间丁酸含量无显著差异(P>0.05),且均显著高于S组和CON组(P<0.05);E组与ES组间异戊酸含量无显著差异(P>0.05),且均显著高于CON组(P<0.05),S组与E组间异戊酸含量无显著差异(P>0.05),E组异戊酸含量显著高于CON组(P<0.05);E组和S组戊酸含量显著高于CON组(P<0.05),且S组戊酸含量显著高于ES组(P<0.05);E组和ES组总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著高于CON组和S组(P<0.05),且S组TVFA含量显著高于CON组(P<0.05)。
表6 发酵饲料对奶牛瘤胃体外发酵指标的影响

Table 6 Effects of fermented feed on rumen fermentation indices in vitro of dairy cows

项目
Items		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON E S ES
pH 6.70 6.82 6.65 6.75 0.04 0.12
氨态氮NH3-N/(mg/dL) 5.76 5.81 5.78 5.75 0.06 0.90
体外干物质消化率IVDMD/% 46.83d 47.41c 55.39a 52.40b 0.23 <0.01
挥发性脂肪酸VFA/(mmol/L)
乙酸Acetate 12.11c 16.18a 14.49b 16.39a 0.14 <0.01
丙酸Propionate 6.75d 7.62b 7.40c 8.05a 0.06 <0.01
异丁酸Iso-butyrate 2.29d 2.36b 2.41a 2.32bc 0.01 <0.01
丁酸Butyrate 3.71c 4.22a 4.02b 4.24a 0.02 <0.01
异戊酸Iso-valerate 1.60c 1.73ab 1.64bc 1.82a 0.01 <0.01
戊酸Valerate 1.81d 1.88ab 1.90a 1.85b 0.01 <0.01
总挥发性脂肪酸TVFA 28.28c 34.00a 32.05b 34.81a 0.20 <0.01

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Values in the same row with different letter superscripts indicated significant differences (P<0.05).

3 讨论

3.1 混合发酵饲料常规营养成分含量

本研究中,添加植物提取物和酿酒酵母对发酵饲料DM含量均有显著影响,添加不同剂量酿酒酵母组DM含量与未添加组相比有下降趋势,推测可能是由于发酵过程中剧烈的微生物作用导致了DM的损失,这与胡梦洁等[9]的研究结果相似。迷迭香和百里香提取物可抑制有害菌的活动,具有防腐的作用[10-11],本研究中未添加植物提取物组(E1组)相比于添加植物提取物组DM含量较低,表明添加植物提取物一定程度上降低了DM的损失。
任亚琼等[12]使用酵母菌等菌酶制剂处理玉米秸秆后,其CP含量显著提高,这与本研究结果一致。本研究中,随着酿酒酵母的加入,与对照处理相比,各试验处理CP含量显著提高,这可能是由于酿酒酵母充分利用发酵底物中的营养成分,自身合成了大量菌体蛋白[13],因此使混合发酵饲料CP含量提高,饲料得到更充分的利用。
Abd El Tawab等[14]研究表明,添加迷迭香和百里香提取物能够增强纤维素酶的活性。酶活性的提高能够潜在地促进纤维素的降解,从而降低饲料中的NDF和ADF含量。本试验中,E2组、E3组和E4组NDF和ADF含量与E1组相比有所降低,且E4组最低。微生物具有分泌纤维素酶的能力[15],本研究中添加酿酒酵母后,与对照处理相比,各试验处理NDF含量有所降低,可能原因是其对NDF的分解具有直接作用。马步仓[16]采用酿酒酵母与乳酸菌处理玉米秸秆后,使得秸秆中的NDF和ADF含量降低,这一发现与本试验结果相吻合。

3.2 混合发酵饲料发酵品质

3.2.1 混合发酵饲料pH、乳酸和NH3-N含量以及霉菌菌落数

酿酒酵母在发酵饲料中起着重要的作用,能够有效改善饲料品质[17]。与青贮发酵类似,加入酿酒酵母的饲料在发酵初期消耗密闭环境中的氧气,氧气耗尽后,在厌氧条件下乳酸菌也会逐渐参与到发酵过程中,产生大量乳酸,降低饲料的pH[18],从而抑制有害菌的生长。厌氧条件下的酿酒酵母发酵还产生乙醇,在消耗乳酸菌产物的过程中促进乳酸菌的生长繁殖,同时增加饲料适口性[19]。然而,当酿酒酵母添加过量时,情况就会发生变化。有研究表明,过量的酿酒酵母会消耗大量的营养物质[20],导致乳酸菌可利用的营养减少。迷迭香和百里香提取物对多种致病菌具有抑制作用[21⇓-23],但对不同细菌、真菌的抑制作用不同;不过,相同的是,这2种植物提取物对霉菌都有显著的抑制作用[24-25]。
研究表明,酿酒酵母能显著降低饲料pH,但随着其添加量的增加,pH先降低后缓慢上升,这可能是因为当酵母菌添加量达到105 CFU/g时,会限制乳酸菌生长,导致乳酸产量减少[26],本试验也存在这一趋势。研究还表明,在发酵过程中,乳酸进一步生成乙酸,在抑制微生物活动的同时,维持pH在较低水平,此时蛋白酶的活性也受到抑制,从而减少NH3-N的产生[27]。本研究也验证了这一趋势,较低的pH对应了较高的乳酸含量以及较低的蛋白质损失。
研究表明,酵母细胞中含有的甘露寡糖[28],对于霉菌毒素,如黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等具有吸附、吞噬和破坏的作用[29]。Bakhtiarizade等[30]研究发现,迷迭香和百里香精油中的成分不仅可以干扰霉菌生长和代谢过程中关键酶活性,而且能够破坏霉菌的细胞膜,导致其内容物泄漏,从而抑制霉菌的生长。本试验中,与E1组相比,E3组和E4组霉菌菌落数显著降低,E2组霉菌菌落数有所降低,但差异不显著;此外,在不同植物提取物组中,随着酿酒酵母添加量的逐渐提高,霉菌菌落数也在不断减少,直至无法检出。由此可见,相较于单一因素的作用,植物提取物与酿酒酵母的联合应用对霉菌生长的抑制作用表现出更为显著的效果。

3.2.2 混合发酵饲料挥发性脂肪酸含量

Shahbazi等[31]研究表明,由于迷迭香和百里香草药成分对微生物代谢途径具有调节作用,能够促进产乙酸细菌的生长,提高乙酸含量。本试验中,E1组乙酸含量较低,加入植物提取物的E2组、E3组和E4乙酸含量均有所提升。陈芬[32]在研究酿酒酵母与乳酸菌共培养的过程中发现,随着酿酒酵母活菌数的增加,乙酸含量逐步降低,这与本试验结果一致。本试验中,添加酿酒酵母后,各试验处理乙酸含量与对照处理相比先有升高的趋势,但随着酿酒酵母添加量的提高,乙酸含量降低。推测这可能是由于在厌氧环境中,酿酒酵母活跃的代谢作用使乙醇含量升高,乙醇和乙酸进一步被酿酒酵母利用合成乙酸乙酯[33],从而使乙酸含量降低。
当发酵厌氧条件形成后,pH会迅速下降,此时会抑制丁酸的产生。优质发酵饲料应不含丁酸,其存在则代表着存在梭菌生物的代谢[34],不仅造成DM的大量损失,而且其气味影响适口性。赵庆枫等[35]使用复合益生菌对巨菌草进行发酵后,试验组丁酸含量显著降低,这与本试验结果一致。本试验中,与对照处理相比,随着酿酒酵母的加入,试验处理丁酸含量显著降低,但酿酒酵母达到最大添加量时,丁酸含量反而有所升高,可能是由于当酿酒酵母添加过量时,会造成乳酸菌营养物质不足,导致产酸减小,pH略有升高,不能完全抑制丁酸菌的活动,从而使得丁酸含量出现上升趋势。

3.3 隶属函数法综合评价混合发酵饲料发酵效果

隶属函数法可以综合考虑多个因素对目标的影响。与单个指标分析只关注某一特定指标不同,隶属函数法通过设定不同因素的隶属函数及权重,可以对目标进行更全面、更客观地评估[36]。本试验分别通过对发酵饲料营养成分和发酵品质的分析,可得到较优组合E1组S4处理、E2组S3处理、E3组S3处理、E3组S4处理和E3组S5处理,较差组合E1组S1处理和E2组S1处理,但因分组较多、数据波动等因素,无法全面分析全部指标,使用隶属函数综合分析方法,将多个指标进行综合评分分析后,得出隶属函数平均值最高组为E2组S3处理,即添加250 mg/kg迷迭香提取物且酿酒酵母添加量为104 CFU/mL时,混合饲料发酵效果最佳。

3.4 发酵饲料对奶牛瘤胃体外发酵指标的影响

瘤胃中用于微生物消化纤维和蛋白质的最佳pH为6.5~7.0。研究表明,酵母产品在稳定瘤胃pH、刺激瘤胃发酵等方面有着良好的效果[37]。且有研究指出,瘤胃pH在添加迷迭香提取物的情况下能够保持相对稳定[38]。本试验中,各试验组pH与对照组相比无显著差异,表明瘤胃中的发酵环境较稳定。
瘤胃干物质消化率直接影响反刍动物对饲粮中营养成分的吸收和利用,是评价饲料质量和饲养效果的重要指标之一。Phesatcha等[39]观察到在不同精粗比饲粮中添加活酵母后,IVDMD显著提高;然而,在Ronquillo等[40]的试验中,添加迷迭香后未提高瘤胃干物质降解率,干物质降解率甚至有所降低。以上结果与本试验结果基本一致,本试验中,单独添加迷迭香提取物(E组)或酿酒酵母(S组)均能显著提高IVDMD,同时添加两者(ES组)虽亦能显著提高IVDMD,但提升幅度介于单独添加酿酒酵母与迷迭香提取物之间,表明酵母菌对饲料降解的促进作用占主导,而迷迭香提取物的添加可能在一定程度上影响了酵母菌的促降解效果,但总体仍表现出正向协同效应。
挥发性脂肪酸在奶牛的消化和能量代谢中起着至关重要的作用,其包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等,其中乙酸、丙酸和丁酸占90%以上[36]。有研究指出,在荷斯坦奶牛饲粮中添加活性酿酒酵母能够提高乙酸和TVFA含量[37];同时,有研究表明,在育肥羊饲粮中添加迷迭香精油能够显著提高乙酸、丙酸和TVFA含量[41]。本试验结果发现,在饲料中同时添加迷迭香提取物和酿酒酵母相较于单独添加这2种成分,各挥发性脂肪酸含量的升高展现出更为显著的效果。这种协同增效作用可能归因于迷迭香提取物中的活性成分(如鼠尾草酸、迷迭香酸等)与酿酒酵母代谢产物之间的相互作用,共同提升了发酵饲料的整体品质。

4 结论

① 植物提取物对发酵饲料霉菌菌落生长具有抑制作用,其中百里香提取物的抑制作用更强,迷迭香提取物次之,且与酿酒酵母联合使用对霉菌生长的抑制作用更加显著。
② 当添加104 CFU/mL酿酒酵母时,发酵饲料中乳酸含量较高。
③ 采用隶属函数法对发酵效果进行综合评价,当添加250 mg/kg迷迭香提取物且酿酒酵母添加量为104 CFU/mL时,混合饲料发酵效果最佳。
④ 发酵饲料可以提高奶牛瘤胃IVDMD和挥发性脂肪酸含量。

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