动物营养学报 >

2025 , Vol. 37 >Issue 4: 2788 - 2800

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.233

研究论文

基于网络药理学探究八角茴香活性成分缓解玉米赤霉烯酮致猪子宫内膜炎的作用机制

  • 谢一平 ,
  • 杨立杰 ,
  • 张健 ,
  • 王文婧 ,
  • 焦宁 ,
  • 李扬 ,
  • 杨维仁 ,
  • 姜淑贞 , *
展开
  • 山东农业大学动物科技学院,山东省畜禽营养与高效饲养重点实验室,非粮饲料资源高效利用重点实验室(省部共建),泰安 271017
* 姜淑贞,副教授,硕士生导师,E-mail:

谢一平(2002—),女,山东临沂人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业。E-mail:

Copy editor: 陈鑫

收稿日期: 2024-09-24

  网络出版日期: 2025-04-15

基金资助

国家重点研发专项(2023YFD1301005)

山东省生猪产业技术体系(SDAIT-08-05)

收起

Mechanism of Active Ingredients of Star Anise in Alleviating Zearalenone-Induced Porcine Endometritis Based on Network Pharmacology

  • XIE Yiping ,
  • YANG Lijie ,
  • ZHANG Jian ,
  • WANG Wenjing ,
  • JIAO Ning ,
  • LI Yang ,
  • YANG Weiren ,
  • JIANG Shuzhen , *
Expand
  • Key Laboratory of Efficient Utilization of Non-Grain Feed Resources (Co-Construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Nutrition and Efficient Feeding, Department of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271017, China
* associate professor, E-mail:

Received date: 2024-09-24

  Online published: 2025-04-15

Fold

摘要

本研究采用网络药理学与分子对接技术探究八角茴香活性成分缓解玉米赤霉烯酮致猪子宫内膜炎的作用机制。通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)数据库获取八角茴香主要有效活性成分及相关作用靶点,通过基因数据库(GeneCards)获取猪子宫内膜炎相关靶点;利用预测蛋白相互作用的数据库(String)建立蛋白互作(PPI)网络,结合生物网络绘图软件(Cytoscape)对靶点进一步筛选获取关键靶点,建立“有效成分-潜在作用靶点-通路”网络图在注释、可视化和综合发现数据库(DAVID)对可能作用靶点进行京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)信号通路和基因本体(GO)富集,选取排名靠前的有效活性成分与关键靶点经Autodock-Tools进行分子对接。结果表明: 1)筛选出八角茴香的5个活性成分分别是白桦酸酯、木犀草素、山柰酚、儿茶素和槲皮素,缓解玉米赤霉烯酮子宫内膜炎的可能作用靶点25个。2)PPI网络分析结果发现,白细胞介素6(IL6)、白细胞介素1β(IL1β)、Toll样受体4(TLR4)和瘦素(LEP)是八角茴香缓解玉米赤霉烯酮致猪子宫内膜炎的关键靶点。3)KEGG信号通路富集发现,筛选的可能作用靶点主要参与炎症相关信号通路。4)分子对接预测结果表明,槲皮素和木犀草素与关键靶点均能稳结合。综上所述,八角茴香活性成分槲皮素和木犀草素可以通过炎症相关信号通路发挥抗炎和调节免疫作用,这为八角茴香缓解玉米赤霉烯酮致猪子宫内膜炎的应用提供了理论基础。

关键词： 八角茴香; 网络药理学; 分子对接; 玉米赤霉烯酮; 子宫内膜炎

本文引用格式

谢一平 , 杨立杰 , 张健 , 王文婧 , 焦宁 , 李扬 , 杨维仁 , 姜淑贞 . 基于网络药理学探究八角茴香活性成分缓解玉米赤霉烯酮致猪子宫内膜炎的作用机制[J]. 动物营养学报, 2025 , 37(4) : 2788 -2800 . DOI: 10.12418/CJAN2025.233

Abstract

The purpose of this study was to explore the mechanism of the active ingredients of star anise in alleviating zearalenone-induced porcine endometritis using network pharmacology and molecular docking technology. The active ingredients of star anise and related-targets, and the endometritis-related targets were obtained through the TCMSP database and GeneCards, respectively. The String database was used to establish a protein-protein interaction network (PPI). Subsequently, the key targets were further screened by Cytoscape software. The KEGG and GO enrichment of the possible targets were conducted in the DAVID database. The top effective active ingredients were selected, and the key targets underwent molecular docking through Autodock-Tools. Results showed as follows: 1) five active ingredients including mairin, luteolin, kaempferolol, (+)-catechin and quercetin were screened, and 25 possible targets were selected to alleviate zearalenone-induced porcine endometritis. 2) The PPI network analysis showed that interleukin 6 (IL6), interleukin 1β (IL1β), Toll-like receptor 4 (TLR4) and leptin (LEP) were the key targets of star anise in alleviating zearalenone-induced porcine endometritis. 3) The enrichment of KEGG signaling pathway showed that the potential targets identified were primarily involved in inflammation-related signaling pathways. 4) The molecular docking prediction results showed that both quercetin and luteolin could bind to key targets stably. In conclusion, the active ingredients of star anise, quercetin and luteolin, can exert anti-inflammatory and immunomodulating effects through inflammation-related signaling pathways. This provides a theoretical basis for the application of star anise in alleviating zearalenone-induced porcine endometritis.

Key words： star anise; network pharmacology; molecular docking; zearalenone; endometritis

目前,国内外饲料受霉菌毒素污染的状况比较普遍,很多地区的作物可以检测出各种霉菌毒素[1]。玉米赤霉烯酮(ZEA)是镰刀属真菌产生的次级代谢产物[2],其主要污染对象是玉米及其副产物[3]。大量研究表明,ZEA通过采食进入体内,造成动物的生殖、免疫和消化等多种器官损伤,导致动物生殖障碍、免疫力下降以及各种器官炎症反应[4]。ZEA还会对动物能量代谢造成一定影响,研究表明,其诱导雌性小鼠的子宫甘油二酯和磷脂酰甘油积累,还会通过抑制糖酵解相关酶的表达影响糖酵解,进而干扰小鼠正常的生理代谢[5]。口服ZEA吸收速度快,吸收率高达80%~85%,由于其结构与内源雌激素相似,能与不同器官的雌激素受体竞争性结合,扰乱激素代谢,导致生殖功能紊乱[6-7]。相较于其他动物,猪对ZEA更加敏感[6],造成卵巢萎缩、子宫肥大、妊娠母猪流产及胎儿畸形等一系列生殖器官的炎症反应和生殖障碍[7]。
八角茴香是木兰科八角属植物,具有杀菌、杀虫、抗炎、抗病毒和抗氧化等作用。其化学成分大致可分为挥发油(反式茴香醚为主)和非挥发性成分如有机酸类、黄酮类、萜类、苯丙素类、甾醇类物质和微量元素等[8]。八角茴香对缓解急性肺炎发挥一定的药效作用,可以作为综合缓解毒性的治疗药物[9]。目前,微生物降解是常用的ZEA脱毒方法,通过菌体吸附毒素或者菌体产生的酶或代谢产物与ZEA产生温和反应,达到减弱或者消除毒性的作用[10]。但是微生物在动物体内的代谢过程十分复杂,机制难以确定,生物活性物质通过调节动物体自身的代谢达到脱毒功效是当前研究的热点[11]。
网络药理学是研究建立药物、靶点和疾病之间复杂的网络关系,进而探究药物对疾病作用机制的科学[12]。分子对接技术是指通过配体(小分子药物或者活性物质)与受体(蛋白)结合的亲和力,来预测药物与靶点之间的相互作用,筛选关键活性物质,对于开发活性成分作为药物的广泛利用有着重要意义[13]。谢婕妤等[14]通过网络药理学和分子对接技术揭示了马齿苋中槲皮素和木犀草素等有效活性成分调控核因子κB(NFκB)等信号通路作用于肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL6)等主要炎症靶点,从而发挥抑制猪炎症反应的机制。蔡燕子等[13]通过网络药理学和分子对接技术阐述了参甘草中槲皮素、山柰酚和木犀草素等潜在活性成分可以降低TNFα、IL6和血管内皮生长因子(VEGFA)等炎症因子的表达,进而干预磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NFκB等信号通路,发挥抗炎作用,从而增强仔猪免疫功能。本研究以子宫内膜炎作为研究猪生殖功能障碍的切入点,结合网络药理学和分子对接技术,探究八角茴香活性成分缓解ZEA致子宫内膜炎的作用机制,为深入研究八角茴香对ZEA的脱毒机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 八角茴香有效活性成分的筛选

利用中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)获取八角茴香有效活性成分并进行筛选,在数据库检索“bajiaohuixiang”并将搜索结果按照生物口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18进行筛选[15],共获得5个有效活性成分,获取分子ID、中文名称、英文名称、OB和DL值记录成表,并进行编号。

1.2 八角茴香活性成分靶点的获取以及“八角茴香活性成分-作用靶点”网络关系的构建

在TCMSP数据库获取活性成分的靶点名称,通过蛋白质数据库(Uniprot)对相关靶点进行标准化,筛选出针对“猪”的靶标基因名称导入Cytoscape软件构建“八角茴香活性成分-潜在靶点”网络图。

1.3 子宫内膜炎相关靶点的获取及蛋白互作(PPI)网络的构建

在GeneCards数据库检索关键词“endometritis”,获取猪子宫内膜炎靶点;将活性成分相关靶点与子宫内膜炎相关靶点导入Venny2.1平台进行映射,获得八角茴香缓解ZEA致子宫内膜炎的预测靶点;将结果导入String构建八角茴香抑制猪子宫内膜炎预测靶点的PPI网络图,通过Cytoscape软件进行可视化分析,绘制PPI网络图;根据拓扑属性度值(degree)、介数(betweenness)和紧密度(closeness),筛选出排名靠前的靶点作为核心靶点。

1.4 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)信号通路富集分析

将预测靶点导入DAVID进行KEGG信号通路和GO功能富集分析;KEGG通路富集根据P值从小到大排列选取前20条且P<0.05;GO功能富集从生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)进行筛选,根据P值从小到大排列,每项选取前10条且P<0.05。最后利用cytoscape软件构建“八角茴香活性成分-作用靶点-信号通路”可视化网络,明确三者之间的关系,进行进一步分析。

1.5 活性成分与关键靶点的分子对接验证

PPI网络中连通度前2名的八角茴香活性成分与关键靶点进行分子对接。首先在有机小分子生物活性数据库(PubChem)检索活性成分,获取活性成分2D结构再通过Chem 3D软件进行3D结构修饰;然后在预测蛋白三维结构的在线网站(SWISS-MODEL)数据库获取关键靶点的蛋白质数据库(PDB)格式采用Autodock-Tools软件进行分子对接,选取最佳构象,通过PyMOL软件进行可视化处理。

2 结果与分析

2.1 八角茴香有效活性成分的筛选

通过TCMSP数据库检索,并按照条件OB≥30%和DL≥0.18进行筛选,共获得2类5种八角茴香有效活性成分,分别为白桦酸酯、木犀草素、山柰酚、儿茶素和槲皮素,其相关参数及化学结构见表1。
表1 八角茴香的有效活性成分

Table 1 Active ingredients of star anise

项目
Items		 编号
Number		 中文名称
Chinese
name		 英文名称
English
name		 口服生物
利用度
OB/%		 类药性
DL		 水溶性
Water
solubility		 简化分子线性输入规范
Simplified molecular
input line entry
specification
萜类
Terpenoids		 BH01 白桦酸酯 Mairin 55.38 0.78 不溶于水 CC(=C)C1CCC2(C1C3CCC4C5
(CCC(C(C5CCC4(C3(CC2)
C)C)(C)C)O)C)C(=O)O
黄酮类
Flavonoids		 BH02 木犀草素 Luteolin 36.16 0.25 微溶于热水 C1=CC(=C(C=C1C2=CC
(=O)C3=C(C=C(C=C3O2)
O)O)O)O
BH03 山柰酚 Kaempferol 41.88 0.24 微溶于水 C1=CC(=CC=C1C2=C
(C(=O)C3=C(C=C(C=C3O2)
O)O)O)O
BH04 儿茶素 (+)-Catechin 54.83 0.24 易溶于水 C1C(C(OC2=CC(=CC(=C21)
O)O)C3=CC(=C(C=C3)O)O)O
BH05 槲皮素 Quercetin 46.43 0.28 不溶于水 C1=CC(=C(C=C1C2=C(C
(=O)C3=C(C=C(C=C3O2)
O)O)O)O)O

分子ID来源于TCMSP数据库。

The molecular IDs are derived from the TCMSP database.

2.2 八角茴香活性成分-潜在作用靶点网络的构建

将上述5种活性成分通过Uniprot数据库进行标准化修正并筛选针对“猪”的靶点,最终获得461个靶点,将活性成分以及461个靶点导入Cytoscape软件进行可视化处理,构建了“八角茴香活性成分-潜在作用靶点”网络(图1),仅展示了degree≥5的靶点。活性成分degree排序前2名为槲皮素和木犀草素。
图1 八角茴香活性物质-潜在作用靶点网络图

仅列出degree排名前10的靶点名称 list only the top 10 target names in degree values ranking。LEP:瘦素 leptin; ESR1:雌激素受体1 estrogen receptor 1; APP:淀粉样前体蛋白 amyloid-beta precursor protein; IKBKG:核因子κB激酶调节亚基γ抑制因子 NF-kappa-B essential modulator; JAK2:酪氨酸蛋白激酶 JAK2 tyrosine-protein kinase JAK2; ADAM10:解整合素金属蛋白酶10 disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10; NFKBIA:核因子κB抑制因子α NF-kappa-B inhibitor alpha; ARHGEF2:Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子2 Rho guanine nucleotide exchange factor 2; ANXA1:膜联蛋白A1 annexin A1; IL10:白细胞介素10 interleukin 10。

Fig.1 Network diagram of star anise active ingredients-potential targets

2.3 子宫内膜炎靶点的获取及靶点预测

通过GeneCards数据库检索子宫内膜炎获得133个相关靶点,将2.2获得的活性成分相关靶点与子宫内膜炎相关靶点导入韦恩图平台(Venny2.1)进行靶点预测(图2),共获得25个八角茴香活性成分抑制猪子宫内膜炎的作用靶点(表2)。
图2 八角茴香活性成分靶点与子宫内膜炎靶点韦恩图

Fig.2 Venn diagram of active ingredient targets of star anise and endometritis targets

表2 八角茴香活性成分对应子宫内膜炎交集靶点

Table 2 Active ingredients of star anise corresponds to endometritis targets

成分
Components		 靶点
Targets		 靶点全称Full names of targets
英文English 中文Chinese
BH02/03/04/5 LEP Leptin 瘦素
BH02/03/04/05 ESR1 Estrogen receptor 1 雌激素受体1
BH02/05 IL1α Interleukin 1α 白细胞介素1α
BH02/03/05 TNF Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子
BH02/05 IL1β Interleukin 1β 白细胞介素1β
BH02/03/05 IL6 Interleukin 6 白细胞介素6
BH02/03/05 VIM Vimentin 波形蛋白
BH02/03/05 IL2 Interleukin 2 白细胞介素2
BH02/05 TLR4 Toll-like receptor Toll样受体
BH02/03/05 IL13 Interleukin 13 白细胞介素13
BH02/03/05 HMGB1 High mobility group box protein 1 高迁移率族蛋白1
BH02/03/05 LTF Lactotransferrin 乳转铁蛋白
BH02/03/05 CXCL8 C-X-C motif chemokine ligand 8 基序趋化因子8
BH/02/05 IL17A Interleukin 17A 白细胞介素17A
BH02 IL15 Interleukin 15 白细胞介素15
BH02/03 GAL Galanin peptides 甘丙肽
BH02/03/05 CCL5 C-C motif chemokine 5 C-C基序趋化因子5
BH03 HP Haptoglobin 结合珠蛋白
BH03/05 SELE E-selectin E-选择素
BH03/05 NR5A1 Steroidogenic factor 1 类固醇生成因子1
BH03/04/05 ESR2 Estrogen receptor beta 雌激素受体β
BH05 FSHβ Follitropin subunit beta 促卵泡激素亚基β
BH05 AMH Anti-muellerian-inhibiting factor 抗缪勒管激素
BH05 HK2 Hexokinase 2 己糖激酶2
BH05 VDAC1 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 电压依赖性阴离子通道1

2.4 PPI网络构建及核心靶点的筛选

将上述25个作用靶点导入String数据库,建立PPI网络图(图3)。结果显示,映射后节点数为25,边数为101,平均节点度值为8.08,平均局部聚类系数为0.724,其中有3个靶点波形蛋白(VIM)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)和己糖激酶2(HK2)处于游离状态,与其他靶点无蛋白互作关系,进行剔除后将靶点导入Cytoscape软件进行可视化分析绘制网络图(图4),由图4可见,经拓扑分析绘制出八角茴香活性成分抑制猪子宫内膜炎作用靶点PPI网络图,圆圈代表有效靶点,连线代表2个靶点之间的互作关系,圆圈越大颜色越深且连线越多代表该靶点越关键;根据degree、betweenness和closeness从大到小筛选核心靶点,如表3所示。
图3 八角茴香活性物质缓解子宫内膜炎潜在靶点PPI网络图

LEP:瘦素 leptin;ESR1:雌激素受体1 estrogen receptor 1;IL1α:白细胞介素1α interleukin 1α;TNF:肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor;IL1β:白细胞介素1β interleukin 1β;IL6:白细胞介素6 interleukin 6;VIM:波形蛋白 vimentin;IL2:白细胞介素2 interleukin 2;TLR4:Toll样受体4 Toll-like receptor 4;IL13:白细胞介素13 interleukin 13;HMGB1:高迁移率族蛋白1 high mobility group box protein 1;LTF:乳转铁蛋白 lactotransferrin;CXCL8:基序趋化因子8 C-X-C motif chemokine ligand 8;IL17A:白细胞介素17A interleukin 17A;IL15:白细胞介素15 interleukin 15;GAL:甘丙肽 galanin peptides;CCL5:C-C基序趋化因子5 C-C motif chemokine 5;HP:结合珠蛋白 haptoglobin;SELE:E选择素 E selectin;NR5A1:类固醇生成因子1 steroidogenic factor 1;ESRβ:雌激素受体β estrogen receptor beta;FSHβ:促卵泡激素亚基β follitropin subunit beta;AMH:抗缪勒管激素 anti-muellerian-inhibiting factor;HK2:己糖激酶2 hexokinase 2;VDAC1:电压依赖性阴离子通道1 voltage-dependent anion-selective channel protein 1。

Fig.3 PPI network diagram of potential targets of star anise active ingredients in relieving endometritis

图4 八角茴香5种有效活性物质缓解子宫内膜炎的靶点图

LEP:瘦素 leptin;ESR1:雌激素受体1 wstrogen receptor 1;IL1α:白细胞介素1α interleukin 1α;TNF:肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor;IL1β:白细胞介素1β interleukin 1β;IL6:白细胞介素6 interleukin 6;IL2:白细胞介素2 interleukin 2;TLR4:Toll样受体4 Toll-like receptor 4;IL13:白细胞介素13 interleukin 13;HMGB1:高迁移率族蛋白1 high mobility group box protein 1;LTF:乳转铁蛋白 lactotransferrin;CXCL8:基序趋化因子8 C-X-C motif chemokine ligand 8;IL17A:白细胞介素17A interleukin 17A;IL15:白细胞介素15 interleukin 15;GAL:甘丙肽 galanin peptides;CCL5:C-C基序趋化因子5 C-C motif chemokine 5;HP:结合珠蛋白 haptoglobin;SELE:E选择素 E selectin;NR5A1:类固醇生成因子1 steroidogenic factor 1;ESRβ:雌激素受体β estrogen receptor beta;FSHβ:促卵泡激素亚基β follitropin subunit beta;AMH:抗缪勒管激素 anti-muellerian-inhibiting factor。

Fig.4 Targets diagram of five effective active ingredients of star anise in relieving endometritis

表3 关键靶点的拓扑参数

Table 3 Topological parameters of key targets

靶点
Targets		 连通度
Degree		 径向度
Radiality		 连接性
Connectivity		 介数
Betweenness		 紧密度
Closeness		 应力中心性
Stress
白细胞介素6 IL6 17 0.988 8 10.058 8 0.177 0 0.840 0 244
白细胞介素1β IL1β 16 0.986 0 10.500 0 0.111 9 0.807 7 190
Toll样受体4 TLR4 15 0.977 6 10.800 0 0.041 7 0.724 1 98
瘦素LEP 12 0.974 8 10.500 0 0.194 6 0.700 0 298

2.5 KEGG信号通路富集与GO功能富集分析

通过DAVID数据库对选取的22个作用靶点进行KEGG信号通路富集分析和GO功能富集分析。KEGG通路富集分析根据P值从小到大排列选取前20条且P<0.05条目进行可视化(图5),由图5可以看出,八角茴香抑制子宫内膜炎主要通过参与炎症相关信号通路以及细胞因子互作,揭示了八角茴香具有抗炎作用,除此之外作用靶点也在其他信号通路发挥作用,证明八角茴香活性成分可以通过多条信号通路抑制子宫内膜炎;GO功能富集分析从BP、CC和MF对靶点进行注释和归类,每类根据P值从小到大排列选取前10条且P<0.05条目,CC仅有5条(图6),由图6可知,作用靶点BP主要与免疫应答(immune response)、炎症反应(inflammatory response)、胰岛素分泌的调节(regulation of insulin secretion)、参与炎症反应正调控的细胞因子产物(positive regulation of cytokine production involved in inflammatory response)和适应性免疫应答(adaptive immune response)等有关;CC主要与细胞外间隙(extracellular space)和胞外区(extracellular region)等有关;MF主要与细胞因子活性(cytokine activity)、白细胞介素2受体结合(interleukin 2 receptor binding)和生长因子活性(growth factor activity)等有关。
图5 KEGG信号通路富集分析

Graft-versus-host disease:移植物抗宿主病;Inflammatory bowel disease:炎症性肠病;Malaria:疟疾;Rheumatoid arthritis:类风湿性关节炎;Legionellosis:军团菌病;Pertussis:百日咳;IL17 signaling pathway:白细胞介素17信号通路;Chagas disease:美洲锥虫病;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并发症中的糖基化产物及其受体信号通路;Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor:病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用;Toll-like receptor signaling pathway:Toll样受体信号通路;TNF signaling pathway:肿瘤坏死因子信号通路;Amoebiasis:阿米巴原虫病;Cytokine-cytokine receptor interaction:细胞因子-细胞因子受体相互作用;Influenza A:甲型流感;Alcoholic liver disease:酒精性肝病;Yersinia infection:耶尔森氏菌感染;Non-alcoholic fatty liver disease:非酒精性脂肪性肝病;NOD-like receptor signaling pathway:NOD样受体信号通路。

Fig.5 KEGG signaling pathway enrichment analysis

图6 GO功能富集分析

BP:生物过程 biology progress;CC: 细胞组分 cellular component;MF:分子功能 molecular function; Regulation of insulin secretion:胰岛素分泌的调节;Positive regulation of cytokine production involved in inflammatory response:参与炎症反应正调控的细胞因子产物;Adaptive immune response:适应性免疫应答;Positive regulation of interleukin 6 production:白细胞介素6产生的正调控;Positive regulation of estradiol secretion:雌二醇分泌的正调控;Positive regulation of interleukin 1 beta production:白细胞介素1β产生的正调控;Vascular endothelial growth factor production:血管内皮生长因子的产生;Positive regulation of tyrosine phosphorylation of STAT protein:STAT蛋白酪氨酸磷酸化的正调控;Extracellular space:细胞外间隙;Extracellular region:胞外区;External side of plasma membrane:质膜外侧;Interleukin 6 receptor complex:白细胞介素6受体复合物;Phagocytic cup:吞噬杯;Cytokine activity:细胞因子活性;Interleukin 2 receptor binding:白细胞介素2结合受体;Growth factor activity:生长因子活性;RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding:RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性,配体激活序列特异性DNA的结合;Estrogen receptor activity:雌激素受体活性;Interleukin 6 receptor binding:白细胞介素6结合受体;Estrogen response element binding:雌激素反应结合原件;Hormone activity:激素活性;Interleukin 1 receptor binding:白细胞介素1结合受体;Steroid binding:结合类固醇。

Fig.6 GO functional enrichment analysis

2.6 八角茴香活性物质-作用靶点-信号通路网络可视化

将八角茴香活性成分、靶点以及选取的信号通路导入Cytoscape软件进行可视化分析(图7)。由图7可见,图中粉色菱形表示八角茴香活性成分,蓝色圆形代表八角茴香活性成分抑制子宫内膜炎作用靶点,黄色六边形表示活性成分发挥作用抑制炎症的信号通路,边表示互相关联,BH01与子宫内膜炎无共同靶点;4种活性成分主要经过22个作用靶点参与20条信号通路通过各种复杂的互作网络关系发挥抑制子宫内膜炎的作用,其中BH02(17)和BH05(19)的边最多,连接的靶点最多,意味着这2种活性成分在抑制子宫内膜炎中发挥主要作用,作用靶点中IL6、白细胞介素1β(IL1β)、Toll样受体4(TLR4)和瘦素(LEP)与抑制猪子宫内膜炎关联度最大。八角茴香在抑制子宫内膜炎缓解ZEA毒性时呈现多成分和多靶点的特征。
图7 八角活性成分-子宫内膜炎靶点-信号通路网络图

LEP:瘦素 leptin;ESR1:雌激素受体1 estrogen receptor 1;IL1α:白细胞介素1α interleukin 1α;TNF:肿瘤坏死因子 tumor necrosis factor;IL1β:白细胞介素1β interleukin 1β;IL6:白细胞介素6 interleukin 6;IL2:白细胞介素2 interleukin-2;TLR4:Toll样受体4 Toll-like receptor 4;IL13:白细胞介素13 interleukin 13;HMGB1:高迁移率族蛋白1 high mobility group box protein 1;LTF:乳转铁蛋白 lactotransferrin;CXCL8:基序趋化因子8 C-X-C motif chemokine ligand 8;IL17A:白细胞介素17A interleukin 17A;IL15:白细胞介素15 interleukin 15;GAL:甘丙肽 galanin peptides;CCL5:C-C基序趋化因子5 C-C motif chemokine 5;HP:结合珠蛋白 haptoglobin;SELE:E选择素 E selectin;NR5A1:类固醇生成因子1 steroidogenic factor 1;ESRβ:雌激素受体β estrogen receptor beta;FSHβ:促卵泡激素亚基β follitropin subunit beta;AMH:抗缪勒管激素 anti-muellerian-inhibiting factor;Graft-versus-host disease:移植物抗宿主病;Inflammatory bowel disease:炎症性肠病;Malaria:疟疾;Rheumatoid arthritis:类风湿性关节炎;Legionellosis:军团菌病;Pertussis:百日咳;IL17 signaling pathway:白细胞介素17信号通路;Chagas disease:美洲锥虫病;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并发症中的糖基化产物及其受体信号通路;Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor:病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用;Toll-like receptor signaling pathway:Toll样受体信号通路;TNF signaling pathway:肿瘤坏死因子信号通路;Amoebiasis:阿米巴原虫病;Cytokine-cytokine receptor interaction:细胞因子-细胞因子受体相互作用;Influenza A:甲型流感;Alcoholic liver disease:酒精性肝病;Yersinia infection:耶尔森氏菌感染;Non-alcoholic fatty liver disease:非酒精性脂肪性肝病;NOD-like receptor signaling pathway:NOD样受体信号通路;Lipid and atherosclerosis:脂质和动脉粥样硬化。

Fig.7 Star anise active ingredients-endometritis target-signaling pathway network diagram

2.7 分子对接验证结果

以网络分析图中degree排名前2名的活性成分槲皮素和木犀草素为配体,以4个关键靶点IL6、IL1β、TLR4和LEP所对应的猪的靶蛋白为受体分别进行分子对接,对接结果如表4和图8。如表4所示,槲皮素和木犀草素与IL6、IL1β、TLR4和LEP的结合自由能均小于-5.0 kcal/mol(1 kcal≈4.186 kJ),表示2种活性成分均可与4个关键靶点稳定结合,木犀草素与4个受体的结合自由能中有3个小于槲皮素与4个受体的结合自由能,所以木犀草素可能是八角茴香抑制猪子宫内膜炎缓解ZEA生殖毒性过程中起主要作用的成分。
表4 八角茴香活性成分与核心靶点分子对接的结果

Table 4 Results of docking of star anise active ingredients with core target molecules kcal/mol

项目
Items		 结合自由能Combined free energy
白细胞介素6 IL6 白细胞介素1β IL1β Toll样受体4 TLR4 瘦素LEP
槲皮素Quercetin -5.46 -6.67 -5.75 -6.53
木犀草素Luteolin -5.85 -6.12 -6.26 -6.92

1kcal≈4.186 kJ。

图8 槲皮素和木犀草素与核心靶点最佳构象分子对接模式图

IL6:白细胞介素6 interleukin 6;IL1β:白细胞介素1β interleukin 1β;TLR4:Toll样受体4 Toll-like receptor 4;LEP:瘦素 leptin;ARG:精氨酸 arginine;LEU:亮氨酸 leucine;GLY: 谷氨酸 glycine;ASP:天冬氨酸 aspartic acid;VAL:缬氨酸 valine;GLU:谷氨酸 glutamic acid;LYS:赖氨酸 lysine;THR:苏氨酸 threonine;GLN:谷氨酸酰胺 glutamine;ASN:天冬酰胺 asparagine。

Fig.8 Docking mode of optimal conformational molecules between quercetin and luteolin and core target

3 讨论

八角茴香是一种食药同源的草药[8],富含黄酮类物质,可以抗炎缓解ZEA引起的炎症反应。本研究中通过网络药理学技术筛选出的木犀草素、山柰酚、儿茶素和槲皮素等八角茴香活性成分均为黄酮类物质。活性成分获取靶点后建立PPI网络,筛选得到22个作用靶点并富集相关信号通路,这表明八角茴香缓解ZEA致猪子宫内膜炎是多成分、多靶点和多通路的作用机制。槲皮素广泛地存在于各种植物中,它具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化和抗病毒的生物学特性[16]。槲皮素主要通过抑制炎症因子和炎症酶来抑制炎症反应,它可以作用于脂多糖(LPS),抑制LPS诱导炎症因子表达发挥抗炎作用[17-18]。研究表明,槲皮素可以通过调节Nrf2信号通路,上调抗氧化基因减弱ZEA和LPS对IPEC-J2细胞损伤的联合毒性作用,保护肠道上皮屏障,从而减轻ZEA对机体造成其他组织的损伤[19]。木犀草素存在于多种植物中,具有抗炎、抗氧化以及美白的作用,它主要通过减少活性氧(ROS)和活性氮的产生抑制炎症细胞因子和细胞介质的表达来起到抗炎作用[20]。山柰酚存在于多种草药和蔬菜中,具有药理活性[21],山柰酚具有较高的药用价值可以治疗急性或者慢性炎症引起的疾病,具有抗炎和抗癌的作用[22]。研究表明,山奈可以通过调节PI3K/Akt介导的Nrf2通路缓解ZEA诱导的小鼠肝脏氧化应激以及细胞凋亡,上调相关通路并增加抗氧化酶血红素氧合酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶-1(NQO-1)的表达来起到保肝作用[23]。研究所筛选的八角茴香关键主要活性成分均具有抗炎作用,与前人研究结果一致,这表明八角茴香可以通过相关活性成分缓解ZEA所引起的猪子宫内膜炎症。ZEA对猪生殖系统的损伤不仅仅是通过炎症引发的,它还会通过ROS的积累诱导细胞氧化应激[24],有研究表明,ZEA会诱导活化铁的死亡以及氧化应激从而导致生殖毒性[25],这表明八角茴香可能通过抑制铁死亡或清除ROS发挥抗氧化作用缓解ZEA诱导的生殖毒性。
本研究所筛选出的关键靶点是IL6、IL1β、TLR4和LEP,这些靶点与炎症和非特异性免疫有着密切联系。IL6是由免疫细胞以及其他类型细胞产生的多效性细胞因子[26]。在子宫有炎症发生时IL6表达明显增加,炎症部位的单核细胞/巨噬细胞会产生急性时相反应蛋白调节因子包括IL6和IL8,而IL6是调节急性时相反应蛋白的主要因素[27]。雌激素通过与G蛋白耦联雌激素受体(GPER)蛋白结合激活了IL6/信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)炎症信号通路,继而对子宫内膜产生损伤,引起子宫内膜癌[28]。TLR4是参与非特异性免疫的重要蛋白分子,也是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁。研究表明,ZEA会影响肠道微生物群衍生代谢物的产生,例如增加LPS的产生[29],LPS与其受体TLR4结合激活TLR4-髓系分化初级反应基因88(MyD88)-NFκB炎症通路,从而对宿主肠道造成损伤[30],而史佳妮等[30]研究发现,盆宁煎剂治疗慢性子宫内膜炎可能是通过抑制TLR4-MyD88-NFκB炎性信号通路实现的,这表明TLR4参与的炎症信号通路可能会诱发子宫内膜炎,这与刘雨婷等[31]的研究结果一致,TLR4是机体固有免疫受体,诱发炎症反应与免疫反应,具有免疫调节作用,在多种疾病中发挥作用,可通过MyD88依赖性通路诱导炎症介质参与炎症反应。所以,八角茴香的活性成分可能通过阻断IL6和TLR4炎症信号通路缓解ZEA致猪子宫内膜炎。八角茴香具有抑制霉菌毒素的作用[32]同时又具有抗炎的作用,所以八角茴香活性成分可以有效地缓解ZEA毒性作用所引发的猪子宫内膜炎。
本研究中GO功能富集分析表明,八角茴香活性成分抑制ZEA致猪子宫内膜炎的作用是作用靶点通过免疫应答、炎症反应、适应性反应和参与炎症反应细胞因子的调控等途径完成。KEGG信号通路富集分析结果表明,细胞因子互作、炎症性肠病、IL17、TLR信号通路以及TNF信号通路是八角茴香发挥抗炎作用的重要通路。这与网络药理学技术所筛选的核心靶点IL6、IL1β、TLR4和LEP所具有的功能一致。有研究表明,八角茴香复方对LPS诱导急性肺炎模型有干预作用,具有抗菌、抗炎及免疫调节作用,可使肺炎模型大鼠BALF中的IL6、TNFα和IL1β表达下降[8]。这提示八角茴香活性成分有可能主要通过参与炎症因子相关信号通路调节炎症因子相关基因的表达发挥抗炎作用。
分子对接结果显示分子间结合自由能均小于-5.0 kcal/mol,这表示木犀草素和槲皮素均能与核心靶点稳定结合且结合力良好,表明了八角茴香的活性成分木犀草素与槲皮素通过作用于关键靶点IL6、IL1β、TLR4和LEP发挥抗炎作用,抑制ZEA致猪子宫内膜炎。研究表明,通过分子对接技术可以筛选化合物,应用于开发新型烟草甲趋避剂[33]。分子对接可以通过药物与受体的结合能力预测关键作用药物,从而开发相关药物或者饲料添加剂缓解或者治疗疾病。八角茴香食药同源具有抗炎抗菌等效果,但是对于八角茴香应用于动物抗炎以及缓解ZEA毒性的实例并未有过多报道,所以八角茴香缓解ZEA致猪子宫内膜炎的机制还有待深入研究。

4 结论

综上所述,八角茴香富含黄酮类成分槲皮素等,具有抗炎以及抗氧化作用,活性成分可以作用于关键靶点IL6、IL1β、TLR4和LEP,通过调节相关通路以及诱导免疫反应调节参与炎症反应的细胞因子基因表达和抗过氧化来缓解ZEA致猪子宫内膜炎以及其他生殖毒性,这为八角茴香缓解ZEA毒性作用机制的进一步研究提供了思路与方法。但是八角茴香作用有效剂量以及主要作用成分还需要进一步探究。

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